Salamanca, Efraín2 Ticona, Juan3 Enrique, Udaeta4 Ivan, Limachi5 Ninoska, Flores6
Alcides7, Natalio Marupa8 Benigno, Chao 9 Giménez, Alberto105, fueron seleccionados como promisorios. Resultados: Se obtuvieron 3 plantas muy activas (CI50<10ug/ml_); 2 moderadamente activas (10ug/mL
5were selected as promising. Results: A total of 3 species were very active (IC50<10ug/mL); 2 were moderately active (10ug/mL
Actividad antiparasitaria in vitro de plantas de la medicina tradicional Tacana sobre Plasmodium faciparum a través del método
fluorométrico-SYBR GreenI
In vitro antiparasitic activity from plants ofthe Tacana traditional medicine on Plasmodiumfaciparum through thefluorometric method-SYBR GreenI.
Condo, Claudia1 Salamanca, Efraín2 Ticona, Juan3 Enrique, Udaeta4 Ivan, Limachi5
Ninoska, Flores6 Alcides7, Natalio Marupa8 Benigno, Chao 9 Giménez, Alberto10
Resumen
Introducción: La presencia de compuestos activos en las plantas las posiciona como una fuente alternativa para el descubrimiento de nuevos fármacos.
Objetivo: Realizar la bioprospección de plantas utilizadas en la Medicina Tradicional Tacana frente a cultivos de Plasmodium falciparum.
Métodos: Se obtuvieron extractos por maceración en etanol a temperatura ambiente, de 31 órganos colectados de 23 plantas, estos fueron evaluados sobre cultivos asincrónicos de la cepa de Plasmodium falciparum resistente a la Cloroquina (FCR3). A los extractos que mostraron actividad antiplasmódica (CI50<20ug/mL)/ se evaluó la citotoxicidad (DL50) frente a células HeLa y se calculó el Índice de Selectividad (IS=DL50/CI50). Los extractos que dieron resultados IS>5, fueron seleccionados como promisorios.
Resultados: Se obtuvieron 3 plantas muy activas (CI50<10ug/ml_); 2 moderadamente activas (10ug/mL<CI50<15ug/ml_); 4 plantas poco activas (15ug/ml_<CI50<20ug/ml_) y 14 plantas inactivas (CI50>20ug/ml_). De las 9 plantas que presentaron actividad, solo 2 plantas presentaron IS>5.
Conclusiones: Incorporar los conocimientos del uso tradicional para realizar las evaluaciones biológicas es de mucha ayuda en la selección de plantas con efectos antiplasmódicos.
Palabras Clave
Plasmodium, medicina tradicional Tacana, HeLa, Índice de Selectividad.
Introduction: The presence of active compounds in plants, converts them as an alternative to find new drugs.
Objective: Carry out the bioprospecting of plants used in Tacana Traditional Medicine against Plasmodium falciparum cultures.
Methods: From the 31 collected organs of 23 plants, raw extracts were obtained by ethanolic maceration at room temperature and these were evaluated on asynchronic cultures of the strain Plasmodium falciparum resistant to Chloroquine (FCR3). The active extracts (IC5()<2Oug/mL), were evaluated for cytotoxicity (LD50) against HeLa cells and the Selectivity Index (IS=DL50/IC50) was calculated. The extracts that sowed IS>5were selected as promising.
Results: A total of 3 species were very active (IC50<10ug/mL); 2 were moderately active (10ug/mL<IC50<15ug/mL); 4 slightly active (15ug/mL<IC50<20ug/mL) and 14 inactive plants (IC50>20ug/mL). From the 9 active plants only 2 presented IS>5.
Conclusions: Incorporating the traditional knowledge to carry out biological evaluations is very helpful in the selection of plants with anti-plasmodial effects.
Key Words
Plasmodium, Tacana tradicional medicine, HeLa, Selective Index.
]]> INTRODUCCIÓN
La malaria o paludismo es una enfermedad causada por parásitos pertenecientes al género Plasmodium, existen cinco especies que causan la enfermedad en el ser humano, donde Plasmodium. vivax y Plasmodium falciparum (ambas especies presentes en Bolivia) son las más peligrosas y este último es el responsable de la mayoría de las muertes provocadas por la enfermedad (Ministerio de Salud - Bolivia, 2018). Esta parasitosis es transmitida por la picadura del flebotomo infectado Anopheles hembra y los casos de resistencia, a los tratamientos disponibles, están aumentando a nivel mundial (Blasco et al., 2017; Rout & Mahapatra, 2019) por lo que la lucha para la erradicación de esta enfermedad continúa siendo un enorme desafío y existe una urgencia y necesidad de probar nuevos compuestos antiparasitarios que ayuden en la eliminación de este agente.
La comunidad indígena Tacana, ubicada al norte del departamento de La Paz, practica la medicina tradicional, utilizando diversos tipos de plantas como tratamiento a las diversas enfermedades, (Quenevo & Lara 2007) este conocimiento de la comunidad Tacana sobre la biodiversidad vegetal puede ser una alternativa para el descubrimiento de nuevos fármacos antipalúdicos ya que las plantas son una fuente importante de principios activos con diversas propiedades farmacológicas y alternativas de tratamiento (Newman & Cragg, 2012).
MATERIALES Y METODOS
Equipos
Estufa a 37°C, 5% CO2 y 100% de humedad (Midi 40 CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, EE.UU.); Estufa a 37°C (Compact CO2 Series 5000), Cabina de seguridad biológica (Labconco Clase II); centrifugadora Jouan CR3i, (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.); lector de microplacas (BioTeckSynergy HT: Multi - Mode Microplate Reader, EE.UU.); Software Gen5 versión 2.09; Microscopio de fluorescencia EVOS FL (Cell imaginig System, Life Technologies, EE.UU.); Microscopio óptico (Leitz Aristoplan, Alemania); Microscopio óptico invertido (Axiovert 25, Zeiss, Alemania), Placas de 96 pozos, fondo plano (Thermo Scientific, EE.UU.) Ph metro (Oakton, pH 700), Balanza analítica (AND), agitador magnético (Labline, pyro-magnestir), Vortex (Genie 2), Refrigerador -50°C (Revco), Refrigerador -20°C (LG), shaker (Heidolph, Bioblock).
Reactivos
RPMI 1640 (Sigma), NaHCO3 (Cicarelli), D-glucosa (Sigma), Hipoxantina (Sigma), Hepes (Sigma), Gentamicina (VWR), Albumax (Gibco) KCL y NaCl (Biopack), KHCO3, Dimetil sulfoxido (DMSO) al 96% (Sigma), Na2HPO4 (Sigma), KH2PO4 (Sigma), NaH2PO4 (Sigma), sal sódica de ácido etilendiamintetraacetico (EDTA) (Sigma), Tincion Giemsa, SYBR Green I (Invitrogen), Tris (Sigma), Saponina (Sigma),Triton(Sigma), Resazurina sodium salt (Sigma), clorhidrato de hemina (Sigma), NaOH (Riedel-de Haën), ácido acético (Sigma), acetato de sodio (Sigma), Suero Bovino Fetal (Thermo Scientific), citrato de sodio (Sigma).
]]> Material VegetalEl material vegetal, se recolecto en la localidad de Buena Vista (S 14°21'969" y O 67°33'764"), provincia Abel Iturralde del departamento de La Paz, Bolivia. Las muestras voucher fueron depositadas e identificas en el Herbario Nacional de Bolivia (HLP). Los usos medicinales, forma de preparación y tratamiento de estas plantas se consensuaron en un taller local con diferentes naturistas Tacanas, reunidos por el Consejo Indígena de Los Pueblos Tacana (CIPTA) y el Consejo Indígena de Mujeres Tacana (CIMTA).
Los controles utilizados para las evaluaciones biológicas in vitro y sus concentraciones fueron: Alcaloides totales de la corteza de Evanta, Galipea Longiflora Krause (CAT, 50.0, 25.0, 12.5, 6.2, 3.1ug/mL), Quinina y Cloroquina, (5.0,0.5, 0.25, 0.12, 0.06ug/mL).
Los extractos crudos (y sus fracciones) para evaluar actividad antipalúdica y citotóxicase utilizarona concentraciones de 50.0, 25.0,12.5, 6.2, 3.1ug/mL.
Medio de Cultivo RPMI 1640 parasitario
El cultivo parasitario se realizó siguiendo la metodología descrita porTrager & Jensen, 1979. Se preparó el medio de cultivo RPMI 1640-HEPES (16.0g/L), suplementado con D-glucosa (4.5g/L), NaHCO3 (1.5g/L), Hepes (5.95g/L), Hipoxantina (40.0mg/L), Gentamicina (60.0mg/L), pH 7.4, para lavar los eritrocitos.Para mantener el cultivo parasitario, se añadió a este medio 5% de una solución de Albumax al 5%, denominado como medio RPMI 1640 completo. Se utilizó una solución de lisis: Tris (2.42g/L), EDTA (1.86g/L), Saponina (800.0mg/L), Triton (800uL.) para revelar los cultivos.
Medio de Cultivo RPMI 1640 celular
Para el cultivo celular se utilizó RPMI 1640-Hepes (16.0g/L), gentamicina (60.0mg/L), NaHCO3 (2.13g/L), pH 7.4, se añadió 5% de Suero Bovino Fetal (SBF), denominado RPMI celular completo. Se realizó el cambio de medio de cultivo cada 72 horas para garantizar la viabilidad celular.Se utilizó solución de desprendimiento celular: NaCl (0.8g/mL), Na2HPO4 (0.11g/mL), KCl (0.02g/mL), KH2PO4 (0.02g/mL) y EDTA (0.02g/mL) para desprender las células antes de cultivarlas.
Plasmo dium falciparum
La cepa Plasmodium falciparum Cloroquina Resistente (FCR3) fue donada por la Dra. Lastenia Ruiz Mesia del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales Antiparasitarios de la Amazonia - LIPNAA, de la Universidad Nacional de la Amazónia Peruana, Iquitos Perú. Las cepas fueron cultivadas en medio RPMI 1640 completo, incubadas a 37°C, 5% de CO2 en el aire y 100% de humedad relativa. Se colectó sangre total de donantes voluntarios, utilizando 1.5mL de anticoagulante citrato de sodio por 10.0mL de sangre, los eritrocitos fueron recuperados y lavados con medio RPMI.
]]> Células HeLaSe utilizó la línea celular Helacyton glarteri (HeLa), donada por el laboratorio de Farmacología del Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, fueron cultivadas en medio RPMI celular con 5% de SBF, incubadas a 37°C, 5% de CO2 en el aire y 100% de humedad relativa.
Evaluación de la actividad antiplasmódica de extractos de especies vegetales in vitro
Cultivos in vitro de cepas de Plasmodium falciparum
Para el control de la parasitemia se realizaron frotis de una pequeña muestra del sedimento de eritrocitos del cultivo parasitario, se tiño con Giemsa y se observó al microscopio óptico con un lente de 100X.
Preparación de mix de eritrocitos sanos y parasitados
Se preparó un mix de eritrocitos al 4% con RPMI parasitario completo utilizando una parasitemia inicial de 2%.
Preparación de la placa de 96 pozos.
Se utilizó placas de 96 pozos, dispensando 100ul de diluciones de los extractos y controles a cada pozo, añadiendo sobre estos 100ul de mix de eritrocitos. Al control de crecimiento se colocó 100ul mix de eritrocitos y 100ul de RPMI parasitario completo. Como blanco se utilizó 200ul de mix eritrocitos no infectados al 2%. La placa se incubó a 37°C con 5% de CO2 por 48 horas.
Medición de la parasitemia por ñuorescencia (SYBR Green I)
]]> Pasadas las 48 horas de incubación se añadieron 100ul de solución de SYBR Green I al 2% utilizando la solución de lisis como diluyente a cada pozo. Se dejó actuar por 3 horas a 37°C con 5% de CO2. La solución provoco la ruptura de la membrana de los eritrocitos permitiendo que el reactivo fluorescente, SYBR Green I, llegue al ADN del parásito y emita fluorescencia. Seguidamente las placas fueron leídas en el lector de fluorescencia a una longitud de excitación y emisión de 495nm y 528nm respectivamente. A partir de las lecturas los valores de fluorescencia fueron transformados en porcentaje de inhibición, donde el 100% representa la absorbancia del blanco.Evaluación de la actividad citotóxica de extractos de especies vegetales in vitro
Se aplicó al cultivo celular la solución de desprendimiento (5mL) dejando actuar por 10 minutos a37°C, fue re-suspendida y centrifugada a 2.500 r.p.m. por 10 minutos, desechando el sobrenadante y aumentando al precipitado 2mL de RPMI celular, posteriormente se realizó el recuento celular en cámara de Neubauer ajustando la población a 5x104 células /mL con medio RPMI celular completo y se dispensó 100uL a cada pozo en placas de 96 pozos. Se dejó incubar a 37°C con 5% de CO2por 24 horas, para permitir la adherencia celular a la superficie plana del pozo, pasado este tiempo se añadieron 100ul de las diluciones de extractos, fracciones y drogas de control, se dejó incubar en las mismas condiciones anteriormente descritas por 72 horas. Como blanco se utilizó 200ul de medio RPMI celular y como control de crecimiento se utilizólOOuL de la población ajustada y 100uL de medio RPMI celular completo.
Medición de la citotoxicidad por ñuorescencia (Resazurina)
Pasadas las 72 horas, se realizaron las lecturas de fluorescencia por el método fluorométrico Resazurina, se adicionó a cada pozo 10ul de una solución de resazurina (2mM) y se incubo a 37°C por 3 horas, las placas fueron leídas en el lector de fluorescencia a una longitud de onda de excitación y de emisión de 540nm y 590nm respectivamente. A partir de las lecturas los valores de fluorescencia fueron transformados en porcentaje de inhibición, donde el 100% representa la absorbancia del blanco. La conversión del porcentaje de inhibición al valor de la CI50 se realizó en Microsoft Excel.
Obtención del Índice de selectividad
Se define como el cociente de la DL50 de una determinada droga sobre células de mamíferos entre la CI50 de la misma droga sobre un microorganismo.
RESULTADOS
Se evaluó la actividad biológica in vitro (CI50) de los extractos crudos de maceración etanólica de 23 plantas utilizadas dentro la medicina tradicional Tacana para tratar sintomatología relacionada al paludismo, frente a la cepa de Plasmodium falciparum resistente a la Cloroquina (FCR3) los resultados obtenidos se observan en la tabla 1.°
]]> Tabla1. Actividad in vitro de 23 plantas Tacana utilizadas para tratar sintomatología relacionada al paludismo.Se obtuvieron valores de CI50 que van desde 6.0±0.1ug/mL hasta >50ug/ mL, resultados iniciales que nos permitieron clasificar estos extractos de las diferentes plantas según Rasoanaivo et al., (2004) en: plantas muy activas CI50<10ug/mL (3 Plantas); moderadamente activas <10ug/mL G50<15ug/ mL (2 Plantas); poco activas <15ug/mL CI50<20ug/mL (4 Plantas); e inactivas CI50>20ug/mL. (14 Plantas).
Seleccionando de esta manera 9 plantas entre muy activas y poco activas, a las cuales se les realizo la evaluación de citotoxicidad frente a células HeLa para obtener la Dosis Letal media (DL50) de los extractos y calcular el Índice de Selectividad (IS) como se muestra en la tabla 2, lo que finalmente indicó si el extracto en estudio presentaba o no toxicidad.
Tabla2.Citotoxicidad e Índice de Selectividad de los extractosactivos.
En base al IS y tomando en cuenta la clasificación de Fletcher, quien indica que en casos de R falciparum, cuando el IS de un producto es menor a 5 es considerado no selectivo, si esta es entre 5 y 18 es moderadamente Selectivo y cuando el IS es mayor a 18 es Selectivo (Fletcher & Avery, 2014), obtuvimos dos productos de la medicina tradicional Tacana (Aquí Djebe, Cawuasha Baba) considerados moderadamente selectivos frente a P.falciparum, las demás plantas fueron consideradas citotóxicas no selectivas. Estas 2 especies vegetales: Psychotria carthagenensis y Scleria macrophylla se encuentran bajo estudios biodirigidos para aislar e identificar los metabolitos secundarios responsables de la actividad antipaludica.
DISCUSIÓN
Estudios realizados en Psychotria carthagenensis, conocida en la medicisencia de alcaloides indólicos y muchas especies han reportado extractos bioactivos (Silva et al., 2017) frente a bacterias y parásitos protozoarios, al igual que en nuestro estudio con P. falciparum. En un trabajo realizado en el año 2003, se obtuvieron alcaloides de Psychotria klugii:klugine, 7'-O-de-metilisocefaeline, cefaeline con actividad leishmanicida y potente actividad contra P. falciparum en las cepas W2 y D6 con CI50 de 27.7 a 46.3ng/mL (Iliaset al., 2003), nuestros resultados no han sido tan potentes como los reportados por estos autores, sin embargo, se debe considerar que ellos trabajaron con moléculas aisladas. También una evaluación biodirigida de extractos metanólicos de Psychotria bahiensis resultó en el aislamiento de 5 acaloides bioactivos tipo indol mono terpenoides que tuvieron actividad antiplasmodial (Paul et al., 2003). Otro estudio ha reportado el aislamiento de moléculas bioactivas con actividades citotoxicas, antibióticas (Psychotria microlabastra), analgésicas, (Psychotria capensis) ansiolíticas, antidepresivas, psicotrópicas (Psychotria viridis), antipiréticas, antiinflamatorias, antioxidantes, vaso relajante, antivirales, (Psychotria serpens), antimicrobiana y anti-protozoaria (Psychotria insularum) (Silva et al., 2017).
]]> Nyongbela et al., 2017, publicaron un artículo de extractos de Scleria stria-tinux evaluados frente a cepas de Plasmodium Resistentes a Cloroquina K1, W2 y en cepas Sensibles a Cloroquina NF54, D6 con un CI50 entre 664 y 894 ng/mL respectivamente, demostrando que estos resultados son más sensibles que los nuestros realizados con Scleria macrophylla, conocida en la medicina tradicional Tacana como Cawuasha Baba (Bourdy et al., 2000). Existen reportes donde indican que se aisló el peróxido okundo del extracto de raíz de Scleria striatonuxde Wild. El cual fue evaluado frente a cepas sensibles y resistentes de PlasmodiumW2, D6, K1, NF54 cuyos CI50 fueron de 1.8, 1.8, 5.6, 4.9uM respectivamente (Mori et al., 2017). Un trabajo realizado por Subramani et en el año 2017 reporta resultados con actividad biológica de Scleria spp frente a una cepa Resistente a Cloroquina de P. falciparum, corroborando los resultados obtenidos en nuestro estudio acerca de la presencia de moléculas bioactivas en las plantas evaluadas.
CONCLUSIONES
La actividad biológica observada en las plantas durante el estudio indicaría la presencia de compuestos que se han reportado en ambos géneros, Psychotria y Scleria, demostrando que estas plantas pueden ser de interés para futuras investigaciones por lo que se recomienda incrementar las investigaciones en modelos in vitro e in vivo sobre estas especies.
AGRADECIMIENTOS
El estudio fue desarrollado con fondos de los Proyectos UMSA-ASDI: Biomoléculas de Interés Medicinal e Industrial y Bioprospección Tacana. Al CIPTAy CIMTA por la coordinación de los trabajos de campo. A la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, por el apoyo en las misiones de campo.
NOTAS
1. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas Área de Química Farmacéutica y Área de Evaluaciones Biológicas. ]]> ORCORCID: https://orcid.org/0000-0003-2951-0496
2. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Área de Química Farmacéutica y Área de Evaluaciones Biológicas.
ORCORCID: https://orcid.org/0000-0001-9999-3759
3. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Área de Química Farmacéutica y Área de Química de Productos Naturales.
ORCORCID: https://orcid.org/0000-0001-8073-6840
4. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Área de Química Farmacéutica.
ORCORCID: https://orcid.org/0000-0001-8769-468X
5. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Área de Química Farmacéutica y Área de Química de Productos Naturales.
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1179-9770
6. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Área de Química Farmacéutica. ]]> ORCORCID: https://orcid.org/0000-0002-6718-1702
7. Comunidad de Buena Vista.
8. Comunidad de Buena Vista.
9. Comunidad de Buena Vista.
10. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Área de Química Farmacéutica.
ORCORCID: https://orcid.org/0000-0002-7176-7810
Dirección para correspondencia: Alberto Giménez. ajgimenez@umsa.bo. Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés. Av. Saavedra # 2224, Miraflores. La Paz, Bolivia
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