Evaluación de la actividad antiparasitaria de los extractos de 4 especies vegetales "chagasín" sobre trypanosoma cruzi procedentes de (triatomas infestans)" y su acción fitoterápica en cobayos chagásicos

Antiparasitary activity assessment from 4 vegetable species extracts "chagasin" in trypanosoma cruzi (triatomas infestans) and its phytotherapy action in chagasic guinea pigs

AVILES - María¹, FLORES - Raymundo^{2
h 2} Investigadores del Sur Bolivia Sin Fronteras IDSBOSIF, calle Topáter S/N teléfono 591-464-26825, celular 74303053, Sucre- Bolivia; HIDROHERBALES LAFARFICON.
Recepción: Junio 11, 2017 Aceptación: Diciembre 04, 2017

Resumen

El presente estudio en esta etapa, tuvo como objetivo: Evaluar la actividad antiparasitaria de 4 extractos vegetales sobre Tripanosoma cruzi, aislados de Triatoma infestans y su acción fitoterápica en cobayos chagásicos. En la primera fase fue desarrollado el estudio de acuerdo a los objetivos específicos trazados, la metodología empleada estuvo basada en: 1. Obtención de los extractos vegetales por percolación, previo tratamiento de selección y desinfección de las especies en estudio; Jamillo, Carqueja, Canchalagua, los cuales previas obtenciones del extracto a diferentes concentraciones fueron sometidas sobre tripanosomas conservados en solución fisiológica isotónica a 28 +- 4 °C. los resultados para Jamillo demostraron mayor efecto antiparasitario en relación a las otras especies vegetales los parásitos vistas al microscopio tuvieron una inmovilidad pos mortuoria del 50% a las horas 8 horas y del 90% a las 16, y 99% a las 12 horas; las variables en estudio fueron concentración de los extractos y Tiempo de exposición del tripomastigote en las diferentes diluciones preliminares de los extractos semisólidos preparados al 0,4, 0,8, y 1,6 %. Los datos obtenidos fueron expresados como media ± desviación standar y las comparaciones entre los grupos experimentales fueron realizadas por ANOVA de una vía seguido, por una prueba post-hoc de Scheffé. Las medias fueron consideradas significativamente diferentes cuando p < 0,05. Se utilizó el software SPSS 11,5. De acuerdo al análisis de datos se han obtenido los siguientes resultados, sometidos a ANOVA, para todos los casos, existe un efecto significativo como se puede ver: probabilidad inferior a 0.05, por lo que existen diferencias significativas entre los tratamientos aplicados. Concluyéndose que los extractos de las especies utilizadas Schkuhria pinnata (Canchalagua) y Baccharis articulata (Carqueja), Miroxylum periferium (Quina colorada) y Viscum álbum L. (Jamillo), demostraron actividad tripanocida en menor y mayor grado de acuerdo a las diferentes concentraciones utilizadas en el ensayo, asimismo en el ensayo biológico de cobayos chagásicos, desparasitados con CHAGASIN l(extracto de Jamillo estabilizado con extracto de carqueja) se demostró mayor actividad antiparasitaria que CHAGASIN 2 (extracto de Jamillo estabilizado con canchalagua)

Palabras Clave

Tripanosoma cruzi, Triatoma infestans, Chagasin, carqueja, canchalagua, quina, cobayo

Abstract

The aim of the present study on its first stage was to assess the anti-parasitic activity of four plant extracts on Trypanosomacruziand isolated from Triatomainfestants and its phytotherapeutic action in chagasic guinea pigs. In the first phase the study was developed according to the specific objectives set. The methodology used was based on: 1 .Obtaining plant extracts by percolation after a treatment of selection and disinfection of the species under study: Jamillo, Carqueja, Canchagula, which previous obtained of the extract at different concentration were put on preserved trypanosomes in a physiological isotonic solution at 28 +- 4°C. The results for Jamillo showed greater antiparasitic effects in relation to the other plant species. The parasites seen under microscope had a post-mortuary immobility of 50 % at 8 hours, 90 % at 16 and 99 % at 12. The variables under study were concentration of the extracts and time of exposure of the trypomastigote in the different preliminary dilutions of the semisolid extracts prepared at 0.4, 0.8 and 1.6 %. The data obtained was expressed as a mean +-standard deviation and the comparisons between the experimental groups were performed by one-way ANOVA followed by a post hoc Scheffé test using the SPSS 11.5 software. The means were considered significantly different when p<0.05. The following results were obtained according to the data analysis and treatment submitted to ANOVA. For all cases, there is a significant effect: probability less than 0.05, so there are significant differences among the treatments applied. Therefore, it can be concluded that the extracts of the species used: Schkuhria pinnata (Canchalagua), Baccharis articulata (Carqueja), Miroxylum periferium (Quina Colorada) and Viscum álbum L. (Jamillo), showed trypanocidal activity in minor and greater degree according to the different concentrations used in the lab experiments. The same was observed in the biological test of chagasic guinea pigs, wormed whit CHAGASIN 1 (extract of Jamillo stabilized with extract of carqueja). It showed greater antiparasitic activity than CHAGASIN 2 (extract of Jamillo stabilized with canchagula).

Keywords

Tripanosoma cruzi, triatoma infestans, Chagasin, Carqueja, Canchalagua, quina, guinea pig

Introducción

La Tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas es una infección parasitaria causada por Trypanosoma cruzi; es transmitida por insectos hematófagos de la familia Reduviidae, conocidos comúnmente en Bolivia como vinchucas (1). Esta enfermedad afecta principalmente a la población rural y periurbana en el continente americano donde las viviendas son construidas de adobe o carrizo y el hacinamiento favorece la presencia y proliferación del vector. El Chagas es la tercera enfermedad tropical más importante a nivel mundial en cuanto a morbilidad y mortalidad 2,3. Según la OMS, y gracias a las iniciativas multi gubernamentales de las dos últimas décadas, la mortalidad anual por esta enfermedad se ha reducido a 21.000 personas al año y el número de nuevos casos anuales aumenta. Se estima que 18 millones de personas están infectadas y 100 millones más con riesgo de infectarse.

En 2002, la OMS cita textualmente: "Según el Informe sobre el Desarrollo Humano del PNUD, la media anual per cápita estimada del producto interior bruto para Latinoamérica es de 2.966 dólares (de EE.UU., -USD-). La pérdida económica para el continente debido a la mortalidad precoz y morbilidad por esta enfermedad, entre la población joven en años productivos, es de 8.156 millones de USD, lo que equivale al 2,5% de la deuda externa del continente en 1995. el objetivo de la presente investigación fue el de "Evaluar la actividad antiparasitaria de 4 extractos vegetales sobre Tripanosoma cruzi, aislados de Triatoma infestans y su acción fitoterápica en cobayos chagásicos.

En la primera fase fue desarrollado el estudio de acuerdo a los objetivos específicos trazados, la metodología empleada estuvo basada en :

1. Obtención de los extractos vegetales por percolación, previo tratamiento de selección y desinfección de las especies en estudio; Jamillo, Carqueja, Canchalagua, los cuales previas obtenciones del extracto a diferentes concentraciones fueron aplicadas, sobre tripanosomas conservados en solución fisiológica isotónica a 28 +- 4 °C. los resultados para Jamillo demostraron mayor efecto antiparasitario en relación a las otras especies vegetales, los parásitos vistas al microscopio tuvieron una inmovilidad pos mortuoria del 50% a las horas 8 horas y del 90% a las 16, y 99% a las 12 horas. Demostrando los resultados mayor efectividad antiparasitaria con Extracto de Jamillo estabilizado con extracto de carqueja denominado Chagasin 1, de acuerdo al análisis realizado, tomando en cuenta los días de parasitosis inducida, y actividad de los extractos CHAGASIN 1 Jamillo más carqueja con un 94% de efectividad antiparasitaria y CHAGASIN 2 efectividad antiparasitaria de 83,5%. (ver tabla 9 y gráfico 1)

Antecedentes

En 1909, el Dr. Chagas comunicó al mundo científico la existencia de una nueva enfermedad infecciosa. Un año antes, ya había descrito al parásito que la provoca y el vector que la transmite. Su triple descubrimiento se considera único en la historia de la medicina. La falta de tratamientos innovadores y el que existe en la mayoría de ocasiones no está disponible para los enfermos. Cien años después, muchas de las personas infectadas con Chagas siguen ignorando que están enfermas, mueren sin saber de qué y en silencio. Su voz no llega hasta los Gobiernos que deberían responder a este problema de salud pública, ni hasta las Compañías farmacéuticas que podrían investigar y desarrollar nuevos medicamentos.

Durante la primera fase, el estadio agudo de la enfermedad después de contraer la infección, a menudo es asintomática. Los niños puede que presenten algunos síntomas como fiebre, glándulas linfáticas hinchadas, hígado y bazo distendidos o inflamación de la picadura. Estos síntomas a menudo pueden confundirse con los de otras enfermedades de la infancia, y a los pocos días desparecen.

La fase intermedia empieza entre las ocho y las diez semanas después de haber contraído la infección y puede que dure muchos años. En esta fase los afectados son asintomáticos y pueden ser portadores del parásito durante años sin saberlo. Cerca de entre el 20 y el 30% de las personas infectadas desarrollaran la fase crónica de la enfermedad entre diez y veinte años de haberla contraído. Para entonces, los pacientes habrán desarrollado lesiones irreversibles en el corazón, el esófago y el colon. El fallo cardiaco es la causa de muerte más frecuente entre los jóvenes adultos, las personas que deberían estar en la fase más productiva de su vida.

Los gobiernos de países endémicos tendrán que reconocer su responsabilidad respecto a la salud pública y comprometerse a ocuparse de su población de alto riesgo. Aunque en Latinoamérica los programas nacionales de lucha contra la enfermedad de Chagas han adquirido ímpetu, se necesita financiación por parte de la comunidad internacional que apoye la batalla contra esta enfermedad. Las autoridades de salud nacionales, los países financiadores, la OPS y la OMS deben definir estrategias para abordar esta enfermedad, organizaciones diferentes exhortan a que: se asegure la producción y la disponibilidad de los dos medicamentos existentes en la actualidad, el nifurtimox y el benznidazol desarrollándose versiones pediátricas de los medicamentos existentes e incrementándose la I+D a fin de mejorar las pruebas de laboratorio para diagnosticar todas las fases de la enfermedad.

Así también se incrementan los esfuerzos en I+D de tratamientos más eficaces, asequibles, simples y menos tóxicos para todas las formas de Chagas, tanto para adultos como para los niños. (MSF| 902 30 65 | www.msf.es).

Previo al estudio, se realizó un sondeo a informantes claves (médicos naturistas tradicionales) en diferentes comunidades del Departamento de Chuquisaca, Limabanba, Iti, Alcalá, donde el 94% indicaron que para protegerse de la picadura de vinchucas, ellos tomaban preparados en base a Jamillo carqueja, además de la corteza de la quina y otras plantas que se presentan de acuerdo a la época, ya que no contaban con medicina de farmacias, y que solo los doctores sabían echar insecticidas a sus casitas produciéndoles dolores de cabeza y de estómagos, por lo que no querían ya que rociaran con estos productos que les hace daño.

De ahí la necesidad e importancia de contar con productos naturales de especies vegetales con propiedades antichagásicas que les permita combatir esta enfermedad y facilitar su consumo lo que resulta por demás sencillo una vez verificada dichas propiedades, mediante la "Evaluación de la actividad antiparasitaria de 4 extractos de especies vegetales sobre Trypanosoma cruzi procedentes de (Triatomas infestants) in- vitro. Y su acción fitoterápica en cobayos chagásicos".

Métodos y material

Las muestras biológicas correspondientes a los tripanosomas fueron extraídos de los Triatominos infestados, mismos que fueron colectados en el Municipio de Yotala de viviendas precarias.

Las plantas: de Jamillo, Carqueja y Canchalagua, para el preparado de los extractos fueron colectadas del Municipio de Yotala y la corteza de quina colectada en la Comunidad de Iti Departamento de Chuquisaca, los cuales fueron sometidos a selección, desinfección, secado, pulverizado y percolación en etanol. (goteo continuo hasta agotamiento)

Materiales

Los materiales necesarios para la presente investigación fueron lo siguientes: Insumos vegetales, estufa temperatura variable 0^o a 250 C° molino pequeño pulverizador Prensa, Incubadora, Material de vidrio, cajas Petri, medios de cultivos, reactivos químicos, envases de plástico, bolsas de polietileno, jeringas, pipetas estériles, hisopo, Guantes de lavado y de trabajo de laboratorio, material de limpieza, bolsas de papel, Material escritorio, alcohol 95 ^a Medios de cultivo, vaselina líquida, material de vidrio de laboratorio, estufa temperatura graduable normal 30 y 37 °C, microscopio de luz, balanza sensibilidad en mg, porta vidrios, celdas de vidrios, cámara hemocito métrica de Neubauer.

Procedimiento 1

Para la realización de los ensayos experimentales en el estudio se desarrollaron las actividades de acuerdo a lo propuesto en el documento.

1. La extracción de los extractos naturales de las especies vegetales estudiadas se realizó por el método de percolación ( extracto entero -mezcla de principios activos) para el cual se utilizó material vegetal en seco, especies antes de tratamiento de secado fueron sometidas a proceso de selección y desinfección flores frescas de Jamillo, Corteza de Quina, Carqueja y Canchalagua (planta entera), antes de la extracción etanólica, para una mejor superficie de contacto el material biológico fue pulverizado, posteriormente la misma fue concentrada por deshidratación.

2. Una vez obtenidos los extractos semisólidos fueron guardados en un frasco de vidrio color ámbar a temperatura ambiente, hasta su uso. Como parásito se utilizó tripomastigotes que se encuentran en las heces de la vinchuca (Triatoma infestans) parasitado. Las muestras fueron concentradas previo lavado de las heces (muestra de heces fecales de Triatominos con solución fisiológica isotónica acondicionadas a temperatura de 32 grados + - 4 °C con la que no sufrieron alteración alguna. La preparación de las diluciones de los extractos para el ensayo sobre las muestras se preparó de la siguiente manera: (ver tabla 1)

3.         Antes de desarrollar los ensayos in-vitro, las muestras contenidas en solución fisiológica fueron contados en una cámara hemocito métrica de Neubauer; a continuación 100 ul de una suspensión de 4X212 parásitos/ mi fueron adicionados en tubos de hemolisis para las diferentes concentraciones y con 4 repeticiones, haciendo un total de 16 tubos, todas en condiciones de igual temperatura y pH, luego los extractos diluidos en solución fisiológica isotónica fueron adicionados en un volumen de 100 ul. Relación 1 a 2.

4.          Se incubó durante 24 horas a 32°C. +- 4 con lectura control a los 60, 120, 180 y 240 minutos de la motilidad de los tripanosomas mediante observación directa al microscopio, cargándose en la cámara hemocito métrica dilución 1/20 de muestra tratada en solución fisiológica isotónica, posteriormente se procedió al conteo de tripanosomas inmóviles sometidos a los extractos para cada uno de las concentraciones verificando el mismo a los 60.120.180 y hasta los 240 min. para verificar la posible recuperación de la motilidad como indicador de la no mortalidad de los parásitos.

Tabla: 2. Inviabilidad de Tripanosomas cruzi a diferentes concentraciones y tiempos

Procedimiento 2. Determinación del efecto antichagásico

1. Una vez obtenido los extractos fueron preparados tomando en cuenta las concentraciones óptimas del ensayo preliminar, concentración 1,6% para extracto de Jamillo estabilizado con extracto de carqueja y concentración de 1,6% extracto de Jamillo estabilizado con extracto de canchalagua, para determinar el efecto antiparasitario en cobayos experimentación.

Tabal 3. Concentraciones de las diluciones de CHAGASIN 1 Y CHAGASIN 2

2.         Previo al tratamiento para determinar el efecto antichagásico en cobayos de experimentación, estos fueron inoculados con una dilución en solución fisiológica 1/20 de tripomastigotes. (ver tabla 4)

3.         El ensayo se utilizaron 6 cobayos de raza andina de color blanco y sanos, los cuales tenían un peso desde los 712g. hasta los 836g. sometidos a las mismas condiciones de tratamiento y divididos en 3 grupos, cada grupo constituidos por dos cobayos. Gl, G2 y G3, siendo G3 grupo control sin inoculación de tripomastigotes.

4.         Post inoculación con tripomastigotes, los cobayos fueron sometidos a observados hasta los 5 días sin tratamiento alguno, al sexto día se les realizo un examen microscópico directo en sangre para verificar la parasitemía, sin resultados positivos, y con una actividad aparentemente normal, sin embargo a los 7 días se encontraron parásitos en sangre en los cobayos 1 y 3 y a los 10 días en los cobayos 2 y 4 el Grupo 3 sin efecto alguno normal.

5.         Administración en gotas de las concentraciones de extractos obtenidos preparados como Chagasin 1 y Chagasin 2 en los cobayos de experimentación.

Tabla 4. Inoculación de la dilución de tripomastigotes en cobayos de experimentación

Tabla 5. (6 Cobayos) Ensayo preliminar en cobayos tratados con extracto: Chagasin 1 y 2

Evaluación Toxicológica Y Dosificación

Tabla 7. Dosificación de CHAGASIN 1 CHAGASIN 2, presentación gotero de 20 mi.

RESULTADOS ENSAYO PRELIMINAR PRIMERA PARTE: DETERMINACONACTIVIDAD ANTIPARASITARIA IN-VITRO DE LAS CUATRO ESPECIES VEGETALES DE EXTRACTOS DE JAMILLO, CARQUEJA, CACHANLAGUA Y QUINA POR SEPARADO.

Los datos obtenidos fueron expresados como media ± desviación estándar y las comparaciones entre los grupos experimentales fueron realizadas por ANO VA de una vía seguido, por una prueba post-hoc de Scheffe Las medias fueron consideradas significativamente diferentes cuando p < 0,05. Se utilizó el software SPSS 11,5. De acuerdo al análisis de datos se han obtenido los siguientes resultados, sometidos a ANOVA, para todos los casos, existe un efecto significativo como se puede ver: F= (32,9); p = 0.046 , F=(2,9) ; p=0.006 , F=(2,9) ; p=0.015 probabilidades inferior a 0.05, existiendo en la última un efecto no significativo F=(2,9) ; p=0.069 por lo que existen diferencias significativas entre las cuatro especies vegetales.

Tabla 8: ANO VA de una vía seguido, por una pruebapost-hoc de Scheffé

La diferencia de las medias es altamente significativa al nivel de 0,05% por lo que existen diferencias entre tratamientos.

Tabla 9. Resultados de ensayo en cobayos de experimentación 2^o parte

Los resultados demuestran mayor efectividad antiparasitaria con Extracto de Jamillo estabilizado con extracto de carqueja denominado Chagasin 1.

De acuerdo al análisis realizado, tomando en cuenta los días de parasitosis inducida y actividad de los extractos CHAGASIN 1 Jamillo más carqueja con un 94% de efectividad antiparasitaria y CHAGASIN 2 efectividad antiparasitaria de 83,5%. (ver tabla 9 y gráfico 1)

Tabla 10. Desparasitación de cobayos con CHAGASIN 1 y CHAGASIN 2, previa parasitosis inducida

Gráfico 1. Relación de la efectividad antichagásica entre CHAGASIN 1 y CHAGASIN 2

Discusión

En la búsqueda de nuevas alternativas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, los productos vegetales han demostrado poseer importante actividad contra parásitos hemoflagelados. Se ha reportado estudios que el extracto de la hoja de B. dracunculifolia, a una concentración de 3 mg/mL, produjo 100% de lisis de formas tripomastigotes de T. cruzi (13); los extractos y fracciones de A. amazonicus mostraron lisis de las formas tripomasigotesde T. cruzi in vitro (14); otros investigadores también han demostrado el efecto tripanocida de diversos extractos vegetales (10,15,16), así como de diversas estructuras terpénicas contra uno o todos los estadios de T. cruzi.

En la presente investigación, los extractos vegetales utilizados en el ensayo in-vitro para determinar la actividad antiparasitaria sobre los tripomastigotes, fueron los extractos de: 1. Carqueja (Baccharis articulata), 2. Canchalagua (Schkuhria pinnata), los que fueron aplicados a los tripomastigotes obtenidos de Triatominos (vinchucas). Concentraciones al 0,4 %, 0,8 5 y 1,6 % en todos los casos se observaron diferentes grados de mortalidad de tripomastigotes de acuerdo al tiempo de exposición a las que fueron sometidos. 60. 120, 180 y 240 minutos, sin embargo, se obtuvo mejor respuesta con el tratamiento al 1,6 % a los 240 minutos con una mortalidad del 100% de actividad tripanocida de Jamillo, Carqueja y Canchalagua, (ver tablas y gráficos en anexos.) También se demostró de alguna manera actividad tripanomicida al 88% con extracto de Quina al 1,6%.

En la segunda parte del estudio, se procedió a la evaluación antichagásica en cobayos de experimentación para determinar la dosis efectiva antichagásica de los extractos y relacionar la misma con las dosis empíricas utilizados por médicos naturistas tradicionales, y así obtener la dosis correcta de los extractos mencionados, toda vez que su validación también está dada por usos y costumbres conocimiento ancestral, obteniéndose la dosis antichagásica de los extractos en relación a las dosis empíricas utilizada en la Medicina Natural Tradicional.

Conclusiones y recomendaciones

Se concluye que las 3 especies (Jamillo, Canchalagua y Carqueja) demostraron de acuerdo al ensayo mejor actividad tripanocida a los 240 minutos en concentraciones al 1,6%, no excluyéndose la actividad tripanocida de la Quina que también demostró actividad tripanocida con su mejor actividad antiparasitaria (88% de mortalidad de tripanosomas a los 240 minutos en concentraciones del extracto al 1,6%.)

Asimismo, se concluye que CHAGASIN 1 (extracto de Jamillo estabilizado con carqueja) presentó mayor efectividad antiparasitaria en los cobayos chagásicos de experimentación que CHAGASIN 2 (extracto de Jamillo estabilizado con extracto de canchalagua). Aunque no se desmerece la actividad que también presentó CHAGASIN 2.

Los resultados obtenidos, demuestran la similitud de acción tripanocida de las especies con las que cuenta el departamento de Chuquisaca, respecto a estudios realizados por otros investigadores.

Finalmente podemos concluir que todas las especies utilizada presentaron actividad tripanocida, en las concentraciones usadas contra Trypanosoma cruzzi.

Se recomienda, continuar con estudios, que permitan validar otras especies, sea para la etapa aguda o crónica de la enfermedad, debido en el estudio se realizaron los ensayos en la etapa aguda de la enfermedad como una alternativa más de lucha para este mal, denominado "Enfermedad de los pobres".

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ANEXOS

1. Subconjuntos homogéneos (concentración de los extractos de 4 especies vegetales)

Memoria fotográfica