Modelamiento proteico de la Tubulina de G. lamblia
por homología de secuencias

Protein modeling of G. Lamblia Tubulin
through sequence homology

Grados Torrez, Ricardo Enrique¹ ]]> ¹Laboratorio de Farmacología, Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (I.I.F.B.) "Luis Enrique Terrazas Siles".
Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra 2224. La Paz, Bolivia. E-mail: ergrados@hotmail.com
Fecha de recepción: 13 de marzo de 2019, Fecha de aceptación: 19 de abril de 2019

Resumen

La Giardiasis ocasionada por Giardia in-testinalis (conocida como Giardia lamblia), es una de las infecciones parasíticas más comunes en todo el mundo y con mayor pre-valencia en países en desarrollo como el nuestro. Existen muchas drogas para el tratamiento de la giardiasis, de diferente eficacia y efectos adversos como la curcumina que inhibe la polimerización de los micro-tubulos por un mecanismo distinto al de la colchicina. Sin embargo, la estructura cristalográfica de la Tubulina de G. lamblia (cadenas a y P) permanece desconocida. El análisis de alineamiento de secuencias (PBLAST) indica una identidad del 86,98 y 88,32 % entre las cadenas a y p de la Tubulina de G. lamblia y B. taurus (PDB:5NQT). El Modelamiento por Homología de la estructura proteica de la Tubulina de G. lamblia utilizando como molde a la Tubulina de B. tau-rus mediante el servidor SWISS-MODEL, generó una estructura proteica con los siguientes parámetros: z-core = -1,16 y -1,41, QMEANscore6 = 0,71 y 0,70, % de confiabi-lidad (de los diagramas de Ramachandran) = 96,08 y 96,95 %, RMS (Root Mean Square) = 0,081 y MOLPROBITYscore = 1,26. Estos parámetros indican que la estructura proteica de la Tubulina de G. lamblia obtenida a partir del Modelamiento por Homología es de buena calidad, por tanto, esta estructura podría ser utilizada en futuras evaluaciones, como el análisis in silico de compuestos antiGiardia.

Palabras clave: Modelamiento Proteico, Tubulina, Giardia lamblia, Homología de Secuencias.

Abstract

Giardiasis caused by Giardia intestina-lis (known as Giardia lamblia), is one of the most common parasitic infections in the world and with a higher prevalence in de-veloping countries like ours. There are many drugs for the treatment of giardiasis, of dif-ferent efficacy and adverse effects such as curcumin that inhibits the polymerization of microtubules by a mechanism other than colchicine. However, the crystallograph-ic structure of G. lamblia Tubulin (a and p chains) remains unknown. The sequence alignment analysis (PBLAST) indicates an identity of 86,98 and 88,32 % between the a and p chains of the Tubulin of G. lamblia and B. taurus (PDB: 5NQT). Homologous Modeling of the protein structure of G. lamblia Tubulin using the B. taurus Tubulin as a template employing the SWISS-MODEL server, generated a protein structure with the fol-lowing parameters: z-core = -1,16 and -1,41, QMEANscore6 = 0,71 and 0,70, % of reli-ability (from Ramachandran plots) = 96,08 y 96,95 %, RMS (Root Mean Square) = 0,081 and MOLPROBITYscore = 1,26. These parameters indicate that the protein structure of G. lamblia Tubulin obtained from Homol-ogy Modeling is of good quality, therefore, this structure could be used in further eval-uations, such as the in silico analysis of anti-Giardia compounds.

INTRODUCCIÓN

La Giardiasis es una de las infecciones parasíticas más comunes en todo el mundo y con mayor prevalencia en países en desarrollo como el nuestro (Koehler et al., 2013 y Almirall et al., 2013). Esta infección es ocasionada por Giardia intestinalis (conocido también como Giardia lamblia), que es un pro-tozoario, flagelado de simetría bilateral, extracelular, anaerobio, binucleado y piriforme (Adam, 2001) (Figura 1). Se estima que cerca de 200 millones de personas se infectan anualmente por G. lamblia en Asia, África y América Latina (Alparo, 2005).

Existen muchas drogas para el tratamiento de la parasitosis, de diferente eficacia y efectos adversos (Lalle, 2010; Gardner y Hill, 2001; Granados et al., 2012). En la búsqueda de nuevas terapias antigiardiales, varias sustancias naturales han sido evaluadas (Freitas et al., 2006; Harris et al., 2000; Machado et al., 2010 y Rufino-Gonzalez et al., 2012). Los curcuminoides presentes en la cúrcuma han sido utilizados para el tratamiento de diferentes patologías (Araujo y Leon, 2001; Aggarwal et al., 2007). La curcumina, uno de los principales componenets bioactivos de las rizomas de la cúrcuma, posee un amplio rango de propiedades farmacológicas incluyendo actividades antioxidantes e antiinflamatorias (Aggarwal et al.., 2007; Araujo y Leon, 2001; Cheng et al., 2001; Padilla et al., 2013). Muchos estudios han reportado el efecto antiparasitario de la curcumina contra Leishmania spp., Cryptosporidium parvum, Plasmodium falciparum, Giardia Lamblia y otros. En modelos animales infectados con G. lamblia, la curcumina produce una considerable disminución en el número de trofozoitos en secciones intestinales (Said et al., 2012). Otros estudios demostraron que la curcumina inhibe la polimerización de los mi-

crotubulos por un mecanismo distinto al de la colchicina (Gupta et al., 2006). Además, Chakraborti et al. (2011) determinó experimentalmente (mediante la técnica de Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) que el sitio de unión de la curcumina se encuentra alrededor de 32Å lejos del sitio de unión de la colchicina pero cerca del sitio de unión de la vinblastina.

El citoesquelo de G. lamblia, constituido principalmente por filamentos de actina, microtúbulos (Tubulina alfa y beta) y proteínas conocidas como giardi-nas, ha sido ampliamente estudiado por métodos como la inmunofluorescen-cia (Matadamas-Martínez e Iglesias-Osores, 2018). Sin embargo, la estructura cristalográfica de la Tubulina de G. lamblia (cadenas a y (3) permanece desconocida. El análisis cristalográfico constituye un paso importante para poder dilucidar y evaluar el sitio de unión de posibles moléculas antiparasitarias como la curcumina y otros derivados de interés terapéutico.

En estudios realizados por Gutierrez-Gutierrez et al. (2017), utilizaron el Modelamiento de proteínas por Homología como método in silico para obtener un modelo estructural de la Tubulina de G. lamblia a partir de su secuencia de aminoácidos, utilizando como molde a la estructura cristalográfica de la Tubulina de Bos taurus (PDB:1SA0; resolución = 3,58 Å) almacenada en la base de datos Protein Data Bank (PDB) (Ravelli et al., 2004). No obstante, en estudios recientes (Weirnert et al., 2017) se pudo obtener la estructura cristalográfica de la Tubulina de B. taurus con mejor resolución (PDB:5NQT; resolución = 2,15 Å) mediante una técnica más sofisticada, basada en la cristalografía serial en milisegundos utilizando una fuente de luz sincrotón a temperatura ambiente. El presente trabajo se enfoca en realizar el Modelamiento por Homología de la estructura proteica de la Tubulina de G. lamblia utilizando como molde a la Tubulina de B. taurus con mejor resolución (PDB:5NQT) mediante el servidor SWISS-MODEL.

MATERIALES Y MÉTODO

Ya que en la actualidad, la estructura cristalográfica de la Tubulina de G. lamblia no se encuentra disponible, las estructuras tridimensionales de la Tubulina α y β fueron construidas por el principio de Modelamiento por Homología.

La secuencia de aminoácidos de la Tubulina-ct (GenBank número de acceso ESU39295.1) (Adam et al., 2013) y la Tubulina-p (GenBank número de acceso EDO79714.1) (Kirk-Mason et al., 1988) de Giardia lamblia, fueron utilizadas para análisis de alineamiento de secuencias mediante Protein Basic Local AlignmentSearch Tool-NCBI - NIH(PBLAST) con la secuencia de la Tubulina de B. taurus (5NQT_A y 5NQT_B, respectivamente) para determinar el porcentaje de similitud entre ambas e inferir el grado de homología.

En este estudio, llevamos a cabo el proceso de Modelamiento por Homología con el servidor SWISS-MODEL (Biasini et al., 2014). Se empleó la estructura cristalográfica de la Tubulina de B. taurus (PDB:5NQT) (Weirnet et al., 2017) como molde. Ambos modelos monoméricos obtenidos (a y p) fueron evaluados individualmente según el QMEANscore6 (Benkert et al., 2009 y 2011) para obtener una estimación de la calidad global y local de los modelos. Se obtuvieron los diagramas de Ramachandran correspondientes a cada cadena (a y p) para determinar el % de confiabilidad basado en el número de residuos que ocupan regiones favorecidas y el número de residuos con valores atípicos; mientras que, la calidad de la geometría del modelo proteico final fue analizada utilizando el servidor MOLPROBITY (Chen et al., 2010).

Finalmente se realizó el alineamiento estructural entre la estructura final de la Tubulina de G. lamblia obtenida por modelamiento y la estructura de la Tubulina de B. taurus (PDB:5NQT; molde) con el programa PyMol para evaluar la calidad de las posiciones atómicas entre ambas estructuras.

RESULTADOS

Alineamiento de secuencias (PBLAST)

Tubulina-α.

Tubulina-β.

El análisis del alineamiento de secuencias entre las cadenas β de la tubulina
de G. lamblia y B. taurus mediante PBLAST, indica una identidad del 88,32 %. El E-value es tan bajo que descarta el azar en el número de aciertos tras el alineamiento entre ambas secuencias (Figura 3).

Modelamiento de la Tubulina de G. lamblia.

Con base en el análisis de PBLAST, se utilizó como molde estructural a la estructura cristalográfica de la Tubulina de B. taurus (PDB:5NQT) para modelar la estructura proteica de la Tubulina de G. lamblia a partir de su secuencia de aminoácidos con el servidor SWISS-MODEL (Figura 4A y B). El análisis de los diagramas de Ramachandran de los modelos de cadenas a y (3 de la Tubulina, indican una confiabilidad mayor al 95 % en ambas cadenas (Figura 4C y D). Adicionalmente, el Z-score (-1,16 y -1,41) y el QMEANscore6 (0,71 y 0,70) para ambas cadenas respectivamente, alcanzaron valores aceptables (Benkert et al., 2008) para que este modelo estructural proteico de la Tubulina de G. lamblia sea adecuado en futuros estudios como el análisis de acoplamiento molecular (Molecular Docking).

El análisis de la superposición de la estructura de la Tubulina de G. lam-obtenida por modelamiento con la Tubulina de B. taurus utilizada como molde, muestra que la desviación cuadrática media de las posiciones atómicas entre ambas estructuras es de: RMS (Root Mean Square) = 0,081. Valores cercanos a 0 indican que ambas estructuras tienen una distribución espacial muy similar (Figura 5A).

Por otro lado, la estructura proteica modelada fue analizada mediante la plataforma MOLPROBITY para añadir los átomos de hidrógeno colocados en posiciones de nubes electrónicas favorecidas, así, la His118 y 396 fueron girados automáticamente para adquirir posiciones más favorables. La puntuación de MolProbity final obtenida fue de 1,26 (Figura 5B).

DISCUSIONES

El alineamiento de secuencias (PBLAST) de las cadenas α y β de la Tubulina de G. lamblia con las cadenas α y β de Bos taurus alcanzaron un % de identidad del 86,98 y 88,32 respectivamente, estos valores son similares a los reportados por Gutierrez-Gutierrez et al. (2017) (87,06 y 88,04 %). Tras el Modelamiento por Homología, se obtuvo una estructura dimérica con un esquema de colores de acuerdo al z-score basado en QMEANscore6 que es un estimador compuesto, que compara las diferentes propiedades geométricas de la proteína, proporciona estimaciones de calidad locales (es decir, residuo por residuo) como globales (para toda la estructura) en comparación con un único modelo.

El QMEANscore6 resulta de la combinación linear de 6 términos estadísticos potenciales: el potencial de interacción entre los átomos Cβ solamente, todos los átomos, el potencial de solvatación, el potencial del ángulo de torsión y dos términos de coincidencia que evalúan la consistencia de las características estructurales con predicciones basadas en secuencias. Este valor tiene un rango de 0 a 1 (siendo el 1 como ideal). La estructura proteica de la Tubu-lina de G. lamblia obtenida por modelamiento obtuvo un QMEANscore6 de 0,71 y 0,70 (para ambas cadenas) que son valores más cercanos a 1 en comparación con otros estudios (0,660 y 0,577) (Gutierrez-Gutierrez et al., 2017).

Por defecto, QMEANscore6 es transformado en términos de z-scores para relacionar los puntajes obtenidos con los que esperaríamos de estructuras de rayos-x de alta resolución. El z-score representa el grado de "natividad" del modelo proteico generado, indica si el QMEANscore6 del modelo es comparable con lo que uno esperaría de estructuras experimentales de tamaño similar. Z-scores cercanos a cero indican una buena coincidencia entre la estructura obtenida por modelamiento y estructuras experimentales de tamaño similar, valores por debajo de -4,0 indican que el modelamiento fue de baja calidad. La estructura de Tubulina obtenida por modelamiento obtuvo valores globales de -1,16 y -1,41; considerados como aceptables y de mejor calidad en comparación con otros estudios (-1,275 y -2,257) (Gutierrez-Gutie-rrez etal., 2017).

Con relación a la calidad de la geometría del modelo proteico final obtenido para la Tubulina de G. lamblia, la puntuación general de MOLPROBITY fue de 1,26 basado en: el análisis de la combinación de los puntajes obtenidos en la evaluación de posibles choques entre todos los átomos (número de superposiciones estéricas serias) (clashscore), el porcentaje de aminoácidos no favorecidos en los diagramas de Ramachandran y el porcentaje de rotame-ros de cadena lateral de mala calidad. Éste valor es menor a la resolución de la proteína cristalográfica utilizada como molde (2,15 Å), por lo tanto, una estructura con un puntaje de MOLPROBITY numéricamente menor que su resolución cristalográfica reales, en términos de calidad, mejor que la estructura promedio en esa resolución.

Todos los parámetros estructurales evaluados indican que, la estructura proteica de la Tubulina de G. lamblia obtenida por modelamiento con base en la homología de secuencias, es apropiada para ser utilizada (in silico) como posible blanco proteico. Así, se hará posible evaluar diferentes moléculas (como la curcumina y sus derivados) que hayan demostrado potencial actividad antigiardia en ensayos clínicos o de cultivo in vitro.

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