Introducción

En Bolivia, los avances más relevantes en biotecnología vegetal fueron orientadas principalmente a la propagación masiva de especies agrícolas de interés económico¹; sin embargo, aún existe limitada investigación sobre la propagación y conservación de especies nativas con potencial ecológico y capacidad fitorremediadora². Entre estas especies destaca Schoenoplectus californicus (totora), una macrófita acuática ampliamente distribuida en la zona circunlacustre del lago Titicaca, con adaptación y crecimiento en ambientes húmedos y suelos fangosos.

La totora cumple un papel ecológico fundamental en los ecosistemas lacustres altoandinos, al intervenir en la regulación hídrica, la protección de hábitats acuáticos y el reciclaje de nutrientes. No obstante, el lago Titicaca ha sufrido una progresiva degradación ambiental, asociada tanto a factores antrópicos como naturales, entre ellos la contaminación de afluentes, acumulación de metales pesados, deterioro de la calidad del agua, pérdida de biodiversidad y alteraciones en los ecosistemas acuáticos³. A ello se suman los efectos del cambio climático, que modifican las condiciones ambientales y afectan la distribución de las macrófitas acuáticas.

En este contexto, S. californicus fue identificada como una especie con alto potencial fitorremediador, gracias a su capacidad para absorber y remover contaminantes presentes en cuerpos de agua. Investigaciones han reportado su eficiencia en la captación de metales pesados y en la reducción de compuestos como nitrógeno, fósforo y bacterias coliformes^4-6. Asimismo, se ha destacado su capacidad de captura de dióxido de carbono, lo que refuerza su importancia ecológica en programas de restauración ambiental.

Sin embargo, la propagación sexual de esta especie presenta limitaciones relacionadas con el bajo porcentaje de germinación, la presencia de latencia y el probable origen híbrido de algunas poblaciones, factores que reducen la viabilidad de las semillas y dificultan la obtención de material vegetal uniforme^7-10. Además, la reproducción sexual genera elevada variabilidad genética, mientras que la propagación vegetativa permite conservar características de interés ecológico y fisiológico^11,12.

Ante esta problemática, el cultivo de tejidos vegetales constituye una alternativa biotecnológica eficiente para la propagación y conservación de S. californicus. El establecimiento in vitro permite obtener material vegetal genéticamente homogéneo bajo condiciones controladas, además de ser una herramienta útil para futuras investigaciones en micropropagación, conservación y procesos de fitorremediación¹³.

Por lo tanto, el objetivo de la presente investigación fue establecer in vitro la especie fitorremediadora S. californicus a partir de cormos meristemáticos, con el fin de disponer de material vegetal apto para la fase de micropropagación.

Materiales y métodos

Material vegetal. La recolección del material vegetal se realizó en abril de 2023 en el puerto de Guaqui, provincia Ingavi del departamento de La Paz, Bolivia, ubicado a orillas del lago Titicaca a 3811 m.s.n.m. Se seleccionaron plantas con brotes en crecimiento activo y características morfológicas. Posteriormente, se recolectaron 600 brotes vegetativos destinados al establecimiento in vitro.

Desinfección de explantes. Los explantes fueron lavados con agua corriente para eliminar restos de sedimento y materia orgánica. Posteriormente fueron sometidos inicialmente a una inmersión en alcohol al 70 % durante 1 min. La desinfección se realizó mediante tratamientos con hipoclorito de sodio a concentraciones de 2, 3 y 4 % durante tiempos de inmersión de 5, 10 y 15 min, adaptando protocolos previamente utilizados en cultivo in vitro de especies vegetales¹⁴.

Figura 1 Recolección del material vegetal en el puerto de Guaqui del Municipio de Guaqui en el departamento de La Paz 

Después de la desinfección, los explantes fueron enjuagados tres veces con agua destilada estéril en condiciones asépticas.

Medio de cultivo. Se utilizó el medio basal Murashige & Skoog (MS)¹⁵ suplementado con 30 g L^-1 de sacarosa, 0.1 g L^-1 de mioinositol y reguladores de crecimiento BAP e IBA según el tratamiento correspondiente. El pH fue ajustado a 5.7 mediante NaOH 1N.

Se evaluaron concentraciones de agar de 1, 3 y 5 g L^-1 como agente gelificante. Posteriormente, el medio fue distribuido en tubos de ensayo y esterilizado en autoclave a 121 °C durante 15 min.

Establecimiento in vitro. Los meristemos fueron disectados y establecidos en los diferentes medios de cultivo bajo condiciones asépticas. Los explantes se incubaron a temperatura de 25 ± 1° C, humedad relativa del 70-80 % y con un fotoperiodo de 14 h.

Figura 2 Establecimiento in vitro. A: Establecimiento de la totora; B: Meristemo en el medio de cultivo con 3 gramos de agar 

Figura 3 Croquis del diseño experimental 

Evaluación. A los 20 días después de la siembra se evaluaron 60 explantes por cada tratamiento. Las variables analizadas fueron; porcentaje de contaminación, oxidación y sobrevivencia (explantes que lograron establecerse y no se contaminaron ni se oxidaron).

Tratamientos, diseño experimental y análisis estadístico. En la fase de desinfección se evaluaron 9 tratamientos mediante un diseño completamente al azar con arreglo bifactorial, (para determinar la influencia de las distintas concentraciones de hipoclorito de sodio y tiempo de inmersión sobre el establecimiento in vitro de explantes de S. californicus) considerando como factor A la concentración de hipoclorito de sodio y el factor B el tiempo de inmersión.

Para la fase de establecimiento se evaluaron 6 tratamientos bajo un diseño completamente al azar con arreglo bifactorial, (para evaluar el efecto del agar en las vitroplantas) considerando como factor A el tipo de medio de cultivo y factor B la concentración de agar. Cada tratamiento conto con tres repeticiones.

Los datos fueron analizados mediante análisis de varianza (ANOVA) utilizando el programa InfoStat. Asimismo, las diferencias significativas entre tratamientos se determinaron mediante la prueba de comparación múltiple de Duncan.

Resultados

Resultados de la desinfección de los cormos meristemáticos. El ANOVA no evidenció diferencias significativas entre tratamientos para la variable porcentaje de contaminación (p > 0.05). Sin embargo, se observaron variaciones en el comportamiento de los explantes durante la fase de establecimiento in vitro.

La Figura 4 muestra los porcentajes de contaminación y oxidación registrados en los diferentes tratamientos evaluados. El tratamiento 6 presentó el menor porcentaje de contaminación (43 %), mientras que el tratamiento 8 registró el menor porcentaje de oxidación (13 %).

Figura 4 Porcentaje de contaminación y oxidación por tratamiento 

En general, los tratamientos con mayores concentraciones de hipoclorito de sodio y mayores tiempos de inmersión tendieron a reducir los niveles de contaminación; sin embargo, algunos tratamientos incrementaron la oxidación de los tejidos meristemáticos.

La prueba de comparación múltiple de Duncan manifestó diferencias significativas para la variable oxidación, observándose mayores porcentajes en los tratamientos con hipoclorito de sodio al 3 % y tiempos de inmersión prolongados.

Durante la fase de establecimiento, los explantes presentaron cambios morfológicos caracterizados por crecimiento inicial y variaciones en la coloración de los tejidos, observándose diferentes niveles de adaptación in vitro según el tratamiento aplicado.

Resultados del efecto del agar en el establecimiento in vitro. La Figura 5, el porcentaje de sobrevivencia de los meristemos en los diferentes tratamientos evaluados. Los tratamientos con 1 g de agar presentaron los mayores porcentajes de sobrevivencia, mientras que las concentraciones elevadas de agar registraron menores valores.

Figura 5 Sobrevivencia en los diferentes tratamientos 

El análisis de varianza evidenció diferencias altamente significativas entre las concentraciones de agar para la variable sobrevivencia (p < 0.01). Los tratamientos con menor concentración de agar presentaron mayores porcentajes de sobrevivencia en comparación con los medios con mayores niveles de gelificación.

Figura 6 Crecimiento de la totora. A: Crecimiento en medio de cultivo con 1 g de agar; B: Crecimiento en medio de cultivo con 3 g de agar; C: Crecimiento en medio de cultivo con 5 g de agar 

La prueba de Duncan indicó que el tratamiento con 1 g L^-1 de agar alcanzó el mayor promedio de sobrevivencia (34.06 %), diferenciándose estadísticamente de los tratamientos con 3 y 5 g L^-1 de agar.

Asimismo, se observó que las concentraciones elevadas de agar redujeron el crecimiento y viabilidad de los explantes durante la fase inicial del establecimiento in vitro.

En términos generales, los medios con menor concentración de agente gelificante favorecieron el establecimiento de los meristemos y permitieron una mayor sobrevivencia de las vitroplantas.

Discusión

Los resultados obtenidos en el presente estudio evidenciaron que el establecimiento in vitro de S. californicus estuvo condicionado principalmente por dos factores: la eficacia del proceso de desinfección y la concentración del agente gelificante utilizado en el medio de cultivo. Ambos factores influyeron directamente en la viabilidad, sobrevivencia y respuesta fisiológica de los meristemos durante las primeras etapas del cultivo.

Durante la fase de desinfección se observaron diferencias en los niveles de contaminación, oxidación y sobrevivencia de los explantes. Aunque concentraciones elevadas de hipoclorito de sodio contribuyeron a disminuir parcialmente la contaminación microbiana, también incrementaron el daño oxidativo en los tejidos meristemáticos. Este comportamiento sugiere que existe un equilibrio crítico entre la eficiencia del desinfectante y la conservación de la viabilidad celular durante el establecimiento in vitro.

La oxidación observada probablemente estuvo asociada a la liberación de compuestos fenólicos ocasionada por el daño celular durante la manipulación y desinfección de los explantes. Este fenómeno representa una de las principales limitantes en cultivo de tejidos vegetales, debido a que la acumulación de compuestos oxidados afecta la capacidad regenerativa y sobrevivencia de los tejidos cultivados in vitro.

Asimismo, la sensibilidad de los meristemos frente a los agentes desinfectantes puede variar según el estado fisiológico del explante y las características propias de cada especie vegetal. Una vez superada la fase inicial de desinfección, la respuesta de los meristemos estuvo influenciada significativamente por las condiciones físicas del medio de cultivo, particularmente por la concentración de agar. Los tratamientos con menores concentraciones de gelificante presentaron mayores porcentajes de sobrevivencia, lo que indica que la disponibilidad hídrica del medio constituye un factor determinante para el establecimiento in vitro de S. californicus.

El agar cumple una función fundamental en cultivo de tejidos vegetales, ya que proporciona soporte físico a los explantes y regula la disponibilidad de agua y nutrientes en el medio de cultivo^15,16. Debergh¹⁷ y Nery et al.¹⁸ señalaron que las propiedades fisicoquímicas del agente gelificante modifican el potencial hídrico y la movilidad de solutos, afectando directamente el crecimiento y desarrollo de los tejidos cultivados in vitro. De manera similar, Ghashghaie et al.¹⁹ reportaron que concentraciones elevadas de agar reducen la disponibilidad de agua para los explantes, limitando su crecimiento y viabilidad.

Los resultados obtenidos coinciden con dichos reportes, ya que los tratamientos con mayores concentraciones de agar presentaron mayores índices de mortalidad. Esta respuesta podría estar relacionada con una menor absorción de agua, nutrientes y reguladores de crecimiento por parte de los tejidos meristemáticos en medios más sólidos. En contraste, diversos autores indicaron que medios líquidos o con bajas concentraciones de agar favorecen la absorción de nutrientes, la disponibilidad de citoquininas y la aireación del sistema, promoviendo un mejor desarrollo de los explantes cultivadas in vitro^20-22. Estas condiciones podrían explicar el mejor desempeño observado en los tratamientos con menor concentración de agar durante la etapa de establecimiento.

Sin embargo, aunque las bajas concentraciones de agar favorecieron la sobrevivencia inicial de los meristemos, durante la fase de multiplicación se observó un incremento en los síntomas de hiperhidratación y mortalidad. Este fenómeno, también denominado vitrificación, constituye una alteración fisiológica frecuente en cultivo de tejidos vegetales y se encuentra asociado con un exceso de agua disponible en los tejidos cultivados in vitro²³.

La hiperhidratación afecta negativamente la anatomía y fisiología de las vitroplantas, provocando alteraciones como reducción de la cutícula, desorganización de cloroplastos y disminución de la eficiencia fotosintética^24,25. Asimismo, Hazarika²⁶ señaló que este trastorno compromete significativamente la calidad y capacidad de aclimatación de las vitroplantas debido a alteraciones estructurales y fisiológicas de los tejidos. Entre los principales factores asociados a este fenómeno se encuentran bajas concentraciones de agar y potenciales osmóticos inadecuados^26,27.

Los resultados del presente estudio sugieren que, aunque los medios menos gelificados favorecen el establecimiento inicial de S. californicus, es necesario ajustar progresivamente la concentración del agente gelificante conforme avanzan las etapas del cultivo in vitro, con el fin de reducir alteraciones fisiológicas y mejorar la calidad del material propagado. Resultados similares fueron reportados por Ebrahim²⁸ en Zantedeschia aethiopica y por Muthukrishnan et al.²⁹ y Suthar et al.³⁰ en Ceropegia thwaitesii y Boswellia serrata, respectivamente, la respuesta de los explantes estuvo estrechamente relacionada con la consistencia física del medio de cultivo.

En conjunto, los resultados obtenidos indican que tanto el protocolo de desinfección como la concentración de agar constituyen factores críticos durante el establecimiento in vitro de S. californicus. La respuesta observada podría estar relacionada con la naturaleza acuática de la especie, la cual presenta mayor sensibilidad frente a variaciones en la disponibilidad hídrica del medio. Estos hallazgos representan una base importante para futuras investigaciones orientadas a la optimización de protocolos de micropropagación, conservación y aplicaciones de fitorremediación en especies acuáticas de importancia ecológica.

Finalmente, la utilización de alcohol al 70 % durante 1 min, seguido de hipoclorito de sodio al 3 % durante 15 min, permitió el establecimiento in vitro de explantes meristemáticos de S. californicus con bajos niveles de contaminación, constituyendo el tratamiento más eficiente para el establecimiento in vitro de los explantes. Asimismo, se señaló que la concentración del agente gelificante influyó significativamente sobre la sobrevivencia de los meristemos, obteniéndose el mayor porcentaje de sobrevivencia (34.06 %) en el medio de cultivo suplementado con 1 g L^-1 de agar. Estos resultados permitieron establecer las condiciones más favorables para el establecimiento in vitro de S. californicus, cumpliéndose el objetivo planteado en la investigación y proporcionando una base para futuros estudios de micropropagación, conservación y fitorremediación de la especie.