Evaluación de Trichoderma spp. y Acibenzolar-S-Metil (Bion^®) como inductores de resistencia a la pudrición blanca Sclerotium cepivorum Berk. en Ajo (Allium sativum L.) bajo condiciones controladas

Evaluation of Trichoderma spp. and Acibenzolar-S-Methyl (Bion^®) as resistance inducers in Garlic (Allium sativum L.) against white rot Sclerotium cepivorum Berk. under controlled conditions

Jiménez María A¹, Arcia M. Asdrubal², Ulacio Dilcia¹, Hernández Alexander¹. Méndez Naileth¹

¹Centroccidental Lisandro Alvarado, Laboratorio de Fitopatología, Estado Lara Venezuela.
²Universidad Central de Venezuela, estado Aragua, Venezuela. Laboratorio de Biología Molecular de la UCLA – Apartado 400 3001 Lara. Venezuela Telf. (0251) 259.2490-259.2493.  Fax. (0251) 259.2571.

*Dirección de contacto: María A Jiménez.
Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Laboratorio de Fitopatología, estado Lara Venezuela. Apartado 400 3001 Lara. Venezuela Telf. (0251) 259.2490 – 259.2493. Fax. (0251) 259.2571.

Correo electrónico: mjimeneztamayo@gmail.com

Historial del artículo 

Recibido junio, 2013.
Devuelto octubre 2013 ]]> Aceptado noviembre, 2013.
Disponible en línea, noviembre 2013

Resumen

Para determinar el efecto de Trichoderma koningiopsis y Bion^® como inductores de resistencia sistémica a la pudrición blanca del ajo causada por Sclerotium cepivorum, se estableció un ensayo bajo condiciones controladas. El experimento se realizó bajo un diseño en bloques al azar para un total de ocho tratamientos con cuatro repeticiones por tratamiento. Se determinó sobre tejido foliar las actividades enzimáticas peroxidasas, polifenol oxidasas y ß-1,3-glucanasas así como la expresión isoenzimática de peroxidasas. Los resultados mostraron que los cambios en las fracciones proteicas de las plantas tratadas con los inductores evidenciaron que la resistencia inducida fue expresada tanto a nivel local como sistémica. Las alternativas donde se emplearon los elicitores de forma combinada, lograron  inducir  la expresión de las enzimas peroxidasas, polifenol oxidasas y glucanasas a los 5 y 9 dpi revelando que esos períodos son cruciales para la activación de los mecanismos de defensa. La expresión de los perfiles electroforéticos mostraron que la  respuesta  defensiva de la planta cuando se emplearon el inductor biótico y abiótico fue más intensa y perduró por mayor tiempo cuando se comparó con las plantas tratadas con el químico solo. Se requiere de investigaciones adicionales para determinar si la IR provocada por los inductores usados pueden ser superados con otras dosis, compuestos y momentos de aplicación y si dichas respuestas están influenciadas por el genotipo del hospedante y/o las condiciones ambientales.

Palabras clave: Resistencia inducida, peroxidasas, polifenol oxidasas, ß-1, 3-glucanasas, proteínas PR.

Abstract

To evaluate the effect of Trichoderma koningiopsis and Bion^® to induce systemic resistance to white rot caused by Sclerotium cepivorum in garlic, an experiment was set under controlled conditions using a randomized block design for a total of eight treatments with four replicates per treatment. Enzyme activities of peroxidases, polyphenol oxidases and β-1,3-glucanases and peroxidase isozyme expression were determined on leaf tissue . The results showed that changes in the protein fractions of treated plants indicated that the induced resistance was expressed both locally and systemically. Alternatives where elicitors were used in combination were able to induce the expression of enzymes peroxidases, polyphenol oxidases and glucanases at 5 and 9 pid revealing that these periods are crucial for the activation of defense mechanisms. The expression of the electrophoretic profiles showed that plant defensive response when the inductor is used biotic and abiotic was more intense and persisted for a longer time when compared with plants treated with the chemical one. Further research is required to determine whether the IR used can be overcome by other doses, compounds and application times and if such responses are influenced by the genotype of the host and / or environmental conditions.

Key words: Induced resistance, peroxidases, polyphenoloxidases, ß-1,3-glucanases, PR proteins

Introducción 

La promoción de las respuestas defensivas de las plantas ante las enfermedades se ha logrado también mediante la aplicación de inductores químicos como el compuesto Acibenzolar-S-metilo (Bion^®) que ha brindado protección a los cultivos, constituyendo una estrategia preventiva que promueve la RSA (Gorlach et al. 1996, Cavalcanti & Resende 2005)

El modo de acción a nivel bioquímico de los inductores de resistencia tanto biológicos como químicos, consiste en la activación de genes que codifican una serie de enzimas involucradas en la síntesis de lignina y aquellas con efecto antimicrobiano directo como las peroxidasas, polifenoloxidasas y fitoalexinas (Resende et al. 2000).

También, promueven la síntesis de proteínas relacionadas con el proceso de patogénesis (proteínas PR), las enzimas β-1,3glucanasas, quitinasas contribuyen a la resistencia (Van Loon & Van Strien 1999), por ello, estos compuestos se utilizan como marcadores bioquímicos y moleculares para determinar el inicio e intensidad de la respuesta de defensa en la planta (Van Loon & Van Strien 1999, Durrant & Dong 2004).

Las respuestas defensivas de las plantas de ajo (Allium sativum L) a la pudrición blanca, la utilización de marcadores bioquímicos constituyen una herramienta para evaluar el efecto de los inductores y el lapso en el que se observan las respuestas, que permite programar un manejo integrado de la enfermedad de un cultivo. Por lo anterior, la presente investigación planteó como objetivo evaluar mediante marcadores bioquímicos el efecto de Trichoderma koningiopsis y Bion^® como inductores de resistencia a la pudrición blanca en ajo (Allium sativum L) producida por Sclerotium cepivorum, bajo condiciones controladas.

Ubicación del ensayo, el estudio se llevó a cabo en los Laboratorios Expertabiol de la Universidad Central de Venezuela Maracay, estado Aragua, y los Laboratorios de Fundamentos Fitopatológicos y de Biología Molecular del Posgrado de Fitopatología de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” Barquisimeto estado Lara.

Estudios Bioquímicos, para el ensayo, se emplearon semillas-diente de ajo “greladas” de apariencia sana, sin manchas o lesiones sobre su superficie, provenientes de un ensayo de campo previo llevado a cabo en una parcela destinada a la siembra de ajo en la población de Agua Negra, perteneciente al Municipio Jiménez del Estado Lara. Fueron desinfectadas con una solución de hipoclorito de sodio al 10 % por un minuto y se lavaron tres veces con agua destilada esterilizada (ADE) (Diekmann 1997). Seguidamente fueron sembradas en bandejas de germinación  de 26 cm de ancho x 53 cm de largo y 6 cm de altura contentivas de 50 g de sustrato orgánico por celda previamente esterilizado con vapor, para asegurar las condiciones asépticas, colocado en un envase de metal de 150 L de capacidad, con una tapa perforada sometido a una temperatura entre 80±90 ºC sobre una estructura que deja pasar vapor de agua, durante 4 h (Nelson 1999). Las bandejas se colocaron bajo un diseño en bloques al azar para un total de ocho tratamientos con cuatro repeticiones por tratamiento, quedando conforma dos de la siguiente forma: Testigo absoluto (Tes), sin microorganismo ni inductor químico, aplicación de S. cepivorum (S), aplicación de T. koningiopsis (T), aplicación de Bion^® (B), S. cepivorum + T. koningiopsis (ST), S. cepivorum + Bion^® (SB), T. koningiopsis + Bion^® (TB) y S cepivorum + T. koningiopsis + Bion^® (STB). Para un total de ocho bandejas, con un tratamiento cada una y 20 plantas por tratamiento.

Obtención de la suspensión de T. koningiopsis, como inductor de resistencia se utilizó el hongo T. koningiopsis proveniente de la colección del laboratorio de EXPERTABIOL. Se prepararon cultivos puros del microorganismo de 8 días de crecimiento bajo condiciones asépticas sobre  medio papa dextrosa agar (PDA) al 1.5 %, pH 6.5 en cajas Petri, de 9 cm de diámetro esterilizadas en autoclave eléctrico de 40 L. de capacidad marca Sterilizer SM200® durante 20 min a 15 lb de presión (121 °C). Para ello se inocularon en la parte central cuatro cajas con un disco de micelio de 5 mm de diámetro provenientes de los márgenes del medio de cultivo. Seguidamente, se colocaron sobre un mesón bajo condiciones de laboratorio (temperatura promedio de ±28 ºC, humedad relativa de 65%) donde permanecieron durante 6 días, al final de los cuales, se seleccionaron las cajas incrementadas que mostraron mejor crecimiento y con ellas se preparó la suspensión de conidias, agregando 10 mL de (ADE), a cada caja, haciendo un raspado de la colonia con una varilla d vidrio esterilizada para que las conidias quedaran en la suspensión y finalmente, se ajustó la concentración a 3x10⁵ unidades formadoras de colonias por mililitro UFC/mL (Cañedo & Ames 2004). El inóculo del biocida se aplicó mediante la técnica de inmersión propuesta por Fernández-Larrea (2001), que consiste en sumergir semillas sanas durante 20 min en la suspensión de conidias preparada. Posteriormente, las semillas se retiraron, colocándose en papel absorbente esterilizado para retirar el exceso de agua. Las semillas testigo fueron sumergidas en una solución de ADE. A continuación, se sembraron como se describió anteriormente y el hongo inductor fue nuevamente aplicado en igual dosis que la inicial, con un volumen de 5 mL por planta a los 15 días después de la siembra (dds).

El producto comercial Bion^® (Acibenzolar-S-methyl, WG. 500 Syngenta Crop Protection Pty Ltd) se aplicó con una dosis de 7.5 g de in gradiente activo (g i.a) 100 L^-1 de agua con un volumen de 5 mL por planta a los tres días posteriores a la aplicación de T. koningiopsis, en igual dosis inicial y a los 15 dds.

El hongo patógeno fue obtenido a partir de los esclerocios provenientes de plantas afectadas por la enfermedad que fueron desinfestados con alcohol etanol al 90% durante un minuto con tres pases por ADE (Papavizas 1972). Una vez secos, se colocaron con una pinza hundiéndolos en discos de 5 mm de diámetro de agar-agua acidificado con ácido láctico al 3% para impedir el crecimiento de bacterias y colocados en cápsulas de petri de 9 mm de diámetro. Una vez germinados aproximadamente entre los 9 y 10 días después de colocarlos en el medio, el micelio que emergió fue transferido a medio de cultivo PDA esterilizado en iguales condiciones. La inoculación fue realizada a los 3 días posteriores a la aplicación de los inductores (dpi), mediante un disco de 5 mm de diámetro tomados con un sacabocados desde los márgenes de cultivos de 14 días de desarrollo con aproximadamente 3 esclerocios por disco.

Todos los tratamientos se mantuvieron bajo condiciones de umbráculo hasta el 20 dpi cuando se tomaron las muestras.

Obtención y almacenamiento de las muestras de tejido foliar, para realizar el análisis de las actividades enzimáticas, se colectaron las hojas de las plantas provenientes de cada tratamiento, de 3 hasta el 20 dpi. Dichas muestras se pesaron y alma cenaron en papel de aluminio para evitar la degradación enzimática, se transportaron inmediatamente hasta el laboratorio para su almacenamiento a -20 °C, hasta su procesamiento.

Extracción de enzimas, el material vegetal se colocó en un mortero, se le agregó nitrógeno líquido y se maceró hasta su totalidad. El producto del macerado se homogenizó con amortiguador de extracción Buffer fosfato de potasio 50 mM pH 5.7 conteniendo polivinilpirrolidona (PVP) al 1%, EDTA 1mM y ß-mercaptoetanol 10 mM, en pro porción 1:1 (p/v), manteniendo una temperatura entre 0 a 4 ºC durante todo el procesamiento de las mismas. Posteriormente el extracto vegetal fue centrifugado a 4 ºC durante 20 min a 12000 rpm, con el sobrenadante obtenido se realizaron las determinaciones de proteínas totales (PT), Bradford (1976), realizando las lecturas de absorbancia a 595 nm del complejo proteína-Azul de Coomasie G-250, en espectrofotómetro (Genesys UV 10™) a partir de una solución patrón de 1mg.mL^-1 de albúmina de suero bovino (ASB). El resto del extracto obtenido fue distribuido en alícuotas de aproximadamente 100 µl y preservado a -20 ºC, para ser utilizado posteriormente en la determinación de las enzimas.

Actividad enzimática de peroxidasa, la cuantificación de la actividad de la peroxidasa (POX) se realizó por método espectrofotométrico directo descrito por Frick (1976), se utilizaron como sustratos el guayacol y el peróxido de hidrogeno (H₂O₂), se determinó la velocidad de la reacción de oxidación del guayacol por la enzima POX, en presencia de H₂0₂, midiendo la absorbancia a 470 nm (zona del espectro donde absorbe el guayacol oxidado). Para la lectura, se incubaron las mues tras a 30 ºC durante 20 min, se adicionaron 50 µL de extracto enzimático a una mezcla de reacción que consistió en: 450 µL tampón fosfato de potasio pH 7.5, 1.25 mL de Guayacol 20 mM y 1.25 mL de H₂0₂ al 30%. El blanco consistió en una mezcla de guayacol, tampón y H₂0₂ sin la muestra. Se tomó la variación de densidad óptica (DO) en el tiempo (t), durante un minuto a intervalos de 5 seg realizando tres repeticiones por tratamiento. El cálculo de la actividad enzimática general fue expresado en: mmoles (mM) de producto formado (purpurogalina) por minuto (min) por microgramos (µg) de proteína y fue calculado mediante la expresión:

Dónde:

x: es la pendiente de la recta de regresión de los datos de cada repetición.
ε: es el coeficiente de extinción molar de la enzima expresada en mM ^-1 cm ^-1.
t: tiempo en que se realizaron las lecturas.
v.r: Volumen total de la reacción.
v.m: Volumen de la muestra
PT: proteínas totales calculadas expresadas en mg
dil: dilución

El estudio de sistemas de POX implicados en la respuesta defensiva de la planta por las diferentes aislados a los 10 y 15 dpi fue establecido con base en el número, la posición e intensidad relativa de la tinción de cada banda, para ser utilizados como marcadores bioquímicos en la comparación de los tratamientos que provocaron en mayor o menor grado y la duración de la respuesta defensiva por parte del hospedante.

Actividad enzimática de polifenol oxidasa, la cuantificación de la actividad de la polifenol oxidasa (PPO) se determinó mediante del método continuo descrito por Alexander (1964) donde se emplea como sustrato de la enzima el pirogalol. Para ello, se determinó la velocidad de la reacción de oxidación del sustrato por la enzima PPO. El  pirogalol fue preparado en tampón acetato de sodio 50 mM pH 5.5. Para la lectura se adicionaron 50 µL del extracto enzimático a una mezcla de reacción que consistió en 450 µL tampón acetato de sodio y 2.5 mL pirogalol 20 mM. La actividad de la enzima, se determinó de igual forma que en el procedimiento anterior, pero a 420 nm donde absorbe el pirogalol oxidado. El blanco fue preparado en igual forma que para las POX. Se tomó la variación de la densidad óptica DO en el tiempo, durante un minuto a intervalos de 5 seg realizando tres repeticiones por tratamiento. El cálculo de la actividad enzimática general fue expresada en: mmoles (mM) de producto formado (quinona) por minuto (min) por microgramos (µg) de proteína que se calculó mediante la expresión descrita para POX pero usando el ε para las PPO.

Actividad enzimática de ß-1,3-glucanasas, la cuantificación de la actividad de la actividad de la Glucanasa, se procedió según el método colorimétrico discontinuo de Somogy-Nelson (Somogy 1952) con algunas modificaciones. Para ello, se usó laminarín (ß-1,3 glucano, 2 mg.mL^-1)  como sustrato, preparado en tampón acetato de potasio 50 mM pH 5.5. La mezcla de reacción consintió 15 µL del extracto enzimático y 15 µL de laminarín y fue incubada a 37 °C durante 30 min. La velocidad de la reacción se calculó a partir de las lecturas de absorbancia a 660 nm, determinando los azúcares reductores. La curva patrón se realizó utilizando distintas concentraciones de glucosa como estándar a partir de una solución de 1mg.mL^-1, siguiendo el mismo procedimiento descrito para las PT. El cálculo de la actividad enzimática se realizó mediante la expresión:

Actividad enzimática = D.O/t * cot (v. r/ v. m) *dil

Donde:

D.O: variación en la densidad óptica de cada repetición.
t:  tiempo de incubación
cot: cotangente de la curva patrón ]]> v.r: Volumen total de la reacción.
v.m: Volumen de la muestra
dil: dilución

El cálculo de la actividad enzimática fue expresado en mmoles (mM) de producto formado (glucosa) por minuto (min) por microgramos (µg) de proteína.

Análisis estadístico, los resultados obtenidos para cada caso, se sometieron a un análisis de varianza con un nivel de significación del 5%, cuando se detectaron diferencias significativas entre los tratamientos se realizó la prueba de comparación múltiple de Tukey, para ello se utilizó el programa estadístico STATISTIX versión 8.0 (Statistix 2003), con el objetivo identificar, el efecto de los tratamientos sobre las actividades enzimáticas de las POX, PPO y Glucanasas.

Resultados 

Actividad enzimática de peroxidada (POX), la Figura 1 muestra el efecto de los diferentes tratamientos en plantas de ajo de quince días de edad en muestras analizadas a los 3, 5, 7, 9, 10, 15 y 20 dpi donde se observó que las alternativas solas lograron inducir la enzima peroxidasa (POX) y superaron el mayor pico de actividad del testigo (Tes). La mayor actividad enzimática (AE) en las plantas tratadas con Trichoderma koningiopsis (T) y Bion (B) se evidenció a los 7 dpi cuando se les comparó con el Tes.

La Figura 1b muestra la AE de las POX cuando se aplicaron los tratamientos combinados. Las curvas mostraron que la variable evaluada se mostró elevada a los 9 dpi y mostró dos picos de actividad en aquellas alternativas donde se aplicó el inductor químico tanto con el antagonista como con el patógeno (SB, TB y STB) permaneciendo hasta los 15 dpi, mientras que la combinación ST provocó el aumento a partir de los 10 dpi disminuyendo drásticamente. Por otro lado, los tratamientos T y STB promovieron una respuesta superior a la inducida por S.

Los resultados evidenciaron, que todos los tratamientos inducen la expresión de la enzima de forma temporal, no obstante, al comparar los resultados de las curvas de ambas figuras se observó, que en aquellas alternativas donde se emplearon las diferentes combinaciones, se indujo en la planta una respuesta más rápida y por un período prolongado al compararlo con los tratamientos solos y el Tes.

La Figura 2 muestra el efecto de los diferentes tratamientos en plantas de ajo de quince días de edad sobre el patrón isoenzimático de peroxidasas en muestras analizadas a los 10 y 15 dpi. En la Figura 2a se pudo apreciar que los tratamientos provocaron la aparición de 4 isoformas de POX (P1, P2, P3 y P4). Las bandas identificadas como P1 y P2 que mostraron un Peso Molecular comprendido entre 25 y 50 kDa, revelaron bandas más intensas en aquellas las plantas tratadas con T, SB y STB para las mismas isoformas, al compararlas con Test y el resto de los tratamientos y coincidiendo con el análisis de AE.

Por otra parte, las plantas tratadas con STB presentaron 2 isoformas adicionales (P3 y P4) con un alto grado de expresión y un PM cercano a 40 kDa, dichas isoformas no se descubrieron en el resto de las alternativas y probablemente contribuyeron con mayor fuerza a la resistencia inducida ya que en este tratamiento también evidenció la mayor AE cuando fue comparada con esa variable.

Las muestras de hojas tomadas a partir de plantas tratadas con los tratamientos T, ST, SB y STB mostraron a los 15 dpi, un perfil de bandas semejantes entre sí y revelaron la presencia de dos isoformas (P1 y P2). Las muestras de las plantas sometidas a los tratamientos B y TB evidenciaron un perfil de bandas con dos isoformas diferentes.

Es importante destacar que el tratamiento T provocó la expresión de tres isoformas de POX (P1, P2 y P3) a los 10 dpi conservando su intensidad hasta los 15 dpi, cuando se le comparó con testigo y el resto de las opciones, indicando que la respuesta  defensiva de la planta ante el inductor biológico perduró por mayor tiempo comparado con la permanencia del químico.

Actividad enzimática de polifenol oxidasa (PPO). La Figura 3 muestra los resultados correspondientes a la actividad de la enzima PPO, producida por las plantas de ajo de 15 días de edad, en muestras analizadas a los 3, 5, 7, 9, 10, 15 y 20 dpi. En la Figura 3a se observa que todas las alternativas empleadas lograron inducir la enzima PPO superando el mayor pico de actividad del testigo. La mayor AE de las PPO se evidenció desde los 3 dpi en las plantas tratadas con T, con un descenso a los 7 dpi, iniciando su ascenso a los 9 dpi cuando alcanzó su mayor pico de actividad al compararlas con el resto de las opciones. A partir de este momento la variable se mantuvo hasta el último día de análisis. Las plantas que recibieron B también evidenciaron elevados niveles de PPO a los 9 dpi, posteriormente la AE decayó e inició nuevamente su ascenso, a los 20 dpi en concordancia con el comportamiento de las POX en esta opción y ambas alternativas superaron al patógeno (S). (P3 y P4) cuando se les comparó con el resto de las alternativas y concordando con la AE.

La Figura 3b mostró que la AE de las PPO aumentaron desde el tercer dpi para las  alternativas donde se combinó el patógeno con los inductores bióticos y abióticos (SB y STB). Los niveles de la enzima se mantuvieron en los tratamientos ST y STB hasta los 9 y 10 dpi respectivamente, a partir de este momento la AE declinó de manera abrupta a los 15 dpi. Por otra parte, se detectó una modificación en el comportamiento de la AE con la aplicación de la alternativa TB donde se evidenciaron dos picos de actividad más tarde a los 5 dpi y a los 9 y 15 dpi, respectivamente y SB.

Durante el desarrollo del análisis se observó, que cuando se aplicaron los inductores solos o combinados, la etapa de mayor AE ocurrió a los 9 dpi, no obstante, cuando se aplicaron las alternativas ST y STB se evidenció que la AE fue sostenida sin mostrar picos de actividad, mientras que SB y TB evidenciaron dos picos de actividad.

Actividad enzimática de ß-1,3-glucanasas.  La Figura 4 muestra los resultados correspondientes al efecto de los diferentes tratamientos  sobre  la  actividad enzimática de las Glu en muestras analizadas a los 3, 5, 7, 9, 10, 15 y 20 dpi, observándose que todas las alternativas empleadas lograron inducir las Glu superando el mayor pico de actividad observada en el testigo. La Figura 4a expuso que la mayor AE de las Glu ocurrió a los 15 dpi en las plantas tratadas con T y B, mientras que, en las plantas inoculadas con elpathogen alone, the enzyme activity increased patógeno sólo, el aumento de la actividad enzimática initially, but later declined drastically.se produjo desde los 15 dpi, posterior a este tiempo, se redujo drásticamente.

En la Figura 4b se observa que las alternativas ST y TB indujeron la expresión de la enzima de forma temprana, desde los 3 dpi, alcanzada el nivel más alto a los 15 dpi, y disminuyendo a los 20 dpi.

La Figura 4c muestra que la AE de las Glu en los tratamientos SB y STB fue la más alta a los 3 dpi e incrementó a partir de los 7 hasta los 10 dpi, manifestando el mayor pico de actividad a los 9 dpi. A partir de este momento, la AE inició su descenso de forma abrupta y comenzó a ascender nuevamente a los 15 y 20 dpi, respectivamente.

Al comparar los resultados, de las curvas de ambas figuras se observó, que las alternativas donde se emplearon los inductores solos (T y B) y las combinaciones SB y STB indujeron la expresión de la enzima antes que lo hiciera el patógeno, mientras que los tratamientos ST y TB si bien lograron elevados niveles de AE, estos se expresaron tardíamente.

Discusión 

Las plantas tratadas con el inductor biótico y el químico, en los distintos períodos, provocó  las  respuestas de defensa en las plantas de ajo tanto a nivel local como sistémico. Debió darse una señal de móvil generada en el sitio de la inducción y fue traslocada por la planta, dando lugar a un estado inducido distante del lugar de la exposición al antagonista y el químico. Además, se comprobó la compatibilidad entre el biocontrolador y el compuesto con la planta y entre el antagonista y el inductor químico. Adicionalmente se demostró que existe relación entre el inductor de resistencia empleado y el tiempo en que se produce la expresión de la respuesta.

La actividad enzimática de las POX, PPO y Glu en el presente estudio, constituyeron un marcador bioquímico idóneo para determinar la activación de los mecanismos de defensa en las plantas de ajo.

El incremento de la expresión de POX, permitió estimar la forma rápida y directa en la respuesta de esta proteína y se observó que el período de respuesta entre la aplicación del inductor biótico y abiótico y la activación eficaz de las respuestas de defensa promovida por las POX ocurre a los 3-7 días después de la inoculación. Los cambios detectados en los análisis isoenzimáticos revelaron la sensibilidad del método para indicar la respuesta defensiva cuando los niveles de la enzima son muy ajo para ser cuantificados.

En los resultados expuestos en dicho análisis se puede señalar, que el tratamiento donde  se aplicaron el inductor biótico, abiótico y el patógeno se presentó la mayor de los mecanismos de defensa del hospedante en el tiempo, sin embargo, debe considerarse la viabilidad y la adaptación del inóculo empleado de T. Koningiopsis.

Por otra parte, la respuesta  defensiva  de la planta ante el antagonista perduró por mayor tiempo en comparación con el químico. Estudios previos demostraron que cuando las plantas son tratadas con inductores, las enzimas pueden estar de forma constitutiva en el hospedante y aumentan su actividad como resultado de la activación de la respuesta de defensa, mientras que  la aparición de nuevas isoformas, podría ser consecuencia  de su inducción ante la presencia del patógeno (Yedidia et al. 1999, Howell et al. 2000, Howell 2003, Harman et al. 2004).

La respuesta de PPO se mostró de forma prematura al tratar a las plantas con ambos inductores combinados detectándose que sus niveles se mantuvieron por mayor tiempo. Este aumento en la actividad de esta enzima pudiera corresponder a una respuesta inespecífica por parte del hospedan te ante la ante la presencia de los inductores. Es posible que la respuesta defensiva requiera de la síntesis y acumulación de la enzima antes de alcanzar niveles máximos, o que las dosis empleadas tanto del compuesto químico como del hongo antagonista hayan sido muy pequeñas para inducir una respuesta.

En el presente estudio se pudo comprobar que la expresión todas las enzimas evaluadas obtuvo los niveles más elevados cuando las plantas fueron tratadas con el inductor químico sólo y el inducidor biótico previo a la aplicación del patógeno. Estos resultados, sugieren que la planta evidenció mayor estímulo defensivo por el efecto aditivo de los inductores, sugiriendo que la inducción de resistencia probablemente no se debió a una enzima en particular, sino al grupo en conjunto.

Las plantas tratadas con ambos inductores y luego inoculadas con el patógeno, lograron responder más rápido y de manera superior con respecto a aquellas donde se aplicaron los inductores pero que no fueron desafiadas, trabajos semejantes al presente señalaron que la pre-activación del sistema defensa de la planta, desempeñan un papel fundamental en el inicio de la respuesta inmune de la planta, garantizando el reconocimiento y la modificación postrasduccional de la señal (Van Wees et al. 2008) o un nuevo estrés (Conrath et al. 2006).

De acuerdo con el objetivo planteado y los resulta dos obtenidos en la investigación realizada se llegó a las siguientes conclusiones.

La incorporación de T. koningiopsis y Bion^® en las plantas de ajo, mostraron que tanto el antagonista como el compuesto lograron promover a las enzimas evaluadas y superaron la actividad frente al Tes y la opción STB logró superar en tiempo y cantidad la expresión enzimática provocada por el patógeno sólo.

La expresión de las enzimas evaluadas reveló que el 5 y 9 dpi son cruciales para la activación de los mecanismos de defensa, apuntando que la aplicación de los inductores debe realizarse cada 7 o 10 días ya que en la mayoría de las alternativas empleadas en el presente estudio comenzaron a decaer a partir de los 15 días posteriores a la inducción. Todos estos resultados permiten a proponer que el empleo de nuevas aplicaciones o estrategias debe realizarse previas a ese momento, de manera de ejercer inducción de forma continua.

Se requiere de investigaciones adicionales para determinar si la IR provocada por los inductores empleados pueden ser superados con otras dosis, compuestos y momentos de aplicación y si dichas respuestas están influenciadas por el genotipo del hospedante y/o las condiciones ambientales. De igual modo, verificar si durante la IR mediada puede haber expresión de  genes sin la traducción o síntesis de la enzima relacionada con la defensa.

Conflictos de interés

Esta investigación recibió financiamiento del CDCHT /UCLA Lara, Venezuela, y no presenta conflictos de interés.

Agradecimientos 

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