Evaluacion de la toxicidad aguda y la actividad diurética de la especie Lachemilla pinnata en animales de experimentación
AYCA, DARIO1 FLORES, ESTHER1 GONZALES, EDUARDO1 ARIAS, JUAN1
1 Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés. Av. Saavedra N° 2224, Miraflores, La Paz-Bolivia
CORRESPONDENCIA: JUAN LUÍS ARIAS MIRANDA JANLUIAR@HOTMAIL.COM.
FECHA DE RECEPCIÓN: 16 DE ABRIL DE 2014
FECHA DE ACEPTACIÓN 30 DE JULIO DE 2014
Resumen
El efecto diurético y la toxicidad aguda del extracto hidroalcohólico de Lachemilla pinnata (sillu, sillu) planta medicinal utilizada tradicionalmente en Bolivia, fue investigado en ratones y ratas.
El extracto hidroalcohólico de Lachemilla pinnata (EHA-Lp) en dosis de 100, 500 y 1000 mg/kg de peso corporal fue administrado por vía oral a ratones machos, hembras y ratas hembras para la determinación de la toxicidad aguda (DL50), efectos sobre el comportamiento general de ratones y evaluación de la influencia del extracto sobre el volumen de excreción urinaria según el método descrito por Wiebelhaus (1965).
Los resultados revelaron que el extracto no provoca toxicidad aguda (DL50 mayor a 3000 mg/kg) hasta la dosis máxima ensayada. No se evidenciaron efectos significativos sobre el comportamiento general en los ratones excepto la presencia de inhibición al estímulo doloroso así conducta pasiva y temerosa.
El efecto diurético generado por el EHA-Lp con dosis 100 y 1000 mg/kg, tanto en ratones como ratas mostraron niveles de significancia p<0.01 en comparación al grupo control (suero fisiológico) produciendo un efecto similar al ejercido por el fármaco patrón Furosemida.
En conclusión el extracto hidroalcohólico de Lachemilla pinnata presenta efecto diurético comparable al fármaco patrón Furosemida con un perfil toxicológico favorable.
Palabras clave
Lachemilla pinnata, diurético, toxicidad aguda, plantas medicinales, hipertensión arterial.
The diuretic effect and acute toxicity of the hydroalcoholic extract Lachemilla pinnata (Sillu Sillu) medicinal plant traditionally used in Bolivia, was investigated in mice and rats.
The hydroalcoholic extract of Lachemilla pinnata (EHA -Lp) at doses of 100, 500 and 1000 mg / kg body weight was orally administered to male mice, female and female rats to determine the acute toxicity (LD50), effects on the general behavior of mice and assessment of the influence of the extract on the volume of urinary excretion by the method described by Wiebelhaus (1965).
The results revealed that the extract does not cause acute toxicity (LD50 greater than 3000 mg / kg) up to the maximum dose tested. No significant effects on the overall behavior in mice except the presence of painful stimuli and inhibition passive and fearful behavior were evident.
The diuretic effect generated by the EHA-Lpatdoses100to 1000 mg/kg, both in mice and rats showed significance levels p <0.01 compared to control group (physiological saline ) were produced similar to that exerted by the standard drug Furosemide effect.
In conclusion the hydroalcoholic extract Lachemilla pinnata has diuretic effect comparable to standard drug Furosemide with a favorable toxicity profile.
Key words
Lachemilla pinnata, diuretic, acute toxicity, medicinal plants, hypertension.
]]> INTRODUCCION
La hipertensión arterial es una enfermedad de alta prevalencia en todo el mundo y es la más sobresaliente entre las enfermedades cardiovasculares (Varela., 2007). Esta patología está presente en el 35% de todos los eventos cardiovasculares ateroscleróticos y en el 49% de todos los casos de falla cardíaca e incrementa el riesgo de eventos cerebro-vasculares (Padwal y col., 2001)
En Bolivia la hipertensión arterial tiene una prevalencia importante, que alcanza aproximadamente a un 23 % de la población general. (Mercado., 2005; Renjel., 2006).
Dentro del amplio grupo de fármacos utilizados en el tratamiento de la hipertensión arterial, se encuentran los diuréticos entre ellos la furosemida un diurético de alta eficacia natriurética indicada para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva (ICC), cirrosis hepática, enfermedad renal y manejo de pacientes con hipertensión arterial (Florez., 1998). Sin embargo su utilización puede generar en muchos casos efectos adversos asociados con este diurético como la reducción de los flujos sanguíneos renal, cerebral y cardiaco; la perdida de potasio con alteraciones cardiacas y neuromusculares, aumento del nivel sérico de ácido úrico y el nivel sanguíneo de glucosa; reacciones alérgicas; dermatitis exfoliativa en raros casos; prurito, trombocitopenia y leucopenia. Incluso se puede observar: parestesias, visión borrosa, hipotensión postural, nauseas, vómitos o diarrea. Además se han reportado efectos ototoxicos, (Gennaro, 2003).
Algunas especies vegetales como el Equisetum Bogotense, Costus pictus, Rosmarinus officinalis L son utilizadas tradicionalmente por su efecto diurético (Lemus et.al. 1996;; Melendez-Carmargo et. al. 2006; Martinez Martín et. al. 2004).
La especie vegetal Lachemilla pinnata planta autóctona de Bolivia de crecimiento endémico en las regiones andinas es comúnmente llamada Sillu sillu, Yurak, chchapi, churitika (Quechua), pichi pichi (Aymara) (Girault, 1987). Pertenece a la familia Rosaceae y es utilizada en la medicina tradicional boliviana para el tratamiento de diferentes enfermedades, entre ellas: afecciones renales, enfermedad de la vejiga, hígado, contra cólicos hepáticos, además de presentar actividad antiinflamatoria, analgésica, antiinfecciosa y antiséptica, (Girault, 1987).
Las partes más usadas de la planta son la fruta, hoja, tallo y raíz utilizadas en forma de baños de infusión, decocción, cataplasma y cocimiento de la hoja, (Girault 1987; De Lucca 1992).
El análisis fitoquímico de la especie pinnata realizada revela los siguientes componentes: fenílicos: Acido para -hidroxibenzoico, acido cafeico, Acido Cumárico, Acido ferúlico Acido siríngico. Flavonoides: Diarabinósido de quercetol, Glucósido de camferol. Acidos orgánicos como: ácido acético, malico, cítrico,oxálico, succínico. Triterpenos como la alfa y beta amirina y esteroles como el beta-sitosterol. (Yamagishi, 1988).
El presente estudio se realizo para determinar la toxicidad aguda y la actividad diurética en ratas y ratones de la especie Lachemilla pinnata, planta medicinal utilizada tradicionalmente en Bolivia para afecciones cardiovasculares.
]]> MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
La recolección de la especie Lachemilla pinnata se realizó en la población de Huatajata, Provincia Omasuyos del Departamento de La Paz a una altura aproximada de 4000m/snm en el mes de mayo de 2011. Un espécimen de la planta fue depositado en el Herbario Nacional de Bolivia para su autentificación.
Una cantidad de 4000 g del polvo obtenido de las partes aéreas de la planta se sometió a extracción hidroalcoholica (30:70) por maceración por un periodo de 96 horas. El macerado se filtro en papel filtro whatman N° 1, y el filtrado se concentró a presión reducida en un rotaevaporador para su posterior liofilización. El rendimiento obtenido fue de 12,2 % p/p
Animales
Se emplearon ratones albinos suizos cepa Swiss, adultos, hembras y machos con un peso promedio entre 20-30 g y ratas hembras albinos con peso promedio entre 250 y 300 g. Todos los animales fueron criados y mantenidos adecuadamente en el bioterio de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés, con ciclos de 12 horas luz y 12 horas oscuridad, con alimento y agua ad libitum. El número de animales utilizados para cada ensayo fue de 10 y se realizaron de acuerdo a las Normas de Ética de la Comunidades Europeas. (Diario Oficial de las Comunidades Europeas, 1998).
EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA EN RATONES
La determinación de la toxicidad por vía oral se realizó, con pequeñas modificaciones, según las recomendaciones del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) y la Organization for Economic Cooperation and Development, (Lapa, 2002; OECD, 2001).
Ensayo de DL50
]]> Se utilizaron grupos de 10 ratones (5 hembras y 5 machos) de peso promedio entre 20-30g, en ayunas de 6 horas, a los que se administró por vía oral el estracto hidroalcohólico de Lachemilla pinnata a dosis de: 1000; 2000; y 3000 mg/kg de peso corporal y a continuación se observaron cuidadosamente los efectos y la mortalidad durante un periodo de 24 horas. Se utilizó suero fisiológico (SF) para disolver los extractos y como solvente control.Efecto sobre el comportamiento general de ratones
Grupos de 10 ratones machos y hembras en ayunas de 6 horas recibieron dosis de 1000; 2000 y 3000 mg/kg de EHA-Lp por vía oral. Los ratones del grupo control recibieron el solvente (suero fisiológico) en una relación de 0,1 mL/10g de peso corporal.
Tras la administración del extracto se observaron diferentes parámetros comportamentales a los 30, 60,120, 240, 480 minutos y 24 horas. Los parámetros biológicos de regulación y control central (depresión o estimulación), de regulación autonómica y parámetros subjetivos fueron tabulados individuamente.
Determinación de la toxicidad subaguda aguda a dosis multiple
Se utilizaron grupos de ratones machos y hembras (N= 10; 20-30 g de peso corporal) en ayunas de 6 horas. Cada animal recibió 1000 mg/kg de EHA-Lp por vía oral una vez al día durante 14 días y el grupo control recibió suero fisiológico.
Se realizaron observaciones de los signos y síntomas de toxicidad hasta los 14 días. Se determinó el peso corporal de cada animal antes y durante el ensayo (1, 7 y 14 días) y el día 15 todos los animales fueron sacrificados en secuencia individual para realizar el estudio macroscópico de los principales órganos y se evaluó la influencia del extracto sobre el pesó del corazón, riñón, bazo, pulmones, hígado, estomago e intestinos.
Evaluación de la actividad diurética
La determinación de la actividad diurética se realizó según el método descrito por Wiebelhaus (1965). Se formaron 5 grupos de 10 ratones albinos suizos y ratas albinos. Al grupo I (Control) se administró solución fisiológica 0,1mL/10g de peso corporal. Los grupos II, III y IV recibieron por vía oral dosis de 100, 500 y 1000 mg/kg, del EHA-Lpy el grupo V recibió por vía intraperitoneal 20 mg/kg de Furosemida.
Luego de la administración, los animales fueron colocados de forma individual en jaulas metabólicas y se registró el volumen de orina acumulado a los 90 min y 24 horas. Se determinó luego el porcentaje de carga salina excretada y la acción diurética.
]]> Análisis estadísticoLos resultados se expresaron como promedio ± desviación estándar y el análisis estadístico de los datos fue realizado por la prueba paramétrica ANOVA de una cola a través del programa estadístico MINITAB 15 para Windows XP.
Niveles de probabilidad menores a p<0,05 y p<0,01 fueron considerados como estadísticamente significativos.
RESULTADOS
Toxicidad aguda (DL50)
La administración oral de dosis de 1000, 2000 y 3000 mg/kg de EHA-Lp no provocó mortalidad ni síntomas de toxicidad en los animales, lo que indica que DL50 es superior a la dosis máxima empleada (3000 mg/Kg).
Efecto sobre el comportamiento general de ratones.
En general no se observó marcados efectos sobre el comportamiento de ratones hembras y machos. Sin embargo el extracto indujo inhibición al estimulo doloroso, conducta pasiva y conducta temerosa, hasta los 60 minutos post administración con dosis de 2000 y 3000 mg/kg. Estos efectos fueron disminuyendo y la inhibición al estímulo doloroso con dosis de 3000 mg/kg se observó únicamente hasta los 240 minutos.
Determinación de la toxicidad subaguda aguda a dosis multiple
]]> Los ratones hembras y machos tratados diariamente con dosis de 1000 mg/kg de EHA-Lp hasta los 14 días no mostraron ningún signo o síntoma de toxicidad. El peso corporal se mantuvo dentro los parámetros normales y si bien el peso del corazón, estomago, hígado en ratones hembras y del intestino e hígado en ratones machos aumentó significativamente respecto al grupo control. Sin embargo esta diferencia no ha generado los signos y síntomas característicos de un efecto toxico.Evaluación de la actividad diurética
Respecto de esta actividad el EHA-Lp aumentó significativamente el porcentaje de carga salina con dosis de 500 y 1000 mg/kg (p < 0.05; p < 0.01 respectivamente) en ratones hembras y con 100 mg/kg en ratones machos en comparación al grupo control. El incremento de la acción diurética fue significativa (p < 0.01) con dosis de 100,500 y 1000 mg/kg tanto en ratones hembras y machos hasta las 24 horas. Estos resultados se muestran en la tabla N° 1.
El EHA-Lp con dosis de 100 mg/kg produjo un aumento significativo (p < 0,05) del volumen de excreción urinaria en ratones machos hasta las 24 horas post administración del extracto en comparación al grupo control (solución fisiológica). Estos resultados se muestran en el grafico N° 1
En ratones hembras el EHA-Lp con dosis de 1000 mg/kg aumentó significativamente (p < 0,01) el volumen de excreción urinaria hasta las 24 horas respecto al grupo control (SF). Estos resultados se muestran en el gráfico N° 2.
En gráfico N°3 se muestra la influencia de la administración del EHA-Lp en ratas hembras. Se puede observar que hasta las 24 horas post administración, el extracto produjo un aumento significativo del volumen de excreción urinaria con dosis de 500 y 1000 mg/kg (p < 0,05 y p < 0,01 respectivamente) en comparación al grupo control.
]]>DISCUSIONES
Se realizó el estudio toxicológico y farmacológico de la especie Lachemilla pinnata a fin de determinar el efecto diurético y evaluar su toxicidad. Las referencias de uso popular indican que la especie Lachemilla pinnata es utilizada en la medicina tradicional boliviana para el tratamiento de diferentes enfermedades, entre ellas: afecciones renales (Girault., 1987).
Los resultados revelaron que el extracto no manifiesta toxicidad aguda, pues no se evidenció mortalidad hasta 24 horas de observación,por lo tanto se considera que la DL50 corresponde a un nivel de dosis superior a 3000 mg/kg de peso corporal (dosis máxima ensayada). No se evidenciaron efectos significativos sobre el comportamiento general en los ratones, excepto la presencia de inhibición al estimulo doloroso, conducta pasiva y temerosa en una fase inicial del estudio, los cuales desaparecieron en el transcurso del experimento.
La inhibición al estímulo doloroso observado en los ratones puede estar asociado a un posible efecto a nivel del sistema nervioso central, que en repuesta a la exposición de condiciones de estrés en los animales de experimentación se podría producir la liberación en la adenohipófisis, de la hormona CRH la que estimula la secreción de la pendorfina, un péptido opiáceo responsable de la analgesia asociada al estrés, (Kofman 2002; Teague y cols., 2007).
La presencia de conducta pasiva y temerosa observada en los ratones hasta los 60 minutos podría deberse a las condiciones experimentales de manipulación en el laboratorio que podría influir en conducta, fisiología y sistema inmune (Ottenweller, 2000).
Según el ensayo de toxicidad a dosis continua por 14 días, no se observó cambios significativos sobre la actividad autonómica, refleja o central. Tampoco se observaron diferencias significativas del peso corporal hasta el final del tratamiento (14 días) y no se registraron cambios significativos en el peso de los órganos así como en la apariencia general de los mismos
La furosemida un diurético de asa de alta eficacia natriurética es ampliamente utilizado como fármaco patrón en modelos biológicos para la determinación de la actividad diurética de extractos vegetales medicinales, motivo por el cual se utilizó en este estudio como control positivo, (Camargo y col., 2004; Maghrani y col., 2005)
El efecto diurético producido por el EHA-Lp a dosis de 100 y 1000 mg/kg tanto en ratones hembras y machos así como ratas hembras es similar al efecto producido por la furosemida a dosis de 20 mg/kg, lo cual demuestra su actividad diurética. Estos resultados se correlacionan con el aumento significativo del porcentaje de carga salina excretada y acción diurética tanto para el fármaco patrón furosemida (p < 0.01) y el EHA-Lp con dosis de 500 y 1000 mg/kg (p < 0.05; p < 0.01 respectivamente) en comparación al grupo control (solución fisiológica).
Al parecer el inicio del efecto diurético de EHA-Lp es más lento comparado con la furosemida, lo que puede atribuirse a factores farmacocinéticos o farmacodinámicos de los principios activos de la planta (Hernán y col., 2006)
]]> Probablemente el efecto diurético producido por el EHA-Lp podría atribuirse a la presencia de metabolitos secundarios como: aceites esenciales, flavonoides, saponósidos y sales de potasio, (Arteche y col., 1998). Con referencia al probable mecanismo de acción, algunos aceites esenciales, saponósidos y flavonoides podrían actuar a nivel glomerular (más que en el túbulo), provocando un aumento de la circulación renal e incrementando así la tasa de filtración glomerular y la formación de orina primaria, (Arteche y col., 1998; Cañigueral y col., 1998).En conclusión, el extracto hidroalcoholico de Lachemilla pinnata presenta actividad diurética comparable a la furosemida, con un perfil toxicológico favorable.
AGRADECIMIENTOS
Al Bioterio de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas de la Universidad Mayor de San Andrés, por la dotación de los reactivos biológicos.
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