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Por definición, los cosméticos comprenden sustancias genéricas formuladas para ser aplicadas sobre la superficie externa del cuerpo humano, con el objetivo de modificar la apariencia, limpiar, perfumar, preservar, tratar o proteger la piel1,2. Los cosméticos son importantes vehículos de transmisión de patógenos ya que contienen abundante cantidad de agua y nutrientes que proporcionan buenos sustratos para la supervivencia de una gran variedad de microorganismos3. Los cosméticos no necesariamente tienen que ser estériles4 ,pero se debe garantizar la seguridad de los productos una vez vendidos a los consumidores5. Al utilizar conservantes, estos deberían estar libres de patógenos microbianos y si estos se encuentran presentes, el recuento debe estar en el margen permitido, según tipo de producto6,7.
Es importante resaltar ciertos factores que podrían influir en la seguridad de un cosmético, uno de ellos, la presencia de microorganismos bacterianos, ya sea introducido durante la fabricación o transferido al producto por parte del usuario tales como Salmonellas, Pseudomonas spp, Staphylococcus (aureus), Enterococcus spp, Escherichia (coli), Klebsiellas spp8,9. Asimismo, otros factores a tomar en cuenta son la materia prima como la calidad del agua, el clima del lugar, es decir, si es que hay humedad, existe menor probabilidad de que el producto se conserve de una manera adecuada10,11. Al ser parte de la vida cotidiana, los cosméticos pueden ser adquiridos de diversas fuentes, estos pueden ser productos de marcas reconocidas y/o costosas, como también producidos de manera artesanal.
Los emprendimientos de cosméticos artesanales ofrecen productos más accesibles en cuanto a costo y usan como materia prima insumos de origen natural, que son amigables con el medio ambiente12,13; características que permiten una amplia aceptación por el usuario14. Sin embargo, a diferencia de los cosméticos comerciales, que tienen comprobada su estabilidad microbiológica y durabilidad5, en los cosméticos de preparación artesanal, los procesos de elaboración pueden no cumplir con los requerimientos mínimos de seguridad y calidad15,16, lo que puede llevar a serios problemas de salud.
El uso de un cosmético formulado inadecuadamente o con niveles de microorganismos fuera de los aerobios establecidos (Recuento de microorganismos mesófilos aerobios totales. Límite máximo 5 x 102UFC/g ó mL) por el Sistema Único de Información Normativa Reglamento Técnico Andino sobre Especificaciones Técnicas Microbiológicas de Productos Cosméticos, Resolución 2120 de 201917, puede alterar la barrera cutánea y desarrollar dermatitis atópica con consecuente peligro de infección, que aumentará si se utiliza un cosmético con contaminación microbiana2,5,18. Asimismo, resaltar el control por medio de las normas ISO, entre estas ISO 17516:2014, la cual establece ≤ 1 x 103 UFC por g o mL, para bacterias mesófilas aerobias, y, ausencia de E. coli, P aeruginosa y S. aureus en 1 g ó 1 mL19. En consecuencia, el objetivo del presente estudio fue determinar la contaminación microbiana en cosméticos de producción artesanal expendidos en comercios de la ciudad de La Paz.
Material y métodos
Para poder llevar a cabo el ensayo, con el fin de detectar bacterias en presencia del producto, fue necesario realizar, la neutralización del mismo, en caso de que este tuviera, algún tipo de conservante, para ello se realizó la preparación de la muestra madre, (descrita más adelante), en este sentido, las muestras que fueron neutralizadas, fueron aquellas con registro sanitario, ya que en sus componentes estos contenían conservantes. A diferencia de los cosméticos de origen artesanal, que no detallan la presencia de algún conservante en su composición. Neutralizar el conservante durante un control de calidad no significa eliminar su función o hacerlo ineficaz, sino ajustar las condiciones del producto (especialmente el pH) para evaluar su verdadera eficacia y comportamiento dentro del cosmético, esto con el fin de evitar interferencias químicas y garantizar la eficacia del conservante11,20. Posteriormente, fueron sembradas en medios para el recuento de colonias y en medios de cultivos diferenciales para su caracterización macro y microscópica, y finalmente la determinación del microorganismo patógeno en caso de que la muestra lo haya requerido.
1. Preparación de la muestra madre
Se evaluaron diez cosméticos artesanales adquiridos en la ciudad de La Paz y cuatro con registro sanitario en AGEMED (Agencia Estatal de Medicamentos y Tecnologías en Salud). La inactivación de los conservantes en el caso de los cosméticos con registro sanitario se realizó con Tween 80 al 5%4,2,15,21,22.
2. Recuento de bacterias aerobias totales
A partir del cultivo previo, en caldo nutritivo, en diluciones de 10-2, 10-4, 10-6, se sembró inóculos de 100 μL de las diluciones en placas de agar nutritivo por extensión de superficies, para en recuento de UFC/mL de bacterias. Posteriormente, se dejó a incubación 37°C durante 24 horas. Posteriormente, se realizó la caracterización macroscópica y microscópica de las colonias16,22.
3. Determinación de microorganismos específicos
Aquellas placas con agar nutritivo que presentaron crecimiento bacteriano de UFC/mL por encima del límite máximo permitido 5x103 UFC/mL17. De las mismas placas fueron aisladas colonias, con diferentes características macroscópicas (forma, color, borde, tamaño), para ser sembradas en agar sangre, con el fin de cultivar y estudiar las características hemolíticas de aquellas bacterias presuntamente patógenas, en caso de que lo fueran. Asimismo, estas placas fueron incubadas por 24 horas a 37oC, posterior a ello se realizó la descripción macroscópica y microscópica de las colonias obtenidas en este medio.
Considerando los resultados obtenidos tanto a nivel macroscópica (hemolisis, forma, tamaño, borde, color de las colonias) como microscópicas (tinción de gram) en las placas de agar sangre, se realizó la identificación de las bacterias, potencialmente patológicas; los medios de cultivo empleados, fueron de carácter diferenciales y selectivos, como también, empleo de pruebas bioquímicas.
Los medios de cultivos y pruebas bioquímicas, empleadas, tomando en cuenta los microorganismos potencialmente presentes en los cosméticos19:
P aeruginosa: catalasa, oxidasa TSI (pruebas bioquímicas), agar Müller Hinton (medio de cultivo)23.
Staphylococcus aureus: agar Manitol salado (medio de cultivo), catalasa, coagulasa (pruebas bioquímicas)23.
Escherichia coli: Catalasa, TSI, SIM, LIA, Citrato, Ureasa (pruebas bioquímicas), Agar MacConkey (medio de cultivo)23.
Enterococcus: agar bilis esculina (medio de cultivo)23.
Resultados
Recuento de bacterias totales
Tres de diez de los cosméticos artesanales evaluados (agua micelar, crema de naranja y crema de rosas), presentaron crecimiento por encima de los límites permitidos. Los resultados del recuento de UFC/mL se observan en la tabla 1 y figura 1. Posteriormente se realizó un cultivo de las bacterias, de los tres cosméticos ya mencionados, fueron sembrados en agar sangre y nutritivo, con incubación por 24 horas, para poder llevar a cabo la caracterización macroscópica (CMa) (Figura 1) y la caracterización microscópica (CMi) (Figura 2) de los cosméticos que mostraron desarrollo microbiano.
En la tabla 1, se observa los resultados obtenidos, de las muestras, para el recuento de Unidades formadoras de colonias en agar nutritivo, como también la caracterización de las colonias tanto en agar nutritivo, como en agar sangre. L a caracterización microscópica también fue llevada a cabo en los medios de cultivo mencionados respectivamente.
Los resultados de UFC/mL de los cosméticos que presentaron crecimiento de por encima de los valores permitidos 5x103 UFC/mL17. Aislamiento de colonias en agar sangre, para posterior caracterización macroscópica y microscópica.: (a) agua micelar, (b) crema de naranja (c), crema de rosas.
Fuente: elaborado por Jhon Nina
Figura 1. Recuento de UFC/mL y aislamiento de colonias en agar sangre.
Tabla 1. Recuento de bacterias aerobias totales en UFC/mL y caracterización macroscópica (CMa) y microscópica (CMi) en un primer y segundo ensayo.
Leyenda: Sin desarrollo (SD)
Fuente: elaborado por Yesenia Angola y Silvia Zambrana.
Para la caracterización microscópica de las colonias desarrolladas en agar sangre, se realizó la tinción Gram, observando la presencia de cocos Gram positivos en los cosméticos de agua micelar y crema de naranja; el cosmético crema de rosas presentó bacilos Gram negativos (Figura 2).
Fuente: elaborado por Jhon Nina
(a) Agua micelar, (b) Crema de naranja y (c) Crema de rosas.
Figura 2. Caracterización microscópica por tinción Gram de las colonias desarrolladas en agar sangre
Agua micelar, cocos Gram positivos, (b) Crema de naranja, cocos Gram positivos, (c) Crema de rosas Bacilos Gram negativos. Las imágenes corresponden a un aumento de 100X.
Tomando en cuenta que se observaron cocos Gram positivos en las muestras de agua micelar y crema de naranja se procedió a sembrar en los medios de agar manitol salado, bilis esculina para diferenciar si se trata de S. aureus o Enterococcus spp, los resultados se pueden observar en la Figura 3.
(a) crema de rosas sembrada en Agar MacConkey. (b) Crema de rosas en Agar Müller Hinton. (c) Agua micelar y crema de naranja sembrada en Agar Müller Hinton.
Figura 3. Identificación en agar manitol y agar bilis esculina, por duplicado.
En las placas de agar manitol, se evidencia la ausencia de Staphylococcus aureus en los cosméticos de agua micelar y crema de naranja, ya que no se observa el cambio del pH en el medio, debido a la fermentación del manitol, produciendo el característico color amarillo. Sin embargo, en la crema de rosas, si se puede observar, la fermentación de este medio y por el cambio de pH, virando el medio a color amarillo, por consiguiente, la presencia de Staphylococcus aureus en este cosmético.
En los medios de agar bilis esculina, en el cosmético de agua micelar y crema de naranja se observa que este medio se encuentra con el color característico negro-café para determinar la hidrolisis de esculina en presencia de bilis, por lo que se confirmó positivo en cuanto a crecimiento para Enterococcus spp. El cosmético de crema de rosas, se puede apreciar la ausencia de la bacteria y mencionada, ya que no se observa en el medio de cultivo, el característico color negro- café.
El cosmético crema de rosas, al observarse bacilos Gram negativos se procedió a sembrar en agar MacConkey y Müller Hinton, los resultados se observan en la Figura 4. La siembra en agar MacConkey mostró presencia de bacilos Gram negativos, como también la fermentación del mismo medio, por lo que se presume que se trata de E. coli; dato que fue posteriormente confirmado por medio de las pruebas bioquímicas (Figura 4, a).
La siembra en agar Müller Hinton, no fue por estría de agotamiento, debido a que este medio nos permite el diagnostico de P. aeruginosa por la producción característica del pigmento, por lo que evidentemente en todas las muestras se descarta la presencia de este microorganismo (Figura 4, b y c).
Fuente: elaborado por: Yesenia Angola
Figura 4. Siembra de muestras en agar MacConkey y Müller Hinton.
Los cosméticos artesanales que presentaron desarrollo bacteriano, por encima de los límites permisibles (agua micelar, crema de naranja y agua de rosas), fueron sembrados en medios de cultivo de característica diferenciales y selectivos para identificar el tipo de bacteria presente.
La descripción de los resultados en los medios selectivos y diferenciales usados se observan en la Tabla 2. La crema de rosas desarrollo positivo en agar MacConkey, por lo que al sospecharse de Escherichia coli, se procedió al sembrado en pruebas bioquímicas. Se descarta la presencia Pseudomonas spp para los tres cosméticos, por la ausencia del pigmento característico de este microorganismo en el medio de cultivo de Müller Hinton.
Tabla 2. Diferenciación de cepas obtenidas en los ensayos 1 y 2, en medios de cultivo selectivos.
Fuente: elaborado por Yesenia Angola
Para identificar la enterobacteria presente en la crema de rosas se realizó por pruebas bioquímicas, confirmando que se trata Escherichia coli (Tabla 3).
Discusión
En el presente estudio se realizó un estudio preliminar del control microbiológico de catorce cosméticos de preparación artesanal, siendo todos los cosméticos nuevos al momento de su evaluación. Tres de los cosméticos evaluados presentaron contaminación bacteriana; las preparaciones de agua micelar y crema de naranja presentaron crecimiento bacteriano de Enterococos spp, mientras que la crema de rosas presentó contaminación por E. coli. Los tres cosméticos superaron los niveles permitidos para el recuento total de microorganismos aerobios establecidos por el Sistema Único de Información Normativa Reglamento Técnico Andino sobre Especificaciones Técnicas Microbiológicas de Productos Cosméticos, Resolución 2120 de 201917, y el Mercado Común del Sur Mercosur24. En Bolivia debido al crecimiento de emprendimientos dirigidos a la elaboración de productos de origen natural, entre ellos cosméticos, se manifiesta más la preocupación, a causa de la contaminación biológica2. Los cosméticos artesanales evaluados en este estudio, no presentan detalles de su composición y tampoco la fecha de expiración del producto, mucho menos el periodo de conservación del producto una vez abierto. Esta información es imprescindible para el usuario ya que los conservantes utilizados en los cosméticos pueden degradarse con el tiempo16. Además, por su composición, compuestos orgánicos e inorgánicos y minerales esenciales, los cosméticos predisponen el desarrollo de microorganismos2.
Un estudio realizado en Ecuador determinó que el género bacteriano aislado con más frecuencia de productos de uso tópico, fueron microorganismos del género Bacillus spp, debido a su presencia en los ambientes de producción y en la materia prima. Asimismo, la presencia de bacterias del género Klebsiella spp y Enterobacter spp, apoya el hecho de un tratamiento inadecuado de la materia prima. Del mismo modo la identificación de bacterias de origen intestinal y ambiental, sugiere un deficiente control microbiológico en su elaboración25. Un estudio realizado para demostrar la contaminación microbiana de productos herbales medicinales demostró la presencia de E. coli, Salmonella spp, Shigella spp, S. aureus, sobrepasando los límites permisibles26.
En nuestro estudio dos de los cosméticos de preparación artesanal, agua micelar y crema de naranja, presentaron microorganismos del género Enterococcus spp. Las muestras sembradas en el medio diferencial y selectivo bilis esculina, en el medio la esculina reacciona con el citrato férrico y la colonia se apreciará de color marrón oscuro o negra, confirmando la presencia de Enterococcus, los cuales se encuentran en el tracto gastrointestinal de humanos y animales, este puede ser empleado como un índice de buena higiene y saneamiento. La presencia de Enterococcus por encima de los valores permitidos indica un inadecuado monitoreo ambiental (Compact Dry ETC; Microkit: Medios de Cultivo) o contaminación del agua usada en ambas preparaciones27. Para la crema de rosas se identificó la presencia de E. coli, con crecimiento en agar MacConkey, el cual es un medio selectivo que permite el crecimiento de bacilos Gram negativos, a su vez diferencial, porque permite que a su vez se desarrollen fermentadores de lactosa28. Para confirmar si efectivamente se trataba de Escherichia coli, se realizaron pruebas bioquímicas29. La presencia de Escherichia coli que puede deberse a contaminación de aguas y a el proceso mismo de manufactura, la detección de este microorganismo es un alto indicador de contaminación fecal16.
Es importante indicar que el fabricante de cosméticos artesanales debe tomar medidas para evitar la contaminación microbiana, para expender productos con calidad y seguridad para el consumidor. Desafortunadamente, estos criterios no son cumplidos de manera estricta por desconocimiento de la norma o por inadecuados ambientes de producción16. La comercialización de cosméticos con contaminación microbiana, superando los niveles permitidos2, como ocurrió con tres de los cosméticos artesanales evaluados puede suponer un peligro para la salud.
Este estudio se limitó a un control microbiológico preliminar, sin embargo, en otros estudios ya mencionados se pudo aislar una variedad de microorganismos como mohos y levaduras, empleando otro tipo técnicas19, por lo que se recomienda profundizar este tipo de estudios en Bolivia, para descartar la presencia de otro tipo de microorganismos potencialmente patógenos, empleando técnicas microbiológicas convencionales, así como técnicas moleculares para más especificidad30.
Conclusiones
En conclusión, este estudio preliminar mostró que tres tipos de preparaciones artesanales de diez cosméticos artesanales evaluados presentaron desarrollo microbiológico por encima de valores permitidos siendo las especies microbianas aisladas bacterias del género Enterococcus spp y Escherichia spp. Los cuales podrían ser una problemática latente que puede tener consecuencias serias en la salud los usuarios. Asimismo, que la normativa de AGEMED, no está muy bien enfocada en cuanto al uso de cosméticos de manera general.
Recomendaciones
En base al presente estudio, se incentiva a seguir con el mismo haciendo enfoque a otras marcas de cosméticos de origen artesanal, para hacer el seguimiento de control de calidad de estos, aplicar un enfoque bacteriológico de otras cepas no descritas en el presente trabajo, y de microorganismos fúngicos de carácter patógenos. Con el fin de descartar o confirmar la presencia o ausencia de estos.
