Comparación de tres métodos de recuento de
Staphylococcus aureus en queso fresco de expendio en los
mercados populares de la ciudad de La Paz-Bolivia
Comparison of three methods of counting Staphylococcus aureus in fresh cheese
for sale in the central markets of the city of La Paz-Bolivia
]]> APAZA PACO, JUAN PABLO1 ESPADA SILVA, ANGÉLICA MARIA1
Resumen
Staphylococcus aureus puede contaminar una gran gama de alimentos, constituyéndose el queso fresco en un buen medio diferencial y selectivo para el desarrollo de este microorganismo. La intoxicación estafilocóccica trasmitida por alimentos, resulta de la ingesta de entero-toxina termoestable preformada en el alimento que fue generada por una cepa toxigénica de Staphylococcus aureus llegando a constituirse en un riesgo para la salud de los consumidores. El presente estudio tiene el objetivo de comparar tres métodos: i) ISO 6888-1:2003 ii) NB 32004:2004y iii) Placas secas rehidratables (Placas Petrifilm) para el recuento de Staphylococcus aureus en queso fresco de expendio en los mercados populares de la ciudad de La Paz.
La comparación entre el método de cultivo convencional empleando medio Agar Baird Parker y el método alternativo por placa seca rehidratable fue hecha por medio del muestreo al azar de 30 muestras de queso fresco, el análisis fue hecho por los tres métodos métodos, donde por el método de placa seca rehidratable 10 muestras se encontraban dentro de norma y 20 se encontraban fuera de norma; por medio del método de cultivo convencional 22 muestras se encontraban en norma y 8 fuera de norma. Concluyendo que el método de placa seca rehidratable es más sensible y fácil de aplicar en comparación con el método convencional según norma Bolivia y norma ISO.
PALABRAS CLAVE. Staphylococcus aureus, queso fresco, placa seca rehidratable, cultivo convencional.
Abstract
]]> Staphylococcus aureus can contaminate a wide range of foods, constituting fresh cheese in a good differential and selective medium for the development of this microorganism. Staphylococcal foodborne poisoning results from the intake of thermostable enterotoxin preformed in the food thatwas generated by a toxigenic strain of Staphylococcus aureus, becoming a risk to the health of consumers. The present study has the objective of com-paring three methods: i) ISO 6888-1: 2003 ii) NB 32004:2004 and iii) Dry rehydratable plates (Petrifilm plates) for the recount of Staphylococcus aureus in fresh cheese for sale in popular markets from the city of La Paz.The comparison between the conven-tional culture method using Baird Parker Agar medium and the alternative method by rehydratable dry plate was made by random sampling of 30 samples of fresh cheese, the analysis was done by the three methods methods, where by the method dry rehydratable plate 10 samples werewithin norm and 20wereout of norm; By means of the conventional cultivation method, 22 samples were in standard and 8 out of norm. Concluding that the rehydratable dry plate method is more sensitive and easier to apply compared to the conventional method according to the Bolivia standard and ISO standard.
KEY WORDS. Staphylococcus aureus, fresh cheese, rehydratable dry plate, conventional culture.
INTRODUCCIÓN
Staphylococcus aureus es un microorganismo que está presente de forma natural en la leche y los productos lácteos y está a menudo asociado con las enfermedades transmitidas por los alimentos debido a la capacidad de algunas cepas para producir enterotoxinas termoestables (Nogueira et al., 2010). La intoxicación estafilocóccica trasmitida por alimentos, resulta de la ingestión de enterotoxinas termoestables preformadas generadas por una cepa toxigénica de Staphylococcus aureus que contaminó y desarrolló en un alimento.
La incidencia es desconocida pero es probablemente una de las causas más frecuentes de intoxicación trasmitida por alimentos; entre los alimentos implicados más frecuentemente se encuentran: queso fresco, huevo, carne de pollo, crema helada (Augustin et al., 2006).
La afección se conoce como intoxicación alimentaria estafilocócica (IAE) (Bird et al., 2014). S. aureus es la especie más característica del género que entre sus numerosos factores de virulencia se encuentran las enterotoxinas estafilocócicas (SE). Las enterotoxinas estafilocócicas constituyen un grupo heterogéneo de proteínas solubles en agua, presentan un peso molecular bajo que oscila entre 26 kDa y 30 kDa, pueden mantenerse estables incluso al calentar los alimentos más de 100 °C durante 30 minutos esto por la presencia de enlaces disulfuro, mostrando también resistencia a la hidrólisis por enzimas gástricas y pancreáticas (Bird et al., 2014).
La contaminación de alimentos por S. aureus, está asociada con una forma de gastroenteritis que se manifiesta clínicamente por un cuadro caracterizado por vómitos (76% de casos) y diarrea (77% de casos). El corto período de incubación de 1-6 horas orienta a la sospecha de intoxicación producida por ingestión de enterotoxinas preformadas en el alimento. Si bien son raramente observados signos de toxicidad sistémica, tales como fiebre e hipotensión En general, es un cuadro autolimitado que típicamente se resuelve en 24- 48 horas desde el inicio (Caballero et al., 2015). El 99% de casos de intoxicación alimentaria por enterotoxinas estafilocóccicas está asociado a S. aureus y ocasionalmente se reportan casos por Staphylococcus epidermidis.
]]> En el presente trabajo se compararon tres métodos: dos métodos convencionales y un método alternativo: i) ISO 6888-1:2003 ii) NB 32004:2004 y iii) Placas secas rehidratables (Placas Petrifilm) para el recuento de Staphylococcus aureus en queso fresco de expendio en los mercados centrales de la ciudad de La Paz.
MATERIALES Y MÉTODOS
Matriz a ser analizada
Las muestras de queso fresco de elaboración artesanal fueron adquiridas de diferentes mercados populares de la ciudad de La Paz en un número de 30 unidades por muestreo al azar, donde se registraron: la temperatura, descripción del entorno, sí existía la presencia de vegetales, frutas, legumbres, embutidos; tomando en cuenta si su expendio era en el suelo o en tarima. Como el expendio de quesos frescos de elaboración artesanal es expuesta al aire libre y a otros contaminantes, los recipientes para la recolección de muestras se abrieron únicamente en el momento de introducir las muestras y cerrarlos de inmediato. Se identificaron las muestras por códigos numéricos, asegurando que cada muestra este correctamente identificada. Las muestras fueron conservadas a 4°C hasta su análisis en el laboratorio.
Recuento de Staphylococcus aureus de acuerdo a la norma ISO 6888-1: 2003.
En una bolsa stomacher estéril, se procedió a pesar 25g de muestra, se realizaron diluciones decimales en agua peptonada llegando hasta un factor de dilución de 10-2. Hechas las diluciones se procedió a inocular la dilución 10-2 un volumen de 0,1 mL por duplicado sobre la superficie de Agar Baird Parker, se distribuyó el inoculo con la ayuda de un asa de Drigalsky, posteriormente se incubaron las placas a 35°C durante 48hrs. Pasado este tiempo las colonias características de Staphylococcus aureus fueron a confirmadas con las pruebas de la coagulasa y DNasa.
Recuento de Staphylococcus aureus de acuerdo a la NB 32004:2004.
En una bolsa stomacher estéril, se procedió a pesar 25g de muestra, inmediatamente se añadieron 225mL de agua peptonada obteniéndose una dilución 10-1, de ahí se realizaron diluciones seriadas llegando a 10-2; 10-3. Hechas las diluciones se procedió a inocular un volumen de 0,3mL de la dilución 10-3 en dos placas y un volumen de 0,4mL en una tercera placa sobre la superficie de Agar Baird Parker, se distribuyó el inoculo con la ayuda de un asa de Drigalsky, posteriormente se incubaron las placas a 35°C durante 48hrs. Como procedimiento confirmatorio para determinar la identidad del analito de interés, se realizó la prueba de coagulasa y DNasa. Tomando en cuenta el criterio de recuento presuntivo descrito en la tabla 1.
]]> Recuento de Staphylococcus aureus por placa seca rehidratable (Placas Petrifilm)En una bolsa de stomacher estéril, se pesaron 25 gramos de la muestra, posteriormente se agregaron 225 ml de agua peptonada obteniendo un factor de dilución de 10-1, posteriormente se ubicaron las placas en una superficie plana y lisa. Se elevó la lámina superior y se inoculo 1mL de la dilución en el centro de la placa Staph Express sin hacer burbujas, distribuir con el esparcidor plano en el centro de la placa para distribuir la muestra de manera uniforme, finalmente se incubaron las placas a 35°C por 24 horas.
Transcurrido el tiempo de incubación se contaron las colonias rojo-violetas. No se contó las colonias azules o verdosas porque estas no responden a ser Staphylococcus coagulasa positivos.
RESULTADOS
Figura 1, muestra que los quesos objetos de este estudio proceden de Guaqui con un porcentaje del 30%, seguido de Patacamaya con un 23,3%. Siendo las comunidades que proveen de queso fresco a los mercados centrales de la ciudad de La Paz.
Recuento de Staphylococcus aureus aplicando norma ISO 6888-1:2003
Figura 2, podemos observar que por el método de cultivo convencional ISO 6888-1:2003 que de las 30 muestras analizadas un 77% de las muestras analizadas se encuentran en norma y el 23% de las muestras presenta un recuento >10 UFC/g de Staphylococcus aureus (NB: 33009: 2003). De acuerdo al estadístico Chi-cuadrado (x2) con 8 grados de libertad no existe significancia estadística x2 13,9286 < 15,51 que la presencia de Staphylococcus aureus no se encuentra relacionado al mercado de expendio.
]]> Recuento de Staphylococcus aureus aplicando norma boliviana 32004:2004.Figura 3, podemos observar que por el método de cultivo convencional NB 32004:2004, que de 30 muestras analizadas un 73% de las muestras analizadas se encuentran en norma y el 27% de las muestras presenta un recuento >10 UFC/g de Staphylococcus aureus (NB: 33009: 2003). De acuerdo al estadístico Chi-cuadrado (x2) con 8 grados de libertad no existe significancia estadística X2 13,9286 < 15,51 (x2 tabulado Software minitab16), que la presencia de Staphylococcus aureus no se encuentra relacionado al mercado de expendio.
Recuento de Staphylococcus aureus aplicando placa seca rehidratable.
Figura 4, se puede observar que por el método de cultivo en placa seca rehidratable que de las 30 muestras analizadas solo el 33% de las muestras se encuentran en norma y el 67% de las muestras presenta un recuento >10 UFC/g de Staphylococcus aureus (NB: 33009: 2003). De acuerdo al estadístico Chi-cuadrado (x2) con 8 grados de libertad no existe significancia estadística X2 13,9286 < 15,51 (x2 tabulado Software minitab16), que la presencia de Staphylococcus aureus no se encuentra relacionado al mercado de expendio.
Figura 5.- Se muestra la interacción del porcentaje de las muestras que se encuentran en norma y fuera de ella por las metodologías, donde por medio del cultivo en placa seca rehidratable se obtuvo un 33% de muestras que están en norma y el 67% fuera de norma, por otro lado se observa que por el método de cultivo convencional se obtiene que el 77% de las muestras están en norma y solo el 23% fuera de norma.
DISCUSIÓN
]]> Se buscó evaluar el rendimiento en muestras naturalmente contaminadas, de modo que se optó por muestrear quesos frescos de elaboración artesanal porque los mismos carecen de controles de calidad estrictos, según Caballero (2015) y Beuchat (2016) que se encuentra trabajando con el método de placa seca rehidratable en alimentos comparando con el cultivo convencional, consiguieron resultados representativos en los ensayos realizados. Donde por análisis estadístico se obtuvo un p<0,05 comparando ambas metodologías, de modo que Caballero (2015) propone considerar el método de placa seca rehidratable como método alternativo para el análisis microbiológico de alimentos.Se observó que por medio del método de placa seca rehidratable se obtuvieron los resultados en menos tiempo y con menos mano de obra en comparación con el método de cultivo convencional, además que con la metodología de la placa seca rehidratable se pueden realizar recuentos de niveles bajos, que según Silva (2005) se debe a una mejor sensibilidad esto debido al volumen del inoculo de la muestra que es de 1 mL y la presencia del agente cromógeno,
Por otro lado Beuchat (2016) quien hace mención que el recuento por placa seca rehidratable se facilita por la presencia del azul de o-toluidina que facilita la visualización de la reacción de desoxirribonucleasa (DNasa) organismos DNasa positivos son S. aureus, S. intermedius y S. hyicus. Estos tres microorganismos representan la mayoría del grupo de organismos comúnmente conocidas como estafilococos coagulasa positiva. De modo que el recuento en placa seca rehidratable consiste en contar solamente las colonias rojo violeta. Por lo citado anteriormente solo se debería citar el análisis de un alimento como recuento de Staphylococcus spp., porque Staphylococcus aureus no es el único microrganismo coagulasa positivo que podría estar presente en queso u otra matriz.
La variación en los recuentos por las tres metodólogas posiblemente se deba a varios factores como el inóculo de la muestra, en la NB de 1mL esta fraccionada en tres (0.3mL; 0,3mL y 0,4mL) y en el caso de norma ISO, el volumen de inoculo es de 0,1 mL. (Sí por ejemplo tenemos una matriz con 100 UFC/g, al hacer la dilución 10-1 solo se tendrá 10 UFC/g en la dilución y de acuerdo a la norma ISO se sembró 0,1 mL por duplicado, en este caso se tendría que esperar el desarrollo de una colonia de Staphylococcus aureus), se debe de tomar en cuenta que las matrices alimenticias cuentan con una microbiota variada propia, lo que ocasionaría que se emita un recuento erróneo. En el caso del recuento por el método de placa seca rehidratable es de 1mL evitándose este fraccionamiento que conlleva a ser un punto crítico cuando no se cuenta con personal calificado y que además el recuento es más sencillo por la presencia del agente cromogénico que poseen las placas.
CONCLUSIÓN
A la conclusión a la que se llega en el presente trabajo por los resultados obtenidos es de indicar que la metodología alternativa (placas secas rehidratables) comparada con la metodología convencional llega a identificar productos alimenticios que no cumplen con los requisitos de inocuidad alimentaria, presentando mejores cualidades con respecto a su aplicación y su grado de sensibilidad.
AGRADECIMIENTOS
A la empresa 3M por proporcionarnos los insumos y al instituto SELADIS por brindarnos los ambientes para realizar el presente trabajo.
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