ARTÍCULOS ESTUDIANTILES

Validación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa En Tiempo Real (qPCR) acoplada a curvas melting como herramienta alternativa para el  diagnóstico de Tuberculosis Mutidrogorresistente

Validation of the Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) coupled to melting curves as an alternative tool for the diagnosis of Multi-Drug Resistant Tuberculosis

¹Brayan Mercado Michel ,  ² Aneth Vasquez Michel
1.      Tesista de la carrera de Bioquímica, instituto SELADIS, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés, La Paz. Bolivia. ]]> 2.      Docente Investigador Laboratorio de Microbiología Molecular, Instituto SELADIS, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés, La Paz. Bolivia.
*Autor para correspondencia: MSc. Aneth Vasquez Michel, Docente Investigador Instituto SELADIS, Jefe del Laboratorio de Microbiología Molecular amvasquez@umsa.bo
Fecha de Recepción: 30 Abril 2021 Fecha de Aceptación: 15 Mayo de 2021

RESUMEN

Introducción: La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa, causada por diversas especies del Complejo Mycobacterium tuberculosis, actualmente se estima que un tercio de la población mundial se encuentra afectada por lo que representa una amenaza para la salud pública, principalmente por el surgimiento de cepas Multidrogorresistentes (TB-MDR). En Bolivia se reportaron 7.538 personas enfermas con Tuberculosis, los últimos datos sobre TB-MDR indican un aumento de 0,2% por año,  el año 2019 se registró un 3,1% de TB-MDR. Actualmente en nuestro país se emplean métodos moleculares para la identificación de este agente infeccioso; no obstante, existen muy pocos o ningún trabajo acerca de la aplicación de métodos moleculares para la detección precisa y efectiva de cepas TB-MDR que otorguen validez a los resultados emitidos. Este trabajo resuelve el cuestionamiento de, si la PCR en tiempo real (RT-qPCR) acoplada a curvas melting es una herramienta de diagnóstico alternativo aplicable, para la identificación de Tuberculosis Multidrogorresistente.

Materiales y Métodos: Se trabajó con 74 cepas de Mycobaterium tuberculosis fenotípicamente identificadas por cultivo (método de las proporciones, Canetti Rist) como gold standar. El material genético para las pruebas moleculares se obtuvo por  el método de columnas, se utilizaron dos controles primarios para la determinación de resistencia a los fármacos Isoniacida y Rifampicina, tanto los controles como las muestras se procesaron por RT-qPCR acoplada a curvas melting, mediante cambios  de temperatura de disociación.

 Resultados: Loa parámetros de test diagnóstico de la prueba demostraron sensibilidad: 67.4%, especificidad: 83.3%, Exactitud: 73.97%, VPP: 85.3%, VPN: 64.1% para Isoniacida. Mientras que para Rifampicina: Sensibilidad: 97%, especificidad: 20%, exactitud: 58.9%, VPP: 55.4% y VPN: 87.5%.

Conclusión: El método evaluado para la determinación de resistencia a Isoniacida presenta un equilibrio entre sensibilidad y especificidad, por lo que representa una alternativa diagnóstica confiable, mientras que para resistencia a Rifampicina presenta una alta sensibilidad que es muy útil para países endémicos como el nuestro.

ABSTRACT

Introduction: Tuberculosis is an infectious-contagious disease, caused by various species of the Mycobacterium tuberculosis Complex, it is estimated that one third of the world population is affected by what represents a threat to public health, mainly by the emergence of multidrug-resistant strains (MDR-TB). In Bolivia, 7,538 people are reported sick with Tuberculosis, the latest data on MDR-TB indicate an increase of 0.2% per year, in 2018  there was 3.1% of MDR-TB. Currently in our country molecular methods are used to identify this infectious agent; however, there is very little or no work on the application of molecular methods for the precise and effective detection of MDR-TB strains that give validity to the results issued. This work resolves the question of whether real-time PCR (RT-qPCR) coupled to melting curves is an applicable alternative diagnostic tool for the identification of multidrug-resistant tuberculosis.

Materials and methods: We worked with 74 strains of Mycobaterium tuberculosis phenotypically identified by culture (method of proportions, Canetti Rist) as a gold standar. The genetic material for molecular methods was obtained by the column assay, two primary controls were used for the determination of resistance to the drugs Isoniazid and Rifampicin, both the controls and the samples were processed by RT-qPCR coupled to melting curves, by means of temperature changes of dissociation.

 Results: The diagnostic test parameters of the test demonstrated sensitivity: 67.4%, specificity: 83.3%, Accuracy: 73.97%, PPV: 85.3%, NPV: 64.1% for Isoniazid. While for Rifampicin: Sensitivity: 97%, Specificity: 20%, Accuracy: 58.9%, PPV: 55.4% and NPV: 87.5%

Conclusion: The method evaluated for the determination of resistance to Isoniazid presents a balance between sensitivity and specificity, therefore it represents a reliable diagnostic alternative, while for resistance to Rifampicin it presents a high sensitivity that is very useful for endemic countries such as ours. .

Keywords: Tuberculosis, Multidrug-resistant tuberculosis, Real-time PCR coupled to melting curves, Validation.

INTRODUCCIÓN

 Los métodos de diagnóstico microbiológico para tuberculosis comprenden a la baciloscopía y cultivo; este último es el método “gold standard”; sin embargo, la desventaja es el tiempo de obtención de resultados de 60 días o más. Frente a esta situación, los métodos de amplificación de ácidos nucleicos concretamente en este estudio la RT-qPCR, constituye una alternativa diagnóstica, que permite obtener resultados en tiempos relativamente cortos, inferiores a las 48 horas. (Calderón, R. et. al. 2005)

En nuestro país, no se toma en cuenta el diagnóstico de tuberculosis multidrogorresistente por métodos moleculares como un política de salud, y en la actualidad para poder implementar una alternativa diagnóstica es necesario comprobar y documentar la validez del método que se desea implementar para su aplicación, lo cual es un paso fundamental para asegurar que los resultados que aporto un método son confiables. Existen varios métodos de PCR y PCR en tiempo real que se están empleando hoy en día en nuestro país, pero no se tiene evidencia publicada sobre sus características diagnósticas. (Moreno, A. Hidalgo, C. 2015. p. 115)

Por esta razón este trabajo pretende resolver el cuestionamiento de si la PCR en tiempo real acoplada a curvas melting es una herramienta de diagnóstico alternativo valida, aplicable y confiable, para la identificación de tuberculosis multidrogorresistente.

MATERIALES Y MÉTODOS

Universo, población y Tamaño de muestra:

El cálculo de tamaño de muestra para este estudio se realizó en el programa EPI-INFO 7.2.0.1 en un cálculo de estudio del tipo de pruebas diagnósticas, con un nivel de confianza de 95%, tomando como dato para resistencia al tratamiento antituberculoso de 880 sujetos al año, con una sensibilidad propuesta del 95% y una especificidad del 80%, con un nivel de confianza del 85%  y un error aceptable del 5%, se obtiene una muestra total de 70 muestras. 

Se trabajó con 74 muestras de cepas aisladas de pacientes entre el año 2012 y 2013 que fueron identificadas y confirmadas como M. tuberculosis en cultivo Lowensten Jensen, además del perfil de susceptibilidad a Rifampicina e Isoniacida correspondiente determinado por el método de las proporciones (Canetti Rist), pruebas que fueron realizadas en el Laboratorio de Referencia Nacional de Control de la Tuberculosis en INLASA. El muestreo fue realizado tomando en cuenta la disponibilidad de la base de datos del perfil de susceptibilidad a fármacos, de las cepas proporcionadas por INLASA.

Protocolo de extracción de ADN “Columna” Kit de Invitrogen

Dispensar 50 µL de aislado bacteriano en tubo eppendorf de 1.5 mL marcado, Añadir 180 µL de tampón de digestión, 20 µL de Proteinasa K.Incubar a 56ºC por 40 minutos, dispensar 20 µL de RNAsa A, al lisado, mesclar e Incubar  a temperatura ambiente por 2 minutos.Añadir 200 µL del Buffer del tampón de lisis, homogenizar,incubar a 56°C por 30 min, adicionar 200 µL de Etanol absoluto y mezclar       

Purificación de ADN genómico por columna.-

Transferir todo el volumen obtenido en el protocolo de extracción (~ 500 ul) a una columna marcada con su tubo colector, centrifugar la columna a 10,000 g por 1 Min., descartar el eluído y trasferir la columna a un nuevo tubo colector, adicionar 450 µL de tampón de lavado 1, a la columna, centrifugar a 10,000g por 1 Min., desechar la elución y colocar la columna en un nuevo tubo colector, añadir 450 µL de tampón de lavado 2 a la columna centrifugar a 10,000g por 3 Min., desechar el tubo colector y colocar la columna en un tubo eppendorf de 1.5mL nuevo, adicionar 50 µL de tampón de elución de ADN a la columna, incubar a temperatura ambiente por 1 min, centrifugar la columna a máxima velocidad por 1 min.

Cuantificación de ADN.-

En un tubo eppendorf dispensar la muestra de 5uL ADN extraído y 95uL de agua libre de DNA asas, homogenizar en vortex, y centrifugar brevemente (En caso de no existir la posibilidad de lectura inmediata, las muestras fueron almacenadas a 4ºC), proceder a la lectura de la muestras, Se trabajó en el equipo Biophotometer plus eppendorf.

Preparación y Montaje de la PCR en tiempo real.-

Para el desarrollo de este trabajo se empleó los kits comerciales de “QuanDx- Molecular Diagnostic Inovator”,  que permite la detección de Mycovbacterium tuberculosis además de identificar los perfiles de susceptibilidad a Rifampicina  e Isoniacida,  empleando la PCR en tiempo real. El procedimiento general que se utilizó tanto en primera instancia, donde se optimizó la PCR, como también para el procesamiento de muestras se describe a continuación:

Primera etapa :En campana de flujo laminar de Tipo II marca ESCO Descongelar el kit a temperatura ambiente. Prepara en dos tubos separados de 0.2 mL  MEZCLA A y en otro tubo  MEZCLA B de ISONIACIDA (Específicamente para cada corrida de 11 muestras 245uL de MEZCLA y 5uL de Enzima), Repetimos el mismo procedimiento para RIFAMPICINA, Luego dispensamos 10uL del preparado final a cada uno de los 96 tubos de la placa

Segunda etapa :Utilizar 8 tubos de PCR por muestra, 4 para Isoniacida y 4 para Rifampicina. Dos tubos para MEZCLA A y dos tubos para MEZCLA B ya que se utilizó en cada MEZCLA para dos diferentes marcadores de fluorescencia o fluróforos (FAM y  JOE). Homogeneizar las muestras de ADN previamente extraídas en vortex y centrifugar por poco tiempo antes de mezclar con el mix preparado anteriormente. Dispensar 2,5uL del ADN al tubo que corresponda. Tapar cada tira de tubos con sus respectivas tapas, y asegurar bien para evitar evaporación.

Tercera etapa:Se programó el software del equipo según indicaciones de los fabricantes del kit comercial; sin embargo en el “programa 4” se realizó una pequeña modificación, concretamente en la etapa de alineación de los primers, el tiempo utilizado fue de 30 segundos en vez de los 15 sugeridos por el kit comercial.

El análisis de la amplificación y las curvas melting fueron proporcionados automáticamente por el equipo. Las curvas de los controles positivos internos, que representan el comportamiento característico de la curva melting, para una cepa sensible o “wild type” obtenida simultáneamente con los dos fluoróforos utilizados

Se realizó la primera corrida de PCR con los controles internos del kit. (control positivo y control negativo) estos cumplieron con los parámetros señalados por la bibliografía, cuyos valores de las temperaturas melting (Tm) obtenidas en el experimento en comparación con el valor de las temperaturas estándar establecidas por el kit comercial,

Posteriormente se realizó el experimento con el ADN obtenido de 11 muestras, procesadas con las condiciones ya establecidas con los controles (cepas wild type). Los valores de las temperaturas melting de una cepa Wild type, y las temperaturas melting obtenidas de las muestras, como también la interpretación del perfil de susceptibilidad de estas cepas obtenido por este método, en base al criterio de considerar una cepa como resistente, sí, en uno de los canales utilizados (FAM o JOE) de cualquiera de las mezclas (A o B) presenta una Tm mayor o igual en 2ºC en comparación con el valor de la Tm que corresponde del control positivo.

Análisis Estadístico

El cálculo de la sensibilidad, especificidad, exactitud y valores predictivos se realizó a partir de la elaboración de tablas de contingencia de doble entrada.

Aspectos Bioéticos

Los aspectos bioéticos no aplican a este tipo de investigación ya que se trabajó con cepas aisladas, sin tener mayor importancia el nombre, género, ni antecedentes clínicos de las personas o pacientes.

Estimación de las características de test diagnóstico de la PCR en tiempo real acoplada a curvas melting.

Para evaluar la validez del método en estudio,  se estimó el desempeño del mismo  comparándolo con el método gold estándar (G.S) que es el método de las proporciones, al realizar esta operación se obtuvieron cuatro combinaciones diferentes al tener resultados que se expresan de forma binaria (resistente o sensible). El resumen de estos resultados se expresa en las tablas de contingencia de 2x2 Tablas 1-2 para Isoniacida y  Rifampicina respectivamente.

Tabla 1.Cuadro de contingencia de resultados para susceptibilidad a Isoniacida de M. tuberculosis entre el método gold stantandar versus PCR En Tiempo Real Acoplada a Curvas melting

Tabla 2. Cuadro  de contingencia de resultados para susceptibilidad a Rifampicina de M. tuberculosis entre el método gold stantandar versus PCR En Tiempo Real Acoplada a Curvas melting

A partir del análisis de las tablas de contingencia se calcularon las distintas características del poder discriminatorio de la RT-qPCR acoplada a curvas melting para la detección de tuberculosis multidrogorresistente. Los parámetros evaluados fueron: Sensibilidad, Especificidad, Exactitud, Valores Predictivos y Likelihood Ratio positivo y negativo. El cálculo y  valores de las características de test diagnóstico, expresados en porcentajes, de la RT-qPCR acoplada a curvas melting, para la detección de tuberculosis resistente a Isoniacida y Rifampicina se expresan en las tablas 3-4 respectivamente .

 Tabla 3. Cálculo y valores hallados de las características como test diagnóstico de la RT-qPCR acoplada a curvas melting para la determinación de M. tuberculosis Resistente a Isoniacida.

Tabla 4.Cálculo y valores hallados de las características como test diagnóstico de la RT-qPCR acoplada a curvas melting para la determinación de M. tuberculosis Resistente a Rifampicina.

Para representar los likelihood ratios se utiliza el nomograma de Fagan, este permite traducir el LR de un test, en un cambio objetivo de la probabilidad pre test a post test; en otras palabras nos permite observar el aumento de la probabilidad de tener un resultado positivo y la disminución de la probabilidad de tener un resultado que no sea verdaderamente negativo. En las figura 1 y  2 se observa los resultados del cálculo del nomograma de Fagan para el diagnóstico de resistencia a Isoniacida y Rifampicina respectivamente. En la columna izquierda se observa la probabilidad pre test, en la columna central se observa el valor del LR y en la columna derecha se observa la probabilidad post test.

Figura 1. Nomograma Fagan para interpretación de Likelihood Ratios del método de detección RT-qPCR acoplado a curva melting para susceptibilidad a Isoniacida

Figura 2. Nomograma Fagan para interpretación de Likelihood Ratios del método de detección RT-qPCR acoplado a curva melting para susceptibilidad a Isoniacida.

Comparación de los resultados de perfiles de susceptibilidad obtenidos por el método de las proporciones y  rt-qpcr

Resultados del método de las proporciones

De las  74 cepas  proporcionadas por INLASA los resultados fenotípicos reflejaron un total de 37 cepas MDRs, 7 cepas monorresistentes a Isoniacida,  ninguna cepa monorresistente a Rifampicina y 30 cepas sensibles a ambos fármacos. Tabla 5. 

Resultados de la PCR en tiempo real acoplada a curvas melting

Tabla 6.  Clasificación de cepas de M. tuberculosis según perfil de susceptibilidad a fármacos antituberculosos de primera línea obtenido por RT-qPCR acoplada a curvas melting

El cálculo de concordancia entre el resultado de un método y otro se realizó por separado para Isoniacida y para Rifampicina  cepas sensibles, cepas monorresistentes y cepas MDRs. Los resultados que se observan en la tabla 7.

Tabla 7. Concordancia del Perfil de Susceptibilidad de M. tuberculosis a fármacos de primera línea, obtenido entre el método Gold Estándar (Canetti Rist) y la RT-qPCR acoplado a curvas melting. 

DISCUSIONES

Desde hace muchos años se viene proponiendo la necesidad de  incluir la aplicación de Tecnología Molecular al diagnóstico de rutina para la detección de TB y TB-MDR en nuestro país, anteriormente se realizaron estudios donde se evaluaron métodos moleculares de alta tendencia en la época, como es el caso del el kit Genotype MDBRTplus (Molina, J. 2018) sin embargo, en la actualidad la mayor tendencia en Latinoamérica y en menor porcentaje a nivel mundial, es la implementación de métodos basados en el método de PCR en tiempo real, el ejemplo más renombrado en este último tiempo es el equipo   “GeneXpert Dx System” o “Xpert® MTB/RIF. (Lawn, S. 2011)

La validación de un método de ensayo implica en la práctica llegar a conocer los atributos que ofrece dicho método, eso quiere decir, que se debe evaluar sus parámetros de calidad diagnóstica mediante cálculos estadísticos como los realizados en este estudio, específicamente, comparando los resultados obtenidos por el método evaluado, con las características del “Gold Estándar” o método de referencia. Moreno, A. (2015)

Nuñez, M. (2008) afirma que el problema de la aplicación de cualquier técnica diagnóstica nueva o alternativa, es acertar con adecuado compromiso entre la detección de una enfermedad entre las personas que realmente la padecen y evitar asignar esa patología a personas que no la tienen; en tal sentido, un modo fácil e importante de validar el desempeño de un test diagnósticos es mediante el análisis de sensibilidad, especificidad, exactitud por lo que cada uno de estos representa.

El análisis de los resultados para la validación de la RT-qPCR acoplada a curvas melting para determinación de susceptibilidad para cada antituberculoso se realizó por separado, debido a las características que reflejaron cada uno de los métodos. Los resultados para la determinación de susceptibilidad a Isoniacida por RT-qPCR reflejan un equilibrio entre sensibilidad y especificidad, el valor de la sensibilidad da un indicio que  este método puede abarcar la mayor cantidad de cepas que verdaderamente presentan resistencia a este fármaco, pero al mismo tiempo permite afirmar que es un método altamente específico para Mycobacterium tuberculosis resistente a Isoniacida.  Relacionando estas dos características del método pudimos estimar que la exactitud, es decir la proporción de test con resultado correcto, es aceptable, pero no es el realmente esperado. Al ser un método altamente específico principalmente podemos afirmar que un resultado positivo confirma la resistencia a Isoniacida, pero si el resultado saldría negativo no habría que descartar la posibilidad que si exista la resistencia al fármaco. (Salech, F. et. al. 2008)

Los resultados de la evaluación de susceptibilidad a Rifampicina por RT-qPCR señalan que el método a ser validado es altamente sensible; es decir, que tiene la capacidad de detectar  ampliamente todos los pacientes que presenten la enfermedad; lo cual indica que un resultado negativo del test descarta la resistencia a Rifampicina;  sin embargo; presenta el problema de ser poco específica, este fenómeno es frecuente ya que la sensibilidad y la especificidad son inversamente proporcionales, es decir que cuanto más eleva  una más baja la otra, y viceversa, por eso es muy complicado hallar métodos que encuentren un perfecto equilibrio entre ambos. (Nuñez, M. 2008). Se puede evidenciar claramente que la concordancia para el perfil de susceptibilidad a Isoniacida es mucho mayor que la de Rifampicina, este resultado puede deberse a muchos factores que se complementan con los datos obtenidos en las características de test diagnóstico que fueron calculados para este método en función del gold estándar.

Existe una probabilidad de que las cepas que presentaron resistencia a Isoniacida y Rifampicina por el método de RT-qPCR acoplado a curvas melting, pero que no expresan fenotípicamente el mismo resultado, o viceversa, sean poblaciones heterogéneas de cepas de M. tuberculosis.  Es decir que pueden existir cepas heterogéneas con perfil de susceptibilidad diferente a los fármacos de primera línea, que se hayan evaluado por un método u otro como si fuesen una sola, dando un resultado diferente entre el método de las proporciones y el evaluado en este estudio, esto sin duda baja el porcentaje de concordancia entre los métodos. Sin embargo, no se detectó curvas melting características de este tipo de poblaciones en el análisis de los resultados de este método, pero cave recalcar que son solo curvas basadas en las instrucciones del kit comercial, por lo que no se puede descartar la posibilidad que existan otro tipo de curvas no señaladas en el kit comercial que indiquen la presencia de estas poblaciones heterocigotas.

Trabajos como el de Torrez, M.(2010). En el que se utilizó el sistema Xpert MTB/RIF para detección de resistencia a Rifampicina por RT-qPCR en muestras extrapulmonares obtuvieron una sensibilidad de 93.5%, especificidad de 97%, VPP de 73.3% y VPN de 94.4%. Este fue realizado en Colombia, país considerado de prevalencia intermedia lo cual puede que influya mucho en el trabajo, debido a que en otro estudio, también realizado en muestras extrapulmonares, pero en países de alta prevalencia de la enfermedad, empleando el mismo sistema, se reportó una sensibilidad menor (59%) y especificidad de 92%.

La PCR en tiempo real acoplada a curvas melting, si representa una herramienta de diagnóstico alternativo para la identificación de Mycobacterium tuberculosis multidrogorresistente. Esto se afirma debido a los valores obtenidos en la validación como test diagnóstico, donde se refleja un likelihood ratio (+) por encima de 1 (4,18) y un likelihood ratio (-) no incluye el 1, está por debajo de 0,38, además de un alto porcentaje de concordancia entre ambos métodos para cepas MDR.

AGRADECIMIENTOS

A todo el personal del Laboratorio de Referencia Nacional de Diagnóstico de Tuberculosis del Instituto Nacional de Laboratorios en Salud INLASA, quienes proporcionaron las cepas de M. tuberculosis y toda la información de interés.

A la Dra. María Esther Chuquimia Choque por su asesoramiento en la optimización y desarrollo de las técnicas moleculares qPCR y curvas melting

Al Dr. Omar Rocabado, Laboratorio LABOGEN por el apoyo con equipamiento.

REFERENCIAS

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