Patrones diferenciales entre Leishmaniasis y chagas, empleando epimastigotes de Trypanosoma cruzi
Differential patterns between leishmaniasis and chagas disease using Trypanosoma cruzi epimastigotes
N. Marisol Córdova R.1, Jhoana Zurita T.2, Miguel Guzmán-R.1, Aleida Verduguez-O.1, Ernesto Rojas C.1
Aceptado el 01 de octubre de 2020.
Resumen
En diferentes regiones de Latinoamérica la infección por T. cruzi y Leishmania se superponen, por lo cual se reportan infecciones mixtas circulantes, debido a esto; deben realizarse pruebas diagnósticas específicas para evitar reacciones cruzadas entre estas dos patologías.
Objetivo: determinar patrones de fluorescencia que permitan la diferenciación entre Leishmaniasis, enfermedad de Chagas e infección mixta empleando epimastigotes de T. cruzi.
Métodos: se empleó la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta utilizando epimastigotes de T. cruzi (TcV autóctono) como antígeno figurado frente a un panel de muestras de suero codificados como A, B, C y D correspondientes a pacientes con infección por: Leishmaniasis (A), Infección mixta por Leishmania y Chagas(B), Enfermedad de Chagas (C) y sin ninguna de las dos infecciones (D).
Resultados: en los cuatro paneles de muestras se observaron diferentes patrones de intensidad de fluorescencia a nivel de membrana y núcleo de los epimastigotes de T. cruzi (TcV autóctono).
Conclusiones: la técnica de Inmunofluorescencia (IFI) con antígenos de epimastigotes de T. cruzi a demostrado utilidad en la diferenciación entre enfermedad de Chagas, Leishmaniasis y/o infecciones mixtas por ambos parásitos en aquellas zonas donde la coexistencia de ambas es habitual
Palabras clave: leishmaniasis, chagas, Trypanosoma cruzi, epimastigotes, Técnica del Anticuerpo Fluorescente Indirecta.
Abstract
Objective: to determine fluorescence patterns that allow the differentiation between Leishmaniasis, Chagas disease and mixed infection using T. cruzi epimastigotes.
Methods: the Indirect Immunofluorescence technique was used using epimastigotes of T. cruzi (autochthonous TcV) as figurative antigen against a panel of serum samples coded as A, B, C and D corresponding to patients with infection by: Leishmaniasis (A) , Mixed infection by
Leishmania and Chagas (B), Chagas disease (C) and without either of the two infections (D).
Results: in the four sample panels, different patterns of fluorescence intensity were observed at the membrane and nucleus level of the epimastigotes of T. cruzi (autochthonous TcV).
Conclusions: the Immunofluorescence technique (IFI) with T. cruzi epimastigote antigens has proven useful in differentiating between Chagas disease, Leishmaniasis and / or mixed infections by both parasites in areas where the coexistence of both is common.
Keywords: leishmaniasis, chagas, Trypanosoma cruzi, epimastigotes, Fluorescent Antibody Technique Indirect.
La enfermedad de Chagas, también llamada Tripanosomiasis Americana, es una enfermedad causada por el parásito protozoo Trypanosoma cruzi1. La Organización Mundial de la Salud (OMS), estima que existe entre 6 y 7 millones de personas infectadas por Trypanosoma cruzi causante de la enfermedad de Chagas, en 21 países del continente americano; por lo que aproximadamente el 13% de la población Latinoamericana, estaría en riesgo de contraer la enfermedad2. Bolivia, dentro este contexto sufre una de las tasas de infección más altas de casos de enfermedad de Chagas con una seroprevalencia superior al 50%3. Esta enfermedad, estaba establecida casi exclusivamente en áreas rurales. Actualmente las migraciones poblacionales, no solo desde zonas rurales sino también los movimientos poblacionales a través de los diferentes continentes, hacen que sobrevenga un cambio en el perfil epidemiológico de la enfermedad de Chagas4-6.
La Organización Mundial de la Salud respecto a la Leishmaniasis indica, que hay cerca de 1 500 000 personas afectadas por las diversas formas de Leishmaniasis en todo el mundo. Se considera que, alrededor de 350 millones de personas están en riesgo de infectarse y enfermarse cada año7-9. En Bolivia la Leishmaniasis es menos frecuente que la enfermedad de Chagas, sin embargo, esta enfermedad afecta a personas en cinco de los nueve departamentos que tiene Bolivia10.
Usualmente, para el diagnóstico serológico de la Leishmaniasis y la enfermedad de Chagas, se empleaba la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). Técnica de costo relativamente bajo debido a que el sustrato antigénico puede ser preparado en cualquier laboratorio de mediana complejidad16, además, dicha técnica es de muy buena sensibilidad y especificidad diagnóstica, especialmente para la enfermedad de Chagas17. Sin embargo, actualmente el empleo de esta técnica serológica para el diagnóstico de la Leishmaniasis queda en duda, ya que expertos no recomiendan el uso de del IFI cuando la enfermedad de Chagas y Leishmaniasis coexisten15,18, especialmente en las regiones tropicales y subtropicales por las posibles reacciones cruzadas entre ambas patologías a títulos bajos, debido a que los agentes etiológicos de estas dos enfermedades poseen una ascendencia común muy cercana19,20, por lo tanto, es de esperar que compartan una significativa cantidad de características antigénicas. Por ello, pacientes con alguna de las dos infecciones o con infección mixta pueden resultar mal diagnosticadas, debido a reacciones serológicas cruzadas cuando se usan mezclas de antígenos no caracterizados21,22.
Ante la necesidad de diferenciar entre estas dos patologías en una región tropical del departamento de Cochabamba, donde cohabitan ambas patologías, debido a los flujos migratorios poblacionales durante los últimos años, desde zonas endémicas para Chagas a regiones tropicales endémicas para Leishmaniasis, se realiza este estudio descriptivo, con el fin de determinar el diagnóstico diferencial de la Leishmaniasis, enfermedad de Chagas e Infección mixta empleando epimastigotes de T. cruzi (TcV autóctono ) siguiendo la técnica de Luis Vásquez Huerta y col.16.
Se estudiaron 97 muestras de sueros sanguíneos pertenecientes a personas con ausencia de infección por Chagas y/o Leishmaniasis y personas infectadas por T. cruzi y Leishmania spp, dispuestos de la siguiente manera: Muestras de suero de pacientes con Infección por Leishmania spp (n=23), Muestras de suero de pacientes con Infección mixta por Leishmania spp y T. cruzi (n=11), Muestras con Infección por T. cruzi (n= 30) y Muestras de suero de pacientes sin evidencias de ambas infecciones (n= 33). Dichos paneles, fueron preparados a partir de muestras recolectadas en el laboratorio de inmunología del servicio LABIMED y el laboratorio del hospital San Francisco de Asís del municipio de Villa Tunari.
Los paneles de sueros fueron organizados en cuatro grupos (A, B, C, D), resumidas en la tabla 1, haciendo un total de 97 muestras obtenidas.
Procedimientos analíticos:
a. Obtención de epimastigotes de T. cruzi
]]> Los parásitos de Trypanosoma cruzi (TcV) en su forma de epimastigotes fueron donados por la Dra. MC Torrico, los cuales fueron obtenidos a partir de cultivos en el laboratorio de Parasitología del servicio LABIMED, Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Simón.
b. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)
Para la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), se empleó un control positivo y control negativo. Como antígeno se utilizó epimastigotes de Trypanosomas obtenidos de cultivos (Donación), los cuales fueron fijados en láminas y conservados en el congelador. Sobre éstas láminas, se realizó la reacción antígeno-anticuerpo.
En una placa de microtitulación se realizó las diluciones 1/16, 1/32 y 1/64 de cada suero a evaluar y de los controles. Estos una vez homogenizados se dispensaron en el área del círculo correspondiente a la lámina. Una vez incubada la placa, realizado el lavado con PBS-Tween y posterior secado, se agregó 15 uL del conjugado Anti IgG humano marcado con fluoresceína (Biomerieux), se incubó por 30 minutos, se volvió a lavar las láminas y se las dejó secar para realizar las lecturas.
c. Observación por microscopia de inmunofluorescencia
]]> Durante la observación de las muestras, se puso énfasis en la intensidad, presencia y ausencia de fluorescencia en la superficie y núcleo de los epimastigotes.
Las lecturas se registraron como: Positivo para Chagas(+). Cuando la superficie o los bordes de los parásitos fluorescieron de un color verde manzana intenso. Positivo para Leishmania. Se registró, cuando el núcleo de los parásitos fluorescieron de un color verde manzana intenso, de acuerdo con la ref16.
Mixto Cuando la superficie y el núcleo fluorescieron de color verde intenso y Negativo (-) Si los parásitos se observan opacos y oscuros Indeterminado (I) Si se observa una débil fluorescencia no homogénea ya sea en la superficie o núcleo de los parásitos.
d. Técnica de HAI para Chagas
Análisis estadísticoPara la Hemaglutinación Indirecta se empleó el kit HAI Chagas Polychaco que emplea glóbulos rojos de carnero. La dilución con la que se inició el procedimiento fue 1/8, para lo cual en una placa de microtitulación, se colocó a los primeros pocillos 70 μL del diluyente de sueros y 25 μL de diluyente a los segundos, terceros y cuartos pocillos. A los primeros pocillos, se colocó también 10 μL de los sueros a evaluar, además los sueros control positivo y negativo. Se realizó diluciones sucesivas transfiriendo 25 uL de los sueros a evaluar, desde la dilución 1/8 hasta el 1/64, desechando los últimos 25uL. Posteriormente se agregó 25uL de la suspensión antigénica a cada pocillo. Se agitó y se dejó en reposo la placa por 60 minutos hasta realizar las lecturas.
El análisis estadístico de los resultados se realizó mediante Distribuciones de Frecuencias.
Se obtuvo la autorización de los pacientes para la obtención de muestras de sangre para fines de este estudio, en ambos laboratorios.
Resultados
Los paneles de suero sanguíneos (Tabla 1), representan a sujetos con características diagnosticas definidas.
Las muestras incluidas en el panel A, correspondientes a 23 personas, se identificaron como infección por Leishmania spp en base a los resultados de diagnóstico clínico y por laboratorio. Las muestras del panel B, pertenecían a 11 personas que presentaban infección mixta por Leishmania spp y T. cruzi, según los resultados de laboratorio de diagnóstico realizados. Así mismo las muestras incluidas en el panel C correspondían a 30 personas con infección por Trypanozoma cruzi. Finalmente, las muestras del panel D pertenecían a 33 personas sin evidencias de ninguna de las infecciones indicadas.
Tabla 1. Características de los paneles de suero sanguíneo según los exámenes de laboratorio realizados
La observación microscópica de la reacción entre los epimastigotes de T. cruzi empleados como antígeno figurado para la técnica de microscopia de inmunofluorescencia con las muestras de suero del Panel “A”, correspondientes a personas con infección por Leishmania spp (Figura 1 y Tabla 2), evidencia la presencia de un patrón de fluorescencia nuclear exclusivamente que se visualiza como fluorescencia interna que se irradia hacia la periferia.
Tabla 2. Muestras de sueros según el patrón de fluorescencia que producen con epimastigotes de Trypanosoma cruzi.
Datos expresados en frecuencia (%).
El panel “B” correspondientes a individuos identificados con infección mixta por Leishmania spp y T. cruzi, en la observación por microscopia de fluorescencia, presentaron un patrón de fluorescencia nuclear y de membrana con diferente grado de intensidad (Figura 2 y Tabla 2).
Figura 2. Patrón de fluorescencia de núcleo y membrana otorgan a los epimastigotes de T. cruzi empleados como antígeno figurado, una intensidad de fluorescencia marcada que se aprecian como pequeñas bombillas con iluminación de color verde fluorescente. El patrón de fluorescencia núcleo/membrana corresponde a muestras de personas identificadas como coinfección por Leishmania spp y Trypanosoma cruzi. (Panel B).
El comportamiento de las muestras del panel “C”, proveniente de individuos identificados como infección por T. cruzi, presentaron un patrón de fluorescencia de membrana exclusivamente con intensidad de tres cruces mayoritariamente (Figura 3 y Tabla 2).
Figura 3. Patrón fluorescencia de membrana otorgan a los epimastigotes de T. cruzi empleados como antígeno figurado, una intensidad de fluorescencia periférica que define el contorno de los parásitos. El patrón de fluorescencia de membrana corresponde a muestras de personas identificadas como infección por Trypanosoma cruzi. (Panel C)
Al análisis de las muestras que no presentaban ninguna evidencia de infecciones por T cruzi ni Leishmania spp , agrupadas según correspondía a personas residentes en el área tropical (AT) o área periurbana de la ciudad de Cochabamba (AP), reflejaron ausencia de fluorescencia a nivel de membrana (M0) y de núcleo (N0) en el 38% de las muestras del AT y en el 100% de las muestras AP. La presencia de fluorescencia nuclear con intensidad una cruz (N1) se observó en el 62% de las muestras AT (Figura 4).
Figura 4. Frecuencia de muestras de suero según el patrón de fluorescencia que producen en la reacción de anticuerpos marcados con fluorocromos que reaccionan con epimastigotes de Trypanosoma cruzi, de personas sin evidencias de ninguna de las infecciones evaluadas (Leishmania spp y T. cruzi). AT= Panel de muestras de suero de personas residentes en área tropical (n= 13); AP= Panel de muestras de suero de personas residentes en el área periurbana de la ciudad de Cochabamba (n=20).
Discusión
La Leishmaniasis y enfermedad de Chagas tienen una amplia distribución, tanto en las áreas rurales y tropicales del Continente latinoamericano. Ambas son consideradas por la OMS como enfermedades tropicales de gran importancia, dentro las “Enfermedades Olvidadas o desatendidas”23. Estas dos enfermedades son transmitidas por diferentes especies de protozoarios del orden kinetoplástida24,25. Estos tripanosomátidos presentan un único flagelo que sobresale de un bolsillo anterior o bien está insertado lateralmente y adherido a la célula a lo largo de toda su longitud, características que los hacen muy similares22,25.
Bolivia se ha caracterizado principalmente, por los altos índices de Leishmaniasis mucocutánea (MCL,) y Leishmaniasis cutánea (LC)4. El incremento de los casos de leishmaniasis en estos últimos años, se atribuyen principalmente a los nuevos asentamientos humanos debido a la migración poblacional, mayoritariamente de zonas endémicas para la enfermedad de Chagas hacia las regiones tropicales5,6, lo cual produce cambios en la conducta de la enfermedad, debido a la coexistencia de ambas enfermedades; es el caso de la región tropical de Cochabamba. De ahí la importancia de detectar ambas patologías en estas regiones donde ambas enfermedades cohabitan, por la repercusión negativa que se podría tener, en el inicio del tratamiento de la Leishmaniasis con Antimoniato de N- metilglumina (Glucantime®), ya que uno de los efectos adversos de este medicamento de primera línea es la cardiotoxicidad26.
El diagnóstico inmunológico de Leishmaniasis y Chagas, presenta problemas respecto a las reacciones cruzadas con diferentes especies de Leishmania spp y Trypanosoma rangeli10,12,27 especialmente en aquellas zonas coendémicas, es por esto que los ensayos convencionales por Inmunofluorescencia suelen tropezar con esta dificultad, debido al tipo de antígeno empleado al momento de detectar anticuerpos anti-T.cruzi en personas que presentan coinfección por ambos tripanozomatidos10,11,27,28. En este estudio, para poder determinar el diagnóstico diferencial entre Leishmaniasis y Chagas se empleó como antígeno epimastigotes T. cruzi14, y como se muestra en las Figuras 1 y 2 se observó la existencia del patrón de fluorescencia nuclear con los sueros que corresponden a personas con leishmaniasis (panel A) mientras que para las infecciones mixtas se observó un patrón de fluorescencia nuclear y periférico (panel B), por otro lado, se aprecia un patrón periférico es decir fluorescencia a nivel de membrana con los sueros que corresponden a personas diagnosticadas con enfermedad de Chagas (panel C) (Figura 3) lo cual concuerda con los resultados de un estudio previo14,29,30.
La técnica de Inmunofluorescencia (IFI) con antígenos de epimastigotes de T. cruzi a demostrado utilidad en la diferenciación entre enfermedad de Chagas, Leishmaniasis y/o infecciones mixtas por ambos parásitos en aquellas zonas tropicales donde la coexistencia de ambas es habitual, debido a la migración de personas desde zonas endémicas para Chagas. Por lo tanto, esta técnica; poniendo énfasis en la observación microscópica de los patrones de inmunofluorescencia podría ser interesante además de viable desde el punto de vista técnico y económico como una alternativa dentro las pruebas convencionales.
Agradecimientos
A la Dra. MC Torrico y al Lic. Amilcar Flores por su colaboración para el desarrollo del presente trabajo.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe conflicto de intereses.
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consultado: enero 2020.
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