Respuesta de Phaseolus vulgaris a la inoculación de diferentes dosis de Trichoderma harzianum con el fertilizante nitrogenado reducido al 50%

Response of Phaseolus vulgaris to inoculation to different dose of Trichoderma harzianum with nitrogen fertilizer reduced at 50%

Márquez-Benavidez Liliana^1,2, Rizo-León Miguel Ángel¹, Montaño-Arias Noé Manuel³, Ruiz-Nájera Ramiro⁴ , Sánchez-Yáñez Juan Manuel^1*

¹Laboratorio Microbiología Ambiental. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich, México.
²Medio Ambiente y Residuos Sólidos, Instituto de Investigaciones Agrícolas Pecuarias y Forestales. Universidad Mi choacana de San Nicolás de Hidalgo,  Morelia, Mich, México. ]]> ³Área Botánica, Unidad Iztapalapa, Universidad Autónoma Metropolitana, Cd de México, México.
⁴Facultad de Ciencias Agronómicas,  Campus V, Apartado Postal 78, Universidad  Autónoma de Chiapas, Villa flores, Chis, México. 

*Dirección de contacto: Laboratorio de Microbiología Ambiental, Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Ed-B3 C.U. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich, México.

Juan Manuel Sánchez–Yáñez

E-mail address : syanez@umich.mx

Historial del artículo. 

Recibido Diciembre, 2016.
Devuelto mayo 2017
Aceptado junio, 2017.
Disponible en línea, agosto, 2017.

Resumen

En México el cultivo de Phaseolus vulgaris (frijol) requiere de fertilizante nitrogenado (FN) para suplir su demanda nutricional una de los comunes es el NH₄NO₃ (nitrato de amonio), que en exceso, causa perdida de productividad del suelo. En P. vulgaris una alternativa ecológica para optimizar la aplicación de FN reducido al 50 % es inocularlo con microorganismos promotores del crecimiento vegetal del tipo Trichoderma harzianum, que pueden mejorar la capacidad de absorción radical del FN. El objetivo de esta investigación fue analizar la respuesta de P. vulgaris a la inoculación con 3 dosis de T. harzianum con NH₄NO₃ reducido al 50%. El experimento se realizó en invernadero, bajo un diseño experimental de bloques al azar: con 5 tratamientos y 5 repeticiones, ahí100 g de semillas de P. vulgaris se inocularon con:10 g, 20 g, 30 g de T. harzianum respectivamente, las semillas se sembraron en jarras de Leonard con el FN al 50 %: las variables respuesta utilizadas fueron: porcentaje (%) y días de germinación, fenología: altura de plántula (AP) y longitud radical (LR); biomasa: peso fresco/seco aéreo y radical (PFA/PFR) /(PSA/PSR) a plántula, floración y madurez fisiológica, los datos experimentales se analizaron por ANOVA/Tukey HSD p < 0.01 %. Los resultados indican que la inoculación de semillas de P. vulgaris con T. harzianum independientemente de la dosis decrecieron el tiempo de emergencia de las semillas, comparado con la semilla sin inocular irrigada solo agua y/o alimentada con una solución mineral, a plántula con la dosis 30 g de T. harzianum/100 g de semilla al 50% del FN registro un 0.14 g de PSR valor numérico comparado con los 0.08 g de PSR de P. vulgaris sin inocular con el FN al 100%  o control relativo (CR), a floración con 20 g de T. harzianum/100 g de semilla con el FN al 50%, registro 3.2 g de PSR valor numérico estadísticamente diferente a los 1.4 g PSR de P. vulgaris o CR; a madurez fisiológica, con 30 g de T. harzianum/100 g de semilla con el FN al 50%, registro un PF de 4.2 g del grano, un PS de 1.2 g, ambos valores numéricos fueron estadísticamente diferentes a los 1.9 g de PF, 0.6 g de PS del grano en P. vulgaris (CR). Lo anterior sugiere que T. harzianum con el FN al 50%, ejercieron un efecto positivo sobre la fenología y biomasa de P. vulgaris, probablemente mediante la conversión de exudados de semillas y raíces en sustancias promotoras del crecimiento vegetal (SUPOCEVE), que optimizaron el FN al aumentar la cantidad de raíces y capacidad de absorción radical, de acuerdo con la dosis de inoculo de T. harzianum, empleado sin afectar su sano crecimiento y evitaron el excedente del FN que causa la perdida de la productividad del suelo.

Palabras clave: Phaseolus vulgaris, dosis de inoculo, Trichoderma harzianum, fertilizante nitrogenado, absorción radical.

Abstract

The production of Phaseolus vulgaris (bean) requires nitrogen fertilizer (NF) as a NH₄NO₃ (ammonium nitrate), NF in excess causes soil´s lost productivity. An ecological alternative to optimize the use NF reduced at 50% in P. vulgaris is to inoculate it with a plant growth promoting microorganisms (PGPM) as well as Trichoderma harzianum. The objective of this research was to analyze Phaseolus vulgaris´s response to T. harzianum at of NH₄NO doses reduced at 50%. In that way P. vulgaris was inoculated with T. harzianum at 3 different doses 10 g, 20 g and 30 g/ 100 g of P. vulgaris. In that sense bean was sowing in Leonard jars with 50% NF under an experimental design of random blocks: 5 treatments and 4 replicates. While t variable-variables used were: percentage (%), days of germination, phenology: plant height (SH) and root length (RL), and biomass: aereal and root fresh weight as well as dry weight (AFW / ADW) / (RFW / RDW) at seedlings, flowering and physiological maturity stages, experimental data were analyzed by ANOVA / Tukey HSD P <0.01%. The results indicate that at the germination T. harzianum caused a positive effect on time of P. vulgaris seed were able to germinate. At seedling stage of P. vulgaris with 30 g of T. harzianum/100 g of seed at NH₄NO₃ at 50% was recorded 0.14 g of higher of RWF compared to 0.08 g RDW of P. vulgaris with NH₄NO₃ at 100% or relative control (RC) at flowering stage P. vulgaris with 20 g of T. harzianum/100 g of seed NH₄NO₃ at 50% recorded 3.2 g of RDW value was statistically different to 1.4 g RDW of P. vulgaris using as a RC, at physiological maturity, P. vulgaris with 30 g of T. harzianum/100 g of seed with NH₄NO₃  at 50% recorded a fresh weight seed (FWS) of 4.2 g per seed and a dry weight seed (DWS) of 1.2 g values higher 1.9 g of FWS and 0.6 g DWS/g of P. vulgaris or RC. Results showed by the phenology and biomass indicate a positive response in P. vulgaris, due a T. harzianum which transformed seed and root exudates in plant growth promoting substances or phytohormones, for optimizing NH₄NO₃  reduced at 50% by increasing the amount of roots which improved P. vulgaris´s absortion radical to keep plant health.

Key words: Phaseolus vulgaris, doses of inoculant, Trichoderma harzianum, nitrogen fertilizer, radical absorption, phytohormones.

En México  el cultivo  Phaseolus vulgaris (frijol) es de importancia agronómica por su elevado consumo, para suplir su demanda nutricional básica, requiere fertilizante nitrogenado (FN); en forma de NH₄NO₃ (nitrato de amonio), que es uno de los estados minerales más simple de absorción radical (Yedidia et al. 2001, Lara-Flores 2015), no obstante, cuando el FN se aplica en exceso, causa la pérdida de la productividad del suelo, en parte al acelerar la mineralización de la materia orgánica que es la reserva de C (carbono) en el suelo, lo que afecta su fertilidad, al mismo tiempo el NH₄NO₃ que no es absorbido es potencialmente un contaminante de agua superficial y acuíferos (Inbar et al. 1994, Palafox-Caballero et al. 2005, Armenta-Bojórquez et al. 2010). Una alternativa de solución ecológica, para una absorción eficaz del FN en el cultivo de P. vulgaris es reducir y optimizar esa dosis con microorganismos promotores del crecimiento vegetal, Trichoderma harzianum (Windham et al. 1985, Cubillos-Hinojosa et al. 2009, López et al. 2010, Chungata-Tacuri 2014), tiene la capacidad de convertir los exudados de raíz en sustancias promotoras del crecimiento vegetal (SUPOCEVE) como el ácido 3-indol acético (AIA), que incrementa la cantidad de pelos radicales, que exploran el suelo y mejoran la absorción radical del NH₄NO₃ (Sánchez et al. 2005, Jiménez et al. 2011). Normalmente T. harzianum es bien conocido porque se recomienda, para el control de hongos y bacterias fitopatógenos, pero poco en relación como HOPOCEVE en especial el efecto de la densidad del inoculo en la respuesta de P. vulgaris, cuando la dosis del FN se reduce al 50% (Suárez Meza et al. 2008), sin afectar su sano crecimiento, además de que ello representa una opción distinta a la convencional basada en Rhizobium etli, que puede resolver la demanda nutricional de P. vulgaris por el  N (nitrógeno), fundamental en el sano crecimiento de esta leguminosa, pero que ofrece  ningún tipo de prevención de enfermedades causadas por bacterias y hongos fitopatógenos en P. vulgaris. Sin embargo dado que el conocimiento sobre el empleo de diferentes dosis de T. harzianum en la producción de P. vulgaris es limitada, en especial relacionado con la fertilización nitrogenada, se pretende que con esta investigación, dar un valor potencial a T. harzianum, como una interesante y prometedora opción para la optimización del FN reducido a un nivel crítico, pues el N es uno de los insumos de mayor valor económica requeridos para su cultivo. Por lo anterior el objetivo del trabajo fue analizar la respuesta de P. vulgaris a la inoculación a 3 dosis de T. harzianum  con el FN reducido al 50%.

Materiales y métodos 

El ensayo se realizó en el invernadero del Laboratorio de Microbiología Ambiental del IIQB-UMSNH en jarras de Leonard (Fig. 1), las condiciones microclimáticas promedio en este invernadero fueron: temperatura de 23.2 °C, luminosidad de 450 µmol•m-²•s-¹ y humedad relativa de 67%. P. vulgaris se sembró para analizar su respuesta a T. harzianum a dosis de 10 g, 20 g y 30 g/100 g de semilla con el 50% del FN. Para ello en la base de la jarra se colocó 500 mL del FN en forma de NH₄NO₃, en concentración 1.0 g/L o 100% y 0.5 g/L o 50% (de la dosis del FN recomendada para esta región del país) (Lara-Flores 2005) a pH 6.8-7.0. La base de la jarra se unió con algodón al recipiente con el FN (García-González et al. 2005) que permitió el paso desde la base hasta la parte superior que contenía un 1 kg de suelo: previamente el suelo se solarizó para reducir plagas y enfermedades (Banks et al. 2003), posteriormente se tamizó con una malla del N^o 20. Este suelo se clasifico como arcilloso con pH moderadamente acido de 6.02, bajo contenido de materia orgánica de 3.58%, alta capacidad de intercambio catiónico de 26.64 C mol (+) Kg^-1, con una textura: arcilla 50%, limo 7% y arena 43% (Basumatary et al. 2012). En la Tabla 1 se muestran el diseño experimental de bloques al azar con 5 tratamientos y 3 repeticiones (García-González et al. 2005). El suelo de cada jarra se irrigo con agua potable antes de sembrar 4 semillas de P. vulgaris por inoculado con T. harzianum.

Figura 1. Jarra de Leonard (García-González et al. 2005)

Tabla 1. Diseño experimental para evaluar la respuesta de Phaseolus vulgaris a la inoculación a 3 dosis de Trichoderma harzianum con el NH₄NO₃ al 50%

]]> (+)= aplicado;  (–) = si aplicar

Origen de la cepa de Trichoderma harzianum. Se utilizó una cepa de T. harzianum liofilizada, originalmente aislada de materia orgánica en descomposición (Romero-Garcia et al. 2016), proporcionada por el Laboratorio de Microbiología Ambiental del Instituto de Investigaciones Químico Biológicas de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.

Inoculación de la semilla de Phaseolus vulgaris con Trichoderma harzianum. Las semillas de P. vulgaris se desinfectaron con hipoclorito de sodio (Clorox®) al 0.6% /5 min, luego se enjuagaron 5 veces con agua potable estéril, se desinfectaron con alcohol 70%/5 min, se enjuagaron 5 veces con agua potable estéril, entonces 64 semillas se depositaron en una bolsa de plástico 100 g para cada tratamiento como se señala en la Tabla 1, Para ello se emplearon con 10 g, 20 g y 30 g de T. harzianum/100 g de semilla de P. vulgaris.

Para determinar la densidad del inoculo del hongo se empleó la técnica de cuenta viable en placa en agar papa dextrosa, mediante diluciones seriadas en NaCl 0.85% (solución salina) y detergente al 0.1% (la Corona^MR), inicialmente había 4 x10⁶ unidades formadores de propagulos o UFP/g de inoculo (Sánchez-Yáñez 2007, Romero-García et al. 2017).

Variables respuesta de Phaseolus vulgaris a la inoculación con tres dosis Trichoderma harzianum. Para esta etapa se tomaron en cuenta las variables-respuesta: porciento (%) de germinación y días a emergencia de las semillas de P. vulgaris a los 8 días después de la siembra. El primer muestreo se realizó a plántula aproximadamente 20 días posteriores de la siembra, la floración a los 57 días y la madurez fisiológica a los 90 días después de la siembra.

El diseño experimental consistió en 5 tratamientos fueron: T. harzianum 3 dosis (10, 20 y 30 g/ 100 g de P. vulgaris con NH₄NO₃ al 50%, P. vulgaris sin inocular con NH₄NO₃ al 100%  o control relativo (CR), P. vulgaris irrigado solo con agua o control absoluto (CA): las variables-respuesta de P. vulgaris a T. harzianum fueron la fenología altura de planta (AP) y longitud radical (LR), y la biomasa, el peso fresco aéreo (PFA) y peso fresco radical (PFR), el peso seco aéreo (PSA) y el peso seco radical (PSR, todos los datos experimentales se analizaron por ANOVA / Tukey HSD, p < 0.01% (Walpole et al. 2007).

Resultados 

En la Tabla 2 se muestra el porcentaje (%) de germinación y los días a emergencia de P. vulgaris inoculado con T. harzianum, el NH₄NO₃ al 50%; y la dosis de 30g de T. harzianum/100 g de semilla, se registró un 93.8 % de germinación en 4.5 días de emergencia, P. vulgaris con 20 g de T. harzianum/100 g se registró un 90.6 % de germinación en 4.5 días de emergencia, estos valores numéricos fueron estadísticamente diferentes comparados con los 93.8 % de germinación en 7.3 días de emergencia en P. vulgaris alimentado con el NH₄NO₃ al 100 % o CR.

Tabla 2. Porcentaje de germinación y días a emergencia de semillas de Phaseolus vulgaris a tres dosis de Trichoderma harzianum con el NH₄NO₃ al 50%

En la Tabla 3, se muestra la fenología a nivel plántula de P. vulgaris, en donde la dosis 30 g de T. harzianum/100 g de semilla con el  NH₄NO₃ al 50% registro una AP de 12.7 cm y una LR de 18.4 cm, mientras que P. vulgaris a la dosis 20 g de T. harzianum/100 g de semilla con el NH₄NO₃ al 50%, alcanzo una AP de 14.4 cm y una LR de 18.1 cm; estos valores numéricos fueron estadísticamente distintos comparados con la AP de 19.6 cm y LR de17.5 cm en P. vulgaris alimentado con el NH₄NO₃ al 100% o CR.

Tabla 3. Respuesta de Phaseolus vulgaris a tres dosis de Trichoderma harzianum con el NH₄NO₃ al 50% en su fenología a nivel de plántula

* Valores con letras distintas tienen diferencia estadística según Tukey < 0.01%. ± Error estándar. **=NH₄NO₃ al 50%.

En la Tabla 4, se muestra la respuesta de P. vulgaris a la dosis 20 g de T. harzianum/100 g de semilla con el NH₄NO₃  en función de la biomasa, que registro valores en el PFA con 3.11 g, un PSA de 0.27 g, con un PFR de 1.65 g, un PSR de 0.11 g. Mientras que P. vulgaris con la dosis 30 g de T. harzianum/100 g de semilla con el NH₄NO₃ al 50%, que registro un PFA de 2.51 g, un PSA de 0.25 g, un PFR de 1.56 g, un PSR de 0.14 g, estos valores fueron estadísticamente diferentes comparados con el PFA de 3.64 g, el PSA de 0.28 g, el PFR de 1.33 g y el PSR de 0.08 g en P. vulgaris alimentado con el NH₄NO₃ al 100% o CR.

Tabla 4. Respuesta de Phaseolus vulgaris a tres dosis de Trichoderma harzianum con el NH₄NO₃  al 50% sobre su biomasa a nivel de plántula

*=Valores con letras distintas tienen diferencia estadística según Tukey < 0.01%. ± =Error estándar. **=NH₄NO₃ al 50%.

Tabla 5. Respuesta de Phaseolus vulgaris a tres dosis de Trichoderma harzianum con el NH₄NO₃ al 50% en su biomasa, a nivel de floración

* Valores con letras distintas tienen diferencia estadística según Tukey < 0.01%. ± =Error estándar. **=NH₄NO₃ al 50%.

En la Tabla 6 se muestra la respuesta de P. vulgaris a tres dosis de T. harzianum con el NH₄NO₃ al 50% a madurez fisiológica, con la dosis de 30 g de T. harzianum/100 g semilla con el NH₄NO₃  al 50% registro un PF de grano de 4.2 g, un PS de grano de 1.2 g, ambos valores numéricos fueron estadísticamente diferentes al PF del grano con 1.9 g, el PS del grano con 0.6 g en P. vulgaris no inoculado con el NH₄NO₃ al 100% o CR.

Tabla 6. Respuesta de Phaseolus vulgaris a tres dosis de Trichoderma harzianum con el NH₄NO₃ al 50% sobre el peso fresco y seco de elementos del rendimiento a nivel de madurez fisiológica

* Valores con letras distintas tienen diferencia estadística según Tukey < 0.01%. ± Error estándar. **=NH₄NO₃ al 50%.

Discusión 

En la Tabla 2 se muestra el porcentaje (%) de germinación y los días a emergencia de P. vulgaris con la dosis de 30 g de T. harzianum/100 g semilla con el  NH₄NO_3,  al 50 %, sugieren que la inoculación del hongo en P. vulgaris; indujo mediante un mecanismo dependiente de SUPOCEVE, derivadas del conocido efecto espermatosfera, en el cual cuando la semilla embebe agua, se activa el metabolismo del almidón en el cotiledón, en consecuencia se generan compuestos orgánicos (ácidos orgánicos, aminoácidos y vitaminas), relacionados con la degradación del endospermo de la semilla, pues de acuerdo con la literatura, se inducen enzimas que facilitan el rompimiento de la cubierta, con lo que se acorta el tiempo de germinación de la semilla (Windham et al. 1985), la primer acción benéfica de T. harzianum durante la colonización del primordio de raíz, que causara que el efecto positivo se mantenga durante todas las etapas del crecimiento de P. vulgaris (Chungata-Tacuri 2014, Romero-García et al. 2016). Mientras que los valores numéricos en esta fase, fueron estadísticamente diferentes comparados con los mismas variables en P. vulgaris alimentado  solo con el NH₄NO₃ al 100 % o CR.

En la Tabla 4, se presenta que en específico con la dosis 30 g de T. harzianum/100 g semilla de P. vulgaris con el NH₄NO₃  al 50 % donde se registró, el mayor valor de PSR, dado que este hongo al colonizar la raíces, de acuerdo con la literatura, provoca cambios en la biomasa que son evidentes, el incremento en el PSR, sugiere que podría convertir los exudados radicales ricos en compuestos de C (carbono) del tipo ácido y aminoácidos, en SUPOCEVE, las que según la literatura y los valores numéricos de PSR, indujeron una mayor mitosis y cariocinesis que en consecuencia permite el incremento en el peso de la raíz (Yedidia et al. 2001, López et al. 2010), este hecho indica que la inoculación de T. harzianum tiene potencial para emplearse en más de una especie vegetal, para una agricultura con tendencia a la sustentabilidad, pues se ha demostrado que la transformación de los exudados radicales de P. vulgaris, son similares a aquellos descritos en otras plantas domesticas (Jiménez et al. 2011), en relación el valor numérico del PSR del P. vulgaris fue estadísticamente diferente comparado con el misma variable en P. vulgaris usado como CR, lo que apoya que la inoculación con T. harzianum puede ejercer un efecto nutricional similar al registrado cuando le leguminosa se alimenta con dosis recomendada para un sano crecimiento       ( Lara-Flores 2015).

En la tabla 5, se muestra el efecto positivo de 20g de T. harzianum /100 g P. vulgaris con el NH₄NO₃ al 50% donde se registró un PSA de 7 g un PSR de 3.2 g, datos que indirectamente indican la posible conversión de los exudados de la raíz de los exudados de raíz en SUPOCEVE, sintetizados por T. harzianum en zona de la planta asociada con la absorción del FN que de acuerdo con la literatura al respecto, tales sustancias reguladores estimularon la mitosis y cariocinesis (Yedidia et al. 2001) simultáneamente una proliferación de raíces secundarias que mejoraron la absorción y la optimización del FN (Inbar et al. 1994 ), disponible en el suelo, López et al. 2010), a pesar de reducirlo al 50%. En relación a los valores numéricos de la biomasa de P vulgaris inoculado con T. harzianum fueron estadísticamente diferentes a los 5.4 g de PSA y 2.2 g de PSR de P. vulgaris alimentado con el NH₄NO₃ al 100% o CR. Además de que se registró un efecto positivo de las dosis 20 g y 30 g de T harzianum/100 g semilla de P. vulgaris con el NH₄NO₃, al 50%, sin que se haya detectado un problema nutricional en la demanda nutricional de la leguminosa, lo cual indirectamente demuestra la optimización del FN, cuando sus raíces fueron colonizadas por T. harzianum, en principio tanto por las esporas como por el micelio (Sánchez et al. 2005), pues está demostrado que este hongo utiliza los exudados de la raíz como fuente de carbono (C) y energía (Caicedo et al. 2010, Camargo-Cepeda et al. 2013), finalmente dado que T. harzianum también posee la capacidad para la generación de antimicrobianos, en las raíces vegetales contra bacterias y hongos fitopatógenos (Suárez-Meza et al. 2008), es posible que la colonización de la semilla y raíces también prevengan o reduzca considerablemente problema de enfermedades vegetales por agente biológicos (Windham et al. 1985, Jiménez et al. 2011). Con base en los resultados anteriores se concluye que es conveniente seleccionar la dosis de T. harzianum suficiente para alcanzar los mejores resultados en P. vulgaris en especial cuando, como primer acción optimizar el FN, bajo la consideración de que los propagulos de este hongo tienen una limitada supervivencia en el suelo. Mientras que la respuesta positiva de P. vulgaris a T. harzianum, se constituye con otra opción interesante para la producción sustentable de P. vulgaris en comparación con Rhizobium etli, puesto que T. harzianum tiene la ventaja de que además de su actividad como promotor de crecimiento vegetal, además previene el ataque de bacterias y hongos fitopatógenos, en el sistema radical de la leguminosa, de esta forma la inoculación de T. harzianum en P. vulgaris podría resolver dos problemas: uno de orden nutricional y el otro fitosanitario.

Conflictos de intereses

Los autores de este artículo, declaran que en la planeación, ejecución y redacción no existe conflicto de intereses, tampoco con las instituciones relacionadas y con aquellas que apoyaron económicamente su realización.

Agradecimientos

Al proyecto 2.7 (2017) “Aislamiento y selección de microorganismos promotores de crecimiento vegetal de desierto y bosque”; de la Coordinación de la Investigación Científica de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich, México.

BIONUTRA, S.A de C.V, Maravatío, Micho, México A CONACYT-FORDECYT-SICDET del Gobierno del Estado de Michoacán por beca para el segundo autor.

Literatura citada

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