Análisis de la dinámica de bioestimulación de un suelo contaminado por 75000 ppm de aceite residual automotriz

Dynamic analysis of biostimulation of soil polluted by 75000 ppm of waste motor oil

Hernández-Valencia Daniel Filomeno, Santoyo-Pizano Gustavo, Saucedo-Martínez Blanca Celeste, Ignacio De La Cruz Juan Luis, Sánchez-Yáñez Juan Manuel*

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Francisco J. Mujica S/N, Col. Felicitas del Rio C.P. 58000, Morelia, Mich., México. Laboratorio de Microbiología Ambiental, Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Ed-B3 C.U.

*Dirección de contacto: Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Francisco J. Mujica S/N, Col. Felicitas del Rio C.P. 58000, Morelia, Mich., México. Laboratorio de Microbiología Ambiental, Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Ed-B3 C.U.

Historial del artículo.

Recibido septiembre, 2018.
Devuelto noviembre 2018
Aceptado enero, 2019.
Disponible en linea, febrero, 2019.

Resumen

Palabras clave: Suelo, ARA, microbiota, bioestimulación, P. vulgaris, V sativa mineralización, pH, NOM-138, cromatografía gases.

Abstract

Soil polluting by 75000 ppm of waste motor oil (WMO) is a mixture of hydrocarbons (HICO) aliphatic and aromatics, is a concentration which according to NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2012 (NOM-138), exceeds the máximum valué permissible of 4400 ppm, this high WMO concentration is inhibin organic matter mineralization and causing soil's fertility. An alternative solution is biostimulation (BIS) of soil polluted by 75000 ppm of WMO, with a detergent (DEGE) that emulsified the WMO, then a mineral solution (MISO), following Phaseolus vulgaris and Vicia sativa powered by Micromonospora echinospora and Penicillium chrysogenum, after 25 days of growing both plants were incorporated and degraded as green manure (GEMA) and vermicompost (VERMI) for an effective mineralization of WMO. The objective of this research was to analyze the dynamics of the BIS of soil polluted by 75000 ppm of WMO to lower valué than the máximum allowed by the NOM-138. In that sense during the BIS, microbial population involved in WMO'oxidation, was counted and by gas chromatography WMO's concentration atthe beginning and end of the assay was determined. Experimental data were analyzed by ANOVA/Tukey. The results indicated that the BIS of the soil impacted by 75000 ppm of WMO decreased it to 1532 ppm, which supports that the biostimulation of the soil with a DEGE, the MISO, GEMA and VERMI enriched it with NH4+, NO3-, PO4-3 and K2O, to induce aerobic heterotrophic microbiota to oxidize the WMO, which was demonstrated by increasing soil's microbial population, pH variation and gas chromatography by disappearance of some aliphatic and aromatics compound of WMO. It is concluded that BIS was worth processing to recover soil impacted by a relatively high concentration of WMO.

Key words: Soil, WMO, microorganisms, biostimulation, mineral solution, P. vulgaris, V. sativa, vermicompost, NOM-138, gas chromatography.

Introducción

El aceite residual automotriz (ARA), una mezcla de hidrocarburos (HICO) alifáticos, aromáticos y trazas de metales pesados,^1,2 que de acuerdo con la Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección Ambiental (LGEEPA) se considera residuo peligroso para el ambiente.³ El ARA derramado en suelo forma una capa impermeable, bloqueando la difusión de O2 (oxigeno) y agua,⁴ causando un desequilibrio en la relación C:N (carbono/nitrógeno), que inhibe la actividad de la microbiota heterotrófica aerobia autóctona (MHAA) que oxida la materia orgánica (MO), y como consecuencia reduce la productividad agrícola.^5,6 Al respecto la NOM-138-SEMARNAT/SSA-2012,⁷ establece un límite máximo permisible de 4400 ppm de HICO, fraccionada en: 200 fracción ligera, 1200 mediana 1200 y 3000 ppm pesada. Un valor superior a 4400 ppm en suelo, esta ley, recomienda la aplicación de métodos químicos: O₃ (ozono), H₂O₂ (peróxido de hidrogeno), Cl (cloro) y CIO₂ (dióxido de cloro), que causan a su vez un daño colateral y elevado costo. Una alternativa ecológica a esta problemática que disminuya la concentración del ARA a concentración menor a la máxima aceptada por la NOM-138, la bioestimulación (BIS) del suelo impactado por ARA mediante un detergente (DEGE) que lo emulsifica,⁸ seguida de H₂O₂ o fuente de O₂ (oxigeno) para acelerar su oxidación⁹ con enriquecimiento de una solución mineral (SOMI) a base de sales de NH₄⁺, NO₃^- y PO₄^-3 que equilibrarían el desbalance de la relación C:N por el exceso de ARA e inducen a la microbiota a su oxidación,^10,11 a continuación una BIS que mantenga la mineralización de la mezcla de HICO mediante una lombricomposta (LOCO) que incorporen com puestos orgánicos de N como la urea, aminoácidos, entre otros, y de MO almidón y glucosa que favorecen por cometabolismo a la oxidación del ARA.¹² Posteriormente en el suelo la BIS mediante la siembra de Phaseolus vulgaris (frijol) y de Vicia sativa (janamargo) en estadio de plántula, se incorpora como abono verde (AVE) que se degradan para generar aminoácidos, nucleótidos y urea, al igual que azucares sencillos como glucosa, para mantener el cometabolismo de compuestos aromáticos policíclicos del ARA.^3,13,14 En suelo impactado por este ARA una manera de facilitar la siembra de P. vulgaris y V. sativa es potenciarlo con Micromonospora echinospora y/o Penicillium chrysogenum para minimizar al estrés causado por la fitotoxicidad del ARA, principalmente porque ambos microorganismos oxidan los componentes aromáticos del ARA.^15,16 Con base en lo anterior, el objetivo de este trabajo fue analizar la dinámica de BIS de un suelo impactado por 75000 ppm de ARA, y reducirlo a un valor inferior al máximo permisible por la NOM-138.

Materiales y métodos

Esta investigación se realizó en el invernadero del Laboratorio de Microbiología Ambiental del Instituto de Investigaciones Químico Biológicas (IIQB) de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo (UMSNH), las condiciones micro climáticas promedio fueron: temperatura de 23.2 °C, luminosidad de 450 mol m^-1s^-1 y humedad relativa de 67%. Para este ensayo se utilizó un suelo colectado de un sitio ubicado a los 19° 37' 10" de latitud norte 101° 16' 41.99" de longitud oeste, con una altitud de 2013 msnm, de clima templado de una zona agrícola denominada "Uruapilla" del municipio de Morelia, Mich., en la carretera Morelia-Pátzcuaro, Mich,

Posteriormente 1.0 Kg de suelo se colocó en el contenedor superior de la Jarra de Leonard figura 1, en tanto que la SOMI o agua en el reservorio de la inferior, ambas partes se conectaron por una tira de algodón de 35 cm para facilitar el movimiento de los líquidos por capilaridad. La tabla 1 detalla el diseño experimental con 7 tratamientos y 6 repeticiones, se establecieron 3 controles: i) suelo sin ARA irrigado solo con agua o control absoluto (CA), ii) suelo sin el ARA alimentado con SOMI o control relativo (CR), iii) suelo impactado por el ARA o control negativo (CN) y iv) suelo impactado con el ARA bioestimulado en secuencia con la SOMI, cuya composición química fue g/L: NH₄NO₃ 10, K₂HPO₄ 2.5, KH₂PO₄ 2.0, MgSO₄0.5, NaCl 0.1, CaCh₂ 0.1, FeSO₄ y 1.0 mL/L de una solución de microelementos con la siguiente composición mineral g/L: H₃BO₃ 2.86, ZnSO₄7H₂O 0.22, MgCl₂ *7H₂O 1.81, pH 6.8. Para la BIS mediante la SOMI se aplicaron 18 mL/Kg/3dias/mes, mientras que para la BIS que complementariamente facilito la oxidación del ARA se aplicó la LOCO al 3% (p/p) por 30 días¹² luego se sembraron las semillas de P. vulgaris y V. sativa (proporcionadas por la Secretaria de Agricultura Ganadería y Recursos Hidráulicos, del Gobierno de México).

Estas semillas se potenciaron con P. chrysogenum/M. echinospora pertenecientes a la colección del Laboratorio de Microbiología Ambiental del IIQB de la UMSNH cultivadas en agar hueso de aguacate (AHA)¹⁹ g/L: hueso de aguacate 10, peptona caseína 5, extracto de levadura 1.3, K₂HPO₄ 0.17, KH₂ PO₄ 2.61, MgSO₄ 1.5, NaCl 0.9, CuSO₄ 0.05, azul de bromotimol 10 ppm, detergente al 10 % 2.5 mL/L, solución de oligoelementos 1 mL/L, agar 18.0 g, pH ajustado a 6.5 el medio de cultivo se incubó 30 °C/48 h, entonces por cada 20 semillas de ambas leguminosas se inocularon con 1.0 mL en relación 1:1 de P. chrysogenum y M. echinospora, a una densidad de 1.5x10⁸ UFP/mL obtenida por cuenta viable en placa (CVP), entonces las semillas de P. vulgaris/V. sativa se sembraron en el suelo impactado por ARA dejándose crecer hasta plántula o 25 días después la siembra, luego incorporarse como AVE, con un tiempo mineralización de un mes²⁰ durante esta etapa de BIS se aplicó 1.0 mL de H₂O₂ de una solución al 3% (v/v)/sema na/mes. En tanto se cuantificó la densidad de MHAA oxidante de ARA por cuenta viable en placa (CVP), para ello se tomó 1.0 g de suelo en 9.0 mL de NaCl 0.85 % que se diluyó de 10^-1 a 10^-9, de ahí 0.2 mL se sembró en agar ARA o (AARA) con la siguiente composición g/L: peptona de caseína 5.0, extracto de levadura 1.0, H₂PO₄ 2.5, HPO₄ MgSO₄ 2.5, NaCl 1.0, solución de oligoelementos 1.0 mL, azul de bromotimol al 0.01%, 5.0 mL, agar 18.0, ARA emulsificador con DEGE con 4 mL/100 mL, este medio de cultivo se ajustó a pH 6.8 para las bacterias, a 7.5 para los actinomicetos y 6.0 para los hongos, las cajas se incubaron a 30 °C/48 h, este procedimiento se realizó por triplicado.^1,21 Mientras, la humedad del suelo durante la BIS se conservó al 80% de capacidad de campo. Al final de la BIS se determinó la concentración de ARA por método de Soxhlet (NMX-F-089-S-1978).²² En tanto en el suelo asegurar la mineralización del ARA en la fase final de la BIS, el pH derivado de la actividad microbiana se mantuvo a valores entre 6.5 a 6.7 con 1g de Na₂CO₃/500 g de suelo seco.²³ En una segunda fase, en el suelo al inicio y final de la BIS en secuencia, se realizó el análisis cuali-cuantitativo del ARA, para ello 3 g del suelo por triplicado se conservaron a 4 °C, se secaron a 28 °C/48 h, se homogenizo, cada muestra colocándose en tubos con tapón rosca, se adicionaron 3.0 mL de hexano (pureza 98.5 %, ACS-Sigma Aldrich grado HPLC), se agitaron por 60 s en Vortex Genie II, se filtró 3 veces en un embudo de separación, se pasó por un filtro de algodón 0.5 cm y 1 g de MgSO₄ (sulfato de magnesio), luego se evaporó el solvente a 28 °C/24 h, se aforó cada muestra a 1.0 mL para el análisis por cromatógrafo de gases Agilent Technologies serie 7890A, acoplado a masas serie 5975C, ahí se inyectó 1.0 L de muestra modo Splitless con el helio (99.995 % pureza) como gas acarreador en una columna capilar Zebron-5MS de 30 cm de longitud, con diámetro interno de 0.25 mm y espesor de película de 0.25 mm. La temperatura del inyector fue de 250 °C y la inicial del horno 50 °C con rampa de 30-150 °C, rampa 2 de 10 °C por min hasta 310 °C por 2 min. El detector de temperatura fue de 280 °C con tiempo de equilibrio de 3 min y una temperatura máxima de 320 °C.²⁴ Los resultados se validaron con ANOVA/Tukey HSD P<0.05% con el programa estadístico Statgraphics Centurión.²⁵

Resultados

En la tabla 2 señala las propiedades fisicoquímicas del suelo previo a la contaminación por el ARA a pH de 6.64 ligeramente acido, con una concentración de MO de 4.57% o una moderada cantidad de carbono orgánico, de textura clasificada como franco-arcillosa-arenosa o: arcilla 22.16%, limo 37.28% y arena 40.56%.

En la figura 2, se describe la BIS en secuencia múltiple de un suelo impactado por 75000 ppm de ARA, mediante un DEGE, una SOMI, a una humedad del 80% de la capacidad de campo, la integración estas acciones de BIS decrecieron el ARA original hasta 39925 ppm en 30 días, seguida de la BIS con la LOCO que ahora lo redujo a 10697 ppm en 30 días, mientras que la BIS del suelo mediante la siembra de las semillas de P. vulgaris y de V. sativa potenciadas con M. echinospora y P. chrysogenum, ambas leguminosas al nivel de plántula se incorporaron como AVE, con lo que el ARA se decreció hasta 2752 ppm en 55 días, en consideración a que la BIS es una proceso aeróbico la adición de H₂O₂, lo disminuyo hasta 1532 ppm, valor numérico estadísticamente diferente comparado con los 50102 ppm en el suelo impactado por ARA sin bioestimular o CN, cuya concentración fue inferior a la máximo aceptado por la NOM-138.

En la tabla 3, se presenta la BIS en secuencia de un suelo impactado por ARA, la densidad bacteriana heterotrófica aerobia oxidante de ARA registró 8.68x10⁶ UFC/g de suelo seco, valor numérico estadísticamente diferente comparado con la densidad bacteriana de 6.48x10⁶ UFC/g del suelo seco impactado por ARA sin BIS o CN, mientras que de los hongos oxidantes de ARA se registró una densidad de 7.11x10⁶ UFP/g de suelo seco, valor numérico estadísticamente diferente comparado con la densidad de los hongos de 4.04x10⁶ UFP/g en el suelo sin BIS, impactado por ARA o CN. En relación a los actinomicetos se detectaron 7.33x10⁶ UFP/g valor numérico estadísticamente distinto a la densidad de los actinomicetos de 3.15 x10⁶ UFP/g suelo seco en el impactado por ARA, sin BIS o CN.

En la tabla 4, se detalla la dinámica del pH durante la BIS secuencia del suelo impactado por 2752 ppm de ARA. Ahí se registró una disminución del pH desde 6.8 en el día cero hasta a 4.70 en el día 105, la caída de pH o acidificación del suelo inhibió la mineralización del ARA, por lo que se neutralizo con Na₂CO₃ cada 5 días, para restaurar y mantener el valor original de 6.64, comparado con el suelo impactado por ARA sin BIS o CN, ahí se registró una mínima variación de 6.7 en el día cero hasta 6.51 al día 130.

La figura 3 describe el perfil cromatográfico al inicio de la BIS en suelo contaminado por 75000 ppm de ARA, los picos de elución tuvieron tiempos que señalan compuestos de la fracción alifática, algunos con 12 a 35 carbonos que indicaron la existencia de dodecano, tetradecano, octadecano y eicosano. Además se detectaron alifáticos ramificados como: el pristano y el fitano, así como aromáticos del tipo: benceno, fenol, benzoantraceno, metildifenilo y naftaleno.

La figura 4 describe el perfil cromatográfico del ARA después de la BIS en secuencia múltiple del suelo, ahí se observó un evidente decremento de la fracción alifática lineal y ramificada, y menor de la aromática dada la estabilidad química que tiene es la recalcitrante.

Discusión

La figura 1 describe la dinámica de la BIS en secuencia múltiple en el suelo impactado por 75000 ppm de ARA mediante un DEGE al 0.5% que al emulsificar y solubilizar el ARA en el agua indujo una relativa y rápida mineralización¹⁸ pues la BIS mediante SOMI enriqueció el suelo con sales de NH₄NO₃, para balancear la relación C:N, apoyado por K₂HPO₄, KH₂PO₄ que estimularon a los MHAA a la oxidación del ARA, por ello fue indispensable ajustar la humedad del suelo al 80% de la capacidad de campo, lo que facilitó el intercambio de agua y Capara rápida oxidación del ARA.^27,11 Complementariamente se realizó la BIS con la LOCO al 3%, que aporto compuestos como urea, nucleótidos, además de NH₄, PO₄^-3, y MO sencilla: almidón y glucosa que favorecieron el cometabolismo de los HICO del ARA por MHAA.¹² Además la BIS mediante P. vulgaris y V. sativa o AVE potenciados con M. echinospora y P. chrysogenum, luego de ser

incorporados al suelo, la degradación de este material vegetal aportaron compuestos nitrogenados como: péptidos, aminoácidos, y urea, los que al mantener la relación C:N aseguraron la constante la mineralización del ARA, mientras que los compuestos de C sencillos, producto de la degradación del AVE como: la celobiosa, la glucosa mantuvieron la actividad de MHAA para el coometabolismo del ARA.¹³ Así, la BIS en secuencia múltiple redujo la concentración del ARA a un valor inferior al máximo aceptado por la NOM-138, en contraste con el suelo impactado por ARA sin BIS o C:N, que registró una mínima disminución de la mezcla por la atenuación natural por el exceso de C que desequilibró la relación C:N lo que evitó la oxidación.^3,28

La tabla 3 detalla la BIS, la secuencia múltiple del suelo impactado por ARA, por el enriquecimiento de compuestos orgánicos e inorgánicos de N, P y K se indujeron incrementos en las diferentes poblaciones que oxidan el ARA, mientras que en el suelo referido como C:N, se manifestó que no hubo cambio en la densidad de la población microbiana, como consecuencia del desbalance nutricional, la pobre difusión de gases como el O₂ y mínima disposición del H₂O que inhibió la actividad de esta población microbiana oxidante del ARA.^28,30

En la tabla 4, durante la dinámica de BIS en suelo con ARA, se registró una acidificación del pH por la oxidación parcial del ARA, cuando se generaron ácidos carboxílicos: cítrico, málico, succínico, acético, butírico, entre otros, dada la diversidad genética y bioquímica de actinomicetos, bacterias y hongos, primero durante la oxidación de la MO vegetal por incorporación de P. vulgaris y V. sativa como AVE,³¹ que inhibió la actividad MHAA oxidante del ARA, puesto que al neutralizar y mantener el pH entre 6.4 y 6.9 se observó una recuperación de la mineralización, lo que redujo la concentración del ARA.³²

En la Figura 4, presenta el perfil cromatográfico en suelo con 1532 ppm de ARA remanente de la BIS en secuencia múltiple después de 130 días, registrándose la ausencia de algunos componentes alifáticos de cadena larga como: el dodecano, el tetracosano, el heptacosano, el nonadecano y el eicosano en relación al cromatograma original al iniciar la BIS. Así como la ausencia de algunos aromáticos como: benceno, tolueno, xileno, benzoantraceno, naftaleno que son tóxicos y recalcitrantes en el ambiente, lo que indicaría que solo mediante acciones químico biológicas complejas como la BIS múltiple es factible eliminarlas.³²

Se concluye que de acuerdo a la complejidad de los componentes del ARA y la heterogeneidad del suelo fue necesaria la BIS del suelo mediante compuestos orgánicos, inorgánicos apoyados por otras acciones como el ajuste de la capacidad de campo y la regulación del pH durante la BIS, reducir drásticamente y un tiempo relativamente corto la concentración ARA desde 75000 ppm hasta 1532, valor inferior al límite máximo aceptado por la NOM-138 para manifestar que el suelo fue remediado.

Conflictos de intereses

Los participantes en esta investigación declaramos que no existe ningún problema en relación con la información aquí divulgada con las instituciones participantes así como quienes la financiaron total o parcialmente.

Agradecimientos

A la CIC-UMSNH proyecto 2.7 (2019), BIO NUTRA S.A de C.V, Maravatío y al Laboratorio de Edafología de la Facultad de Biología de la UMSNH, Mich. México.

La aprobación de la investigación por el Comité de Ética, de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo - México, siguió las pautas establecidas para este comité.

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