Capacidad biocontroladora de Beauveria brongniartii (Sacc.) y Metarhizium anisopliae (Metsch.,) en el control de pulgones Macrosiphum euphorbiae (Hemiptera: Aphididae)
Biocontrol capacity of Beauveria brongniartii (Sacc.) and Metarhizium anisopliae (Metsch.) in the control of aphids Macrosiphum euphorbiae (Hemiptera: Aphididae)
Rojas-Gutiérrez René Leopoldo1*, Loza-Murguia Manuel2,3, Vino-Nina Lourdes1, Serrano-Canaviri Teófilo1
1Universidad Católica Boliviana San Pablo - UCBSP. Unidad Académica Campesina Tiahuanacu UAC-T. Ingeniería Agronómica. Km 74. Carretera Internacional La Paz-Desaguadero. Tel +591-2-2895100. La Paz, Estado Plurinacional de Bolivia.
2Universidad Católica Boliviana San Pablo - UCBSP, Unidad Académica Campesina Carmen Pampa-UAC-CP, Ingeniería Agronómica. Coroico-Nor Yungas-La Paz, Estado Plurinacional de Bolivia. Tel +591(2)8781991. ]]>
*Dirección de contacto: Unidad Académica Campesina Tiahuanacu UAC-T. Ingeniería Agronómica. Km 74. Carretera Internacional La Paz-Desaguadero. Tel +591-71279117. La Paz, Estado Plurinacional de Bolivia.
René Leopoldo Rojas-Gutiérrez
E-mail address: renergy231@hotmail.com
Historial del artículo.
Recibido febrero, 2015.
Devuelto noviembre 2015
Aceptado noviembre, 2016.
Disponible en línea, febrero, 2017.
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Resumen
Con el interés de desarrollar tecnologías alternativas en el control de pulgones (Macrosiphum euporviae), se evaluó la capacidad biocontroladora de los hongos entomopatógenos Beauveria brongniartii y Metarhizium anisopliae. Par el estudio se colectó hongos nativos de 3 partes del altiplano central (Achacachi, Viacha y Patacamaya), se aislaron de insectos momificados y purificaron en laboratorio, los aislados dieron como resultado hongos pertenecientes al género Beauveria sp., y Metarhizium sp. De estos aislados se sacó su concentración inicial y todos fueron ajustados a la mínima concentración presentada en uno de los aislados que fue de 9.5 x 10⁴ conidios/mL con estas concentraciones se realizó la prueba de virulencia durante 144 h, los aislados 2BbVch, 1BbAch, 1MtAch y 3BbPtm produjeron más del 50% de mortalidad, indicando que los aislados del genero Beauveria resultaron ser mejores. Con los aislados que demostraron mejor mortalidad se los sometió a una segunda prueba de la determinación del tiempo letal 50 y 80 (Tl50), (Tl80) en donde el aislado 2BbVch demostró un menor tiempo en controlar el 50 y 80% de afidos con 78.1 y 123.8 h respectivamente. Se determinó la concentración letal 50 y 80 (Cl50), (Cl80), en donde se pudo verificar que el aislado 2BbVch y 1BbAch requieren concentraciones mínimas de 2.5x10⁴ y 5.1x10⁴ conidias/mL, para controlar el 50% de pulgones y a una concentración de 1.3x105 y 1.8x105 conidias/mL para controlar 80% de pulgones.
Palabras clave: Beauveria sp., pulgones, Metarhizium sp., hongos nativos, tiempo letal, concentración letal.
Abstract
Aiming to develop alternative technologies in controlling aphids (Macrosiphum euporviae), the biocontrol ability of entomopathogenic fungi Beauveria brongniartii and Metarhizium anisopliae evaluated. Par study native fungi of 3 parts of the central highlands (Achacachi , Viacha and Patacamaya) , which is isolated from the mummified insects and purified in the laboratory, the isolates were as fungi of the genus Beauveria result and Metarhizium were collected. Of these isolates its initial concentration was removed and all were adjusted to the minimum concentration lodged in one of the isolates was 9.5 x 10⁴conidia/mL at these concentrations the virulence test was performed for 144 hours , where isolated 2BbVch , 1BbAch , 3BbPtm 1MtAch and produced more than 50 % mortality , indicating that the genus Beauveria isolates proved to be better . With isolates that demonstrated improved mortality were subjected to a second test determining the lethal time 50 and 80 ( LT50 ) ( TL80 ) where 2BbVch isolated showed a lower time control 50 and 80% with 78 aphids 1 and 123.8 hours respectively . 50 and the lethal concentration 80 ( IC50 ) was determined, ( IC80 ), where it was observed that the isolated 1BbAch 2BbVch and require minimal concentrations of 2.5 × 10⁴ and 5.1 x 10⁴ conidia/mL, to control 50% of aphids as a concentration of 1.3 x 105 to 1.8 x105 conidia/mL for 80 % control of aphids.
Key words: Beauveria sp., aphids, Metarhizium sp., native fungi, lethal time, lethal concentration.
Introducción
]]> Los hongos entomopatógenos (HEP) tienen hospederos relativamente específicos con mínimo efecto en organismos benéficos, pueden ser compatibles con otros programas de manejo integrado de plagas, es conocido que tiene baja toxicidad en mamíferos, su reproducción no requiere alta tecnología de aquí que sea una alternativa viable para el uso en la agricultura (Ekesi 1999).Los HEP constituyen actualmente una alternativa para el control de insectos trasmisores de enfermedades, frente al uso indiscriminado de insecticidas (Pucheta et al. 2006). El interés por la investigación en América de los HEP ha sido enfatizado por Alves et al. 1986. En este sentido, se han reportado más de 750 especies de casi 100 géneros que pueden infectar insectos (Khachatourians 1996). Beauveria bassiana, Beauveria brongniartii, Langenedium giganteum, Lecanicillium lecanii, Metarhizium anisopliae e Isaria fumosorosea, han sido utilizados comercialmente (Wraight et al. 1998). Los HEP inician el proceso de infección en los insectos cuando las esporas toman contacto con la superficie del integumento (Jones 1994) y no siempre ser ingeridos para que se realice el control (Carruthers & Hural 1990).
El contacto puede ocurrir a través de los espiráculos, partes bucales y membranas inter-tegumentales (Kershaw & Talbot 1998). El tiempo para la colonización puede variar de 3 a 11 días dependiendo del patógeno, del insecto y de las condiciones ambientales (Alves et al. 1986), la reproducción del patógeno ocurre entre las 48 y 60 h. Al consumir los nutrientes el hongo inicia un crecimiento micelial invadiendo todos los órganos del hospedero, finalmente las hifas penetran la cutícula desde el interior del insecto y emergen a la superficie iniciando la formación de esporas cuando la humedad relativa es adecuada (Gillespie & Claydon 1989). A pesar que el insecto activa su sistema inmune a través de procesos como la melanización, fagocitosis, nodulación y encapsulamiento (St. Leger & Roberts 1997), los hongos desarrollan mecanismos que le permiten evitar las defensas, tales como cambios en la pared celular y producción de sustancias inmunomodulatorias o toxinas fúngicas (Khachatourians 1991, 1996).
Por lo expuesto, es necesario desarrollar métodos de control ecológicos u orgánicos como el control biológico, mediante trabajos de investigación con referente al control del pulgón (Macrosiphum euphorbiae) con HEP nativos, y establecer criterios alternativos para control de plagas en ambientes controlados, carpas solares o invernaderos, con lo que se pretende aminorar las pérdidas económicas existentes debido a la proliferación de esta plaga en la actualidad, sin provocar daños al medio ambiente por ser un método de control ecológico, de ahí que el objetivo de la presente investigación fue, evaluar la capacidad biocontroladora de los hongos nativos (Beauveria brongniartii Sacc., y Metarhizium anisopliae Metsch.,) sobre pulgón Macrosiphum euphorbiae (Hemiptera: Aphididae) en condiciones de laboratorio.
Materiales y métodos
Localización. El presente trabajo de investigación se realizó en dos etapas, la primera etapa para la preparación de medios de cultivo, aislamiento, identificación, y formulación de concentraciones de hongos que se realizó en los laboratorios de la Unidad Académica Campesina de Tiahuanacu dependiente de la Universidad Católica Boliviana “San Pablo” ubicada a 72 km de la ciudad de La Paz carretera internacional La Paz-Desaguadero. En la segunda etapa que fue la fase experimental se realizó en la comunidad Copalacaya del municipio de Viacha, primera sección municipal de la provincia Ingavi, del departamento de La Paz ubicado en el altiplano central a 32 km, de la ciudad de La Paz y una elevación de 3877 msnm, la comunidad se encuentra situada entre los paralelos, 16º43’79” latitud sur, 68º17’48” latitud oeste.
Material biológico. Los hongos de interés se colectaron de insectos vivos y muertos dentro de cultivos como el de papa principalmente, de tres puntos del altiplano central. Los insectos de estudio, en este caso los pulgones se colectaron de las carpas solares de la granja de centro de rehabilitación Remar del municipio de Viacha ubicado a 3.5 km al este de la ciudad de Viacha.
Preparación de medios de cultivo. Se ha desinfectado el lugar de trabajo con alcohol al 70 % e hipoclorito de sodio al 6%, posteriormente se procedió al pesado del medio de cultivo agar dextrosa papa (PDA) comercial Oxoid, en una balanza digital. Se pesó la cantidad requerida de acuerdo a la relación 500 g por12.8 L de agua.
Se recolectaron hongos de tres zonas: Achacachi, Viacha y Patacamaya (Tabla 1), se identificaron áreas de cultivo, donde se buscó insectos muertos o momificados por algún tipo de hongo, procediéndose a la recolección del insecto con una pinza, se la llevo a un tubo de ensayo con medio de cultivo ADP, se codifico con lo siguiente: lugar de colecta, fecha y tipo de insecto encontrado.
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Los tubos con las muestras fueron llevadas al lugar de estudio en una caja de plastoform Tecnopor, las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente media de 12 ºC por un lapso de 25 días hasta la aparición de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC´s) dentro del tubo.
Aislamiento del hongo. Después del desarrollo en ADP se procedió al aislamiento de la UFC´s de acuerdo al color del medio y aspecto, con ayuda de un aza se tomó parte de la UFC´s para su repique en otro medio de cultivo en tubos y cajas Petri estériles, se esperó su desarrollo a temperatura ambiente por 25 días hasta completo desarrollo, se realizaron varios repiques hasta obtener cultivos puros, (Castillo 2009).
Preparación de la muestras. Se realizó tinción con azul lactofenol (Cañedo & Ames 2004) que permite distinguir con facilidad las características morfológicas de los hongos en el microscopio, se cubrió con una gota de azul de lactofenol al centro del portaobjeto con el gotero, con ayuda de cinta adhesiva transparente se tocó a la colonia del hongo aislado e inmediatamente se pegó sobre la gota del colorante en el porta objeto para después observar al microscopio localizando con el objetivo de 10X, luego a 40X y por ultimo con el objetivo de 100X para poder observar la morfología tífica del hongo.
La identificación de los hongos se la realizo de acuerdo a las características descritas por: (Mier et al. 2002) la caracterización macroscópica y microscópica, incluye color de colonia, aspecto, consistencia, superficie, velocidad de crecimiento, tamaño, hifas, conidios y células conidiogenas.
Preparación de soluciones. A los tubos con cultivos puros se llenó con salina fisiológica para desprender los conidios y suspenderlas, de cada muestra se extrajo 25 mL de suspensión y se llevó a un matraz erlenmeyer estéril, se la agito en el agitador magnético para la dispersión de las conidios en la suspensión. Una alícuota de 1 mL aproximadamente de la solución fue tomada con la ayuda de una micropipeta y se la llevo a una cámara Neubauer para el conteo de conidios, este procedimiento se la realizo para cada muestra de aislados hongos.
Recolección de insectos. En ambientes protegidos de dimensión 20 x 8 m, ubicados al este de la ciudad de Viacha perteneciente a la granja del centro de rehabilitación Remar, se pudo evidenciar la presencia de insectos plaga entre ellos los pulgones, que se encontraron en una carpa de cultivos asociados con lechuga, alfalfa, acelga, brócoli.
Para la recolección de los insectos se siguió el procedimiento descrito por Zanabria (2009) se fabricó un frasco colector por succión de insectos pequeños de cuerpo blando. Se procedió con la colecta de los plantines existentes dentro de la carpa, y luego los insectos colectados fueron llevados en frascos al lugar de estudio.
Los insectos colectados se llevaron a un estereomicroscópio para su identificación de acuerdo a las claves taxonómicas descritas por: Hermoso de Mendoza 1996, Cermeli 1970. quienes mencionan que para la identificación de insectos de la familia Aphididae se toma en cuenta la morfología externa, como la forma de la cabeza, tipo de antenas, tipo de patas forma de las alas y forma de los sifones en la cauda todo esto para llegar con exactitud con la especie.
Evaluación del porcentaje de mortalidad
]]> Ajuste de la concentración. Todos los aislados fueron ajustados a la mínima concentración presentada en uno de los aislados después del lavado de las muestras y realizadas el conteo de conidias con la cámara Neubauer que fue de 9.5 x 10⁴ conidios/mL.Aplicación de la concentración. Con las suspensiones de conidios de concentración ajustadas se empapo en el papel toalla o absorbente con la ayuda de una micropipeta la cantidad de 2 mL en cajas Petri esterilizadas, se tomó como tratamiento los aislados de hongos con tres repeticiones cada uno más el testigo con sus respectivas repeticiones.
Los insectos colectados previamente fueron desinfectados con hipoclorito de sodio comercial al 1%, se colocaron en un número de diez por caja para su respectiva evaluación Montalva (2008).
Etapa de evaluación. El tiempo de evaluación se realizó hasta el momento en que uno de los tratamientos o cualquiera de sus repeticiones mostrara el 100% de mortalidad de los pulgones sometidos a prueba, lo que dio un tiempo de 144 h, las observaciones de mortalidad fueron realizadas cada 12 h.
Determinación del porcentaje de mortalidad. La evaluación se realizó contando los insectos muertos, con la ayuda de una lupa se observaron las características descritas por Becerra (2010), quien menciona que un insecto muerto se identifica de acuerdo a la coloración del insecto con respecto a su color natural, del volteo y movilidad de las patas.
El porcentaje de mortalidad de los insectos se calculó con la siguiente formula:
Determinación del tiempo letal medio. Con los resultados de la prueba anterior, se identificó a los aislados que presentaron mortalidad por encima de 50%, esto por demostrar su capacidad patogénica con respecto a los demás aislados.
Con el fin de determinar el tiempo de mortalidad que provoca cada concentración, se evaluó el tiempo letal 50 y 80 (Tl50) y (Tl80) que significa el tiempo que tarda en eliminar el 50 y 80% de la población expuesta de los afidos.
Para este cometido se tomaron datos de las pruebas realizadas anteriormente en intervalos de tiempo de 12 h que fueron las siguientes: 0, 12, 42, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132 y 144 h.
]]> Los datos fueron sometidos a un análisis de regresión probit de una relación tiempo respuesta, para determinar el tiempo letal correspondiente.Determinación de la concentración letal media. Para esta prueba se realizaron diluciones seriadas con los aislados que presentaron más del 50% de mortalidad de pulgones en las pruebas realizadas previamente, a partir de una concentración inicial de 9.5 x 10⁴ conidios/mL como se describe a continuación:
Las diluciones seriadas dieron como resultado las siguientes concentraciones: 9.5x104 conidias/mL., 9.5 x103 conidias/mL. 9.5 x 102 conidias/mL. 95 conidias/mL.
Con esta concentración se realizó la prueba de mortalidad de pulgones en el mismo intervalo de tiempo realizadas en la prueba anterior de 0 hasta las 144 h, con intervalos de 12 h, la prueba se realizó en el tiempo en que la mortalidad de los pulgones llego a más del 50% en las distintas concentraciones aplicadas esto con el fin de determinar cuál es la concentración letal para eliminar el 50 y el 80% de la población de afidos expuestos.
Factores de estudio. El factor de estudio (variable independiente) fueron los diferentes aislados de hongos nativos.
Variables de respuesta. i) Descripción macroscópica (color, aspecto, superficie, pigmentación del hongo en el medio de cultivo) y descripción microscópica (forma de conidióforos, estructura), ii) Porcentaje de mortalidad de pulgones a las 144 horas. iii) Tiempo letal 50 y 80 (Tl50), (Tl80), iv) Concentración letal 50 y 80 (Cl50), (Cl80).
Los datos obtenidos en el presente trabajo previo a la evaluación del análisis estadístico fueron corregidos con la fórmula de (Abbott 1925) esto para descartar otros factores que hayan provocado mortalidad, ajenos a los hongos.
Identificación de aislados de hongos nativos del género Beauveria y Metarhizium
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Así mismo las datos corregidos, antes de realizar el análisis de varianza (ANVA) fueron transformados a una transformación angular para datos expresados en porcentaje según la fórmula: arcosen√n en donde n es el dato en porcentaje según Arteaga (2003).
Para ambas evaluaciones tanto en el tiempo letal 50 y 80 (Tl50), (Tl80) y concentraciones letales 50 y 80 (Cl50), (Cl80) con los datos obtenidos fueron sometidos a análisis de regresión probit de una relación dosis respuesta descrita por Castillo (2004).
Modelo estadístico. Los resultados obtenidos, para su interpretación fueron sometidos a un análisis de varianza (ANVA) con el diseño completamente al azar (DCA) utilizando el programa Statistical Analysis System (SAS) versión 9.2 con un nivel de confianza de 95% con el siguiente modelo lineal Delgado-Callisaya (2013).
En donde:
Yij = variable de respuesta (mortalidad de pulgones).
µ= Media general.
]]> Ai = Efecto de la i – ésimo aislamiento.Eij = Error experimental.
Para la determinación tanto del tiempo letal como de la concentración letal los datos fueron sometidos a una evaluación de regresión probit de una relación dosis respuesta con los respectivos límites de confianza con la ayuda del programa estadístico STATGRAPHICS, centurión, XV.
Resultados
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Discusión
Los aislamientos 1Bb, 2Bb, 3Bb, 1Mt, 2Mt y 3Mt, que desarrollaron en medio de cultivo ADP (bajo condiciones de laboratorio a temperatura ambiente), las colonias pertenecientes al código Bb, presentaron colonias de color blanco crema de aspecto algodonoso pulverulento con superficie semi elevada de crecimiento moderado después de 20 días, que coincide con las características descritas por: Echevarría 2006, Hill & Allen (2000). Figura 1.
Las UFC´s con código Mt presentaron color blanco crema al inicio de su desarrollo (formación de hifas), pero a medida que desarrollo el mismo se empezó a notar un cambio de coloración de blanco crema verde claro lo que indica, el desarrollo de conidias, el aspecto de las colonias es de coloración uniforme pulverulento de superficie semi-elevada, todo esto concuerda con lo descrito por: Pik-Kheng et al. 2009, Cano et al. 2004.
]]> Ambos aislamientos de códigos Bb y Mt, presentaron pigmentación en el medio de cultivo, en los aislamientos de código Bb se presentó pigmentación de una coloración amarillo a un color rosa claro. En los aislamientos de código Mt la pigmentación fue de una coloración amarillo intenso característico de los hongos del genero Metarhizium.Según Vargas 2003, las UFC´s presentan pigmentación debido a la liberación de toxinas secretadas durante el crecimiento de las mismas, beuvericina en el caso de los hongos del genero Beauveria, y destruxinas en el caso de los hongos del genero Metarhizium, que serían causante de muerte de los insectos. Tabla 2.
La observación al microscopio, permiten identificar con más seguridad al género del hongo, en el caso de los aislamientos de código Bb a una objetivo de 40X observamos a conidios solitarios y en grupos ralos irregularmente denso también se puede observar la forma de conidióforos que forman racimos con hifas en zigzag en el ápice. Las conidias se producen en cada punto de flexión, los conidios tienen una base apicularmente estrecha que son hialinos y elipsoides característico de las hongos del genero Beauveria, descripción que coincide con lo que indica Luque 2011, Barnett & Hunter 1998. Figura 2.
Con imágenes del código Mt a un objetivo de 40X, podemos observar que la forma que presentan las células conidiogenas (fialidas), forma cilíndrica ápice redondeado o cónico y arreglado en densos himenios. Los conidióforos son ramificados repetidamente formando estructura semejante a un candelabro. Los conidios aceptados ovoides, formado cadenas usualmente arregladas en columnas prismáticas o cilíndricas o en masas solidas de cadenas paralelas, lo que concuerda con Cano et al. 2004, Cañedo & Ames 2004.
Cabe señalar que los resultados obtenidos bajo condiciones controladas, no pueden ser comparados con otras investigaciones similares debido a la escasa información que existe sobre afidos o pulgones controlados con hongos entomopatógenos de la especie en estudio. Sin embargo se han observado que existen estudios bajo condiciones de laboratorio en otros cultivos y ordenes de ácaros y otros insectos de cuerpo blando, lo cual sirve como referencia comparativa para este trabajo.
Las concentraciones iniciales post lavado de aislados de hongos de medios de cultivo, se puede evidenciar, el aislado 2BbVch presenta menor concentración, de ahí que fueron ajustadas a 9.5 x 10⁴ conidios/mL, para determinar la prueba de virulencia de diferentes aislados de hongos para el control de afidos. Tabla 2.
El análisis de varianza (ANVA) las diferencias significativas (P<0.05) en los aislados nativos de HEP, con coeficiente de variación 21.5 % que indica que hubo precisión en el ensayo por estar en el rango de aceptación y no presentar dispersión con respecto a la media. Tabla 3.
Los promedios de mortalidad de pulgones por efecto de los aislados de hongos nativos, y evidenciar 2BbVch de la localidad Viacha y 1BbAch de Achacachi correspondiendo al género Beauveria siendo estadísticamente similares en su capacidad de causar mortalidad de afidos con promedios de 82.3 y 75.0% respectivamente, el aislamiento 1MtAch de Achacachi del género Metarhizium con relativa inferioridad a las anteriores con promedio 66.7%, 3BbPtm de Patacamaya del género Beauveria presento valores inferiores estadísticamente con respecto a 2BbVch,1BbAch y 1MtAch con 66.7% de mortalidad sobre pulgones, así mismo 2MtVch y 3MtPtm de Viacha y Patacamaya respectivamente, presentaron estadísticamente los valores más bajos de mortalidad, 43.0 para 2MtVch y 36.7% para 3MtPtm.
De acuerdo a los datos obtenidos los aislados de Beauveria la mortalidad fue considerable en pulgones y 1 aislado del genero Metarhizium causo mortalidad superior al 50% a las demás del mismo género. Tabla 4.
Humber (1991) señala que Beauveria como HEP es eficiente en el control de insectos de las familias Aphididae y Aleyrodidae. Con relación a Metarhizium sp., Hall (1980), señala que este entomopatógeno es eficiente en el control de insectos del orden homoptera de las familias Aphididae y Cercopidae.
]]> Becerra (2010) en un trabajo similar en la evaluación con formulaciones comerciales y aislados nativos de HEP en la mortalidad de pulgones de calabaza japonesa, hallo una mortalidad de 63% a 5.25 días para ambas especies de hongos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, a diferencia del presente trabajo, se encontró que el hongo del genero Beauveria fue superior a Metarhizium, esto puede deberse a que no se trató la misma especie de pulgón y que en el anterior trabajo se realizó las pruebas con afidos de genero Mizus.Por su parte Orduño-Cruz (2009) en estudio con aislados de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, en el control de picudo del nopal, B. bassiana resulto ser más patogénica provocando mortalidad media de 61%, por su parte la especie M. anisopliae, resulto ser inferior en provocar mortalidad con 24 % con respecto a la otra especie de hongo, estos datos son relativamente similares a los resultados del presente trabajo.
Hernández-López (2010), en un trabajo realizado con diferentes aislados de hongos nativos de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, para el control de larvas de gallina ciega sus resultados de los aislados del hongos pertenecientes al género Beauveria fueron superiores en mortalidad con relación a Metarhizium.
Cortes et al. (2010) utilizando cepas de Beauveria bassiana, con la finalidad de evaluar patogenicidad en el gorgojo del maíz Sitophilus zeamais, en condiciones de laboratorio, durante 16 días (384 h) las mortalidades acumuladas fueron 68 y 93% a concentración 1x196 y 1x107 respectivamente, nuestros datos son relativamente similares.
De manera general la diferencia de virulencia de diferentes asilados de hongos puede estar relacionada en primer lugar por las dos especies diferentes de hongos con las que se trabajó, ya que cada especie libera diferentes tipos de enzimas y toxinas que tiene un comportamiento diferente frente a un hospedero. Segundo, existe entre aislados de una misma especie de HEP según Franco-Chávez et al (2012), esta diferencia puede deberse a las condiciones abióticas en que fueron descritas en todos los aislados y puede variar por la secreción de enzimas y toxinas al hospedero común, cuando un HEP desarrolla en condiciones abióticas favorables también tiene la capacidad de producir más toxinas.
El comportamiento que presentaron diferentes aislados, se puede evidenciar que Beauveria causo mortalidad superior a 50%, tan solo 1 aislado de Metarhizium causo mortalidad por encima del 50%, España-Luna (2000) menciona que los aislados que superan 50% de mortalidad en un insecto determinado, son hongos con valor patogénico considerable. Figura 3.
La diferencia de comportamiento entre aislados de hongos de un mismo género puede estar relacionada con su procedencia, o el tipo de hospedero en el que fue aislado, y no son similares, como se mencionó anteriormente, esto significa que hongos de una misma especie pero de diferentes colecciones tienen comportamiento diferente a una plaga en común. Ignofo (1992) asume que la diferencia de comportamiento entre aislados de hongos de una misma especie pero de diferentes procedencias, por factores abióticos como temperatura y humedad, a las que se aisló, los hongos del presente estudio aislados de Achacachi y Viacha causaron mayor mortalidad que los hongos de Patacamaya, se asume que esta diferencia de comportamiento esta relacionado por las condiciones de humedad en su aislamiento, en Patacamaya la humedad es menor que a las otras localidades.
De los aislamientos evaluados anteriormente, más del 50% de mortalidad corresponden a 1BbAch, 2BbVch, 3BbPtm y 1MtAch, se puede observar el resumen de análisis estadístico de regresiones probit de datos de tiempo letal 50% a efecto de aislados de hongos Beauveria sp., y Metarhizium sp., a concentración (9.5x104) con límites de confianza inferior y superior al 95% y la ecuación lineal en donde Y= mortalidad/tamaño y X=tiempo. Tabla 5.
De acuerdo a los análisis de regresión probit indica que el tiempo letal 50% pertenece al aislamiento 2BbVch por presentar 78.1 h (3.2 días) en controlar el 50% de la población expuesta de pulgones, al respecto a 1BbAch fue el segundo con 90.3 h (38 días) en controlar poblaciones expuestas de afidos, estos dos primeros aislados del genero Beauveria. Con respecto a el único aislado de hongo del genero Metarhizium presento un tiempo letal medio de 103.8 h (4.3 días) en controlar poblaciones de afidos, al respecto el aislamiento 3Bb en 110.4 h (4.6 días). Figura 4.
Con estos datos podemos indicar que aislados del genero Beauveria siguen siendo superiores en el control de afidos frente a aislados del genero Metarhizium, por su parte Kim et al. (2001) desarrollo un ensayo con HEP L. lecanii, B. bassiana y Paecilomyces spp. En la que L. lecanii fue más virulento contra pulgones Aphis gossypii provocando 100% de mortalidad con un tiempo Tl50 de 2.7 días.
]]> El análisis estadístico de regresiones probit de datos de tiempo letal 80% a efecto de aislados de hongos Beauveria sp., y Metarhizium sp., a una concentración (9.5x104) con límites de confianza inferior y superior al 95% y ecuación lineal en donde Y= mortalidad/tamaño y X=tiempo. Tabla 6.De acuerdo a los análisis de regresión probit, el tiempo letal 80% de 2Bb en 123.8 h (5.1 días) en controlar 80% de la población expuesta de pulgones, al respecto el aislamiento 1BbAch fue segundo con 135.6 h (5.6 días) en controlar poblaciones expuestas de afidos, estos dos primeros aislados del genero Beauveria sp. Con respecto a el único aislado de hongo del genero Metarhizium sp., presento 151.2 h (6.3 días) en controlar poblaciones de afidos, al respecto el aislamiento 3Bb con 155.9 h (6.5 días). Figura 5.
Con estos datos podemos mencionar que los aislados del genero Beauveria sp., siguen teniendo comportamiento superior en el control de afidos con respecto a aislados del genero Metarhizium sp., por su parte Mamani (2011) en un estudio realizado con dos aislados de hongos nativos de Beauveria brongniartii en el control de Premnotrypes latithorax encontró tiempos letales Tl80 de 7.7 y 10.8 días, estos datos son superiores a los descritos en el presente estudio debido a que la especie de insecto evaluado no es el mismo, pero se utiliza como referencia ya que la especie de hongo evaluado es la misma.
En las figuras 6, 7, 8 y 9, el comportamiento de la línea de tendencia de la ecuación de la recta en donde la línea azul representa la línea de tendencia y el color rojo representa los límites de confianza al 95%, no presenta dispersión con relacion a la ecuación de la recta por lo que asumimos que no hay desviación excedida.
La línea de tendencia indica el comportamiento de cada aislado de forma ascendente, quiere decir que a medida que pasa el tiempo la mortalidad de los pulgones va incrementando.
De manera general las pruebas realizadas de tiempo letal 50 y 80 de aislados de hongos nativos de Beauveria sp., demuestran comportamiento superior a Metarhizium sp., valores de mortalidad menores en tiempo de control de los pulgones, lo que indica que Beauveria sp., además de presentar valor patogénico considerable tienen un menor tiempo en controlar poblaciones expuestas de afidos o pulgones con respecto a hongos del genero Metarhizium sp.
Becerra (2010) en un estudio similar con aislados de hongos nativos y formulaciones comerciales de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, en el control de pulgones de calabaza Japonesa Myzus percicae, que a un mismo tiempo ambas especies de hongos no presentan diferencias en comportamiento, es decir los hongos tienen un mismo grado de virulencia para controlar insectos plaga como pulgones, que no concuerda con los resultados del presente trabajo, puede deberse a que los aislados de hongos del genero Beauveria sp., pertenecen a Beauveria brongniartii, que puede ser más virulento o patogénico que la especie Beauveria bassiana.
Para la evaluación de concentraciones letales Cl50 y Cl80, a partir de concentración inicial de 9.5 x 10⁴ conidios/mL se realizaron diluciones seriadas de 1/10, 1/100, 1/1000 y 1/10000, el cual se inoculo a poblaciones de pulgones.
La evaluación se realizó en intervalos de tiempo de 12 h de 0 hasta 144, la toma de datos fue hecha en el momento en que los tratamientos presentaron medias de más del 50% de mortalidad lo que dio a horas 96.
En la tabla 7, el análisis estadístico de regresiones probit de datos de la concentración letal Cl50 a efecto de dos especies de hongos Beauveria sp., y Metarhizium sp., con los respectivos límites de confianza inferior y superior al 95% y la ecuación lineal en donde Y= 50% y X=tiempo. Cabe recalcar que los datos obtenidos son inversos con respecto al modelo ajustado.
]]> En la figura 10, se observa el análisis de regresión probit, los aislados 2BbVch y 1BbAch presentaron concentraciones letales medias de 2.5x10⁴ conidias/mL y 5.1x10⁴ conidias/mL respectivamente, estos datos están dentro del rango de concentraciones planteadas, por otro lado 1MtAch y 3BbPtm las están por encima de lo sugerido con 1.3x105 conidias/mL y 1.2x10⁵ conidias/mL respectivamente.Se debe mencionar, los aislados de código Bb son pertenecientes a hongos del genero Beauveria sp., y los aislados de código Mt pertenece al género Metarhizium sp.
Los datos sugieren que 1MtAch y 3BbPtm requieren concentraciones superiores a los planteados y no así para 2BbVch y 1BbAch que presentaron superiores respecto a los otros dos aislamientos en el control de poblaciones de afidos.
De acuerdo a estos datos podemos indicar que aislados de Beauveria sp., son superiores por la menor concentración de conidias/mL, para controlar el 50% de la población de áfidos, y no así con los asilados del genero Metarhizium sp., que requiere concentración elevada para dicho cometido, por otro lado (Montalva 2008) en un experimento en laboratorio con Lecanicillium lecani, en el control de pulgones determino una concentración letal Cl50 de 3.7x10⁷ conidias/mL, dato superior al del presente trabajo. Por su lado Becerra (2010) en un experimento similar aplicando formulaciones no comerciales de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, para control de pulgones de calabaza japonesa halló una concentración letal de 1x10⁷, valor superior al del presente trabajo, por lo que las especies evaluadas tienen alto valor de patogenicidad por causar mortalidad a concentraciones bajas.
Tabla 8, muestra el resumen del análisis estadístico de regresiones probit de datos de la concentración letal Cl80 a efecto de dos especies de hongos Beauveria sp., y Metarhizium sp., con los respectivos límites de confianza inferior y superior al 95% y la ecuación lineal en donde Y= 80% y X=tiempo.
Figura 11, acuerdo a los análisis de regresión probit, los datos obtenidos de concentración letal 80 de 2BbVch de 1.3x10⁵conidias/mL, que resultó ser superior para el control del 80% de los afidos, para 1BbAch los datos de 1.8x10⁵ conidias/mL, es considerable por demostrar concentraciones reducidas para el control de 80% de pulgones pero superior al aislado 2BbVch, los aislados 1Mt y 3Bb señalan concentraciones letales 80 de 3.9x10⁵conidias/mL y 3.1x10⁵conidias/mL superior a aislados 2BbVch y 1BbAch, quiere decir que 1MtAch, es cuatro veces más alto en concentración que 2BbVch, 1BbAch dos veces más alto en concentración que 2BbVch.
Las concentraciones letales 80 establecidas sugieren que se requieren de mayores concentraciones a las evaluadas para generar la muerte del 80% de los individuos. De acuerdo a los datos descritos podemos estimar que aislados de Beauveria sp., es superior por presentar menor concentración para controlar 80% de poblaciones de áfidos, y no así con la especie Metarhizium sp., requiriendo concentraciones elevadas para dicho cometido, en un experimento similar Aliaga & Cruz (2009) en la determinación de la concentración letal 50 y 90 con Beauveria bassiana en el control de Aphis craccivora indico una concentración letal 90 Cl90 de 2.3x10³¹ siendo demasiado alta en relacion a nuestros datos, por lo que podemos mencionar que los aislados demuestran comportamiento superior en el control de afidos.
Figura 12, 13, 14 y 15, se puede observar el comportamiento de la línea de tendencia de la ecuación de la recta en donde la línea azul representa la línea de tendencia y el color rojo representa los límites de confianza al 95%, que como se puede observar en los gráficos no presenta dispersión con respecto a la ecuación de la recta por lo que asumimos que no ay una desviación excedida en todo caso el ensayo es precisó.
De manera general podemos mencionar que las pruebas hechas tanto de la concentración letal 50 como 80, de hongos nativos pertenecientes al género Beauveria sp., presentan comportamiento superiores respecto a Metarhizium sp., demostrando valores de concentración inferiores para el control de poblaciones expuestas de pulgones.
Las diferencias en el comportamiento de ambas especies de hongos evaluadas para el control de afidos podrían estar relacionadas con sus características genéticas y fisiológicas, ya que existen diferencias entre géneros de hongo que pueden presentar diferencias en su patogenicidad hacia un insecto determinado.
]]> (Franco-Chávez et al. 2012) menciona que esta variación de patogenicidad por características genética es debida a que el comportamiento de individuos de una misma especie no es siempre la misma por las características fenotípicas y genotípicas que presentan y fisiológicas debido a que los hongos de una misma especie son también diferentes en cuanto a la producción de enzimas y toxinas influenciadas por factores abióticos, que limita el grado de infección entre hongo de una misma especie en un hospedero común.Por otra parte, se asume que los hongos que desarrollan en alturas por encima de los 2500 msnm, son hongos que crecen en condiciones extremas, es decir con bajo porcentaje de humedad, temperaturas bajas y alta radiación solar que, estos hongos tiene un valor patogénico alto, ya que tienden a desarrollar toxinas en su hospedero de forma rápida para su supervivencia, además los conidios liberados para su reproducción son más viables que los HEP de los trópicos.
Finalmente, los hongos sometidos a pruebas de evaluación de identificación tanto macroscópicamente y microscópicamente, de los 6 aislados 3 fueron identificados como Beauveria brongniartii y 3 a Metarhizium anisopliae.
La evaluación de las mortalidades dieron como resultado que los aislados nativos del genero Beauveria sp., tiene un mayor capacidad de controlar la población de pulgones 144 h (6 días), aislados 2BbVch, 1BbAch y 3BbPtm lograron eliminar 82.33, 75 y 60.67% de afidos respectivamente, y no así, aislados nativos de Metarhizium sp., que demostraron valores para los aislados 1Mt, 2Mt y 3Mt de 66.67, 46 y 36.6% de mortalidad dentro de estos aislados solo el aislamiento 1Mt logro resaltar con una mayor patogenicidad.
Los tiempos letales 50 y 80 de los aislamientos de los hongos del género Beauveria sp., demostró ser superior en el control del 50 y 80 % con 78.06 y 123.83 h para 2Bb siendo superior para el control de la población de afidos a diferencia de aislados del género Metarhizium sp., 1Mt fueron menores en el comportamiento del control de pulgones con tiempos letales 50 y 80 de 103 y 151,16 h.
Las concentraciones letales 50 y 80 resulto ser mayor en comportamiento en aislados nativos de hongos del genero Beauveria sp., a concentraciones Cl50 y Cl80 de 2.5x10⁴ y 1.3x10⁵ conidias/mL, perteneciente a 2Bb y no así en los aislados del genero Metarhizium sp., 1Mt con 1.3x10⁵ y 3.9x105 conidias/mL, que resultaron ser inferiores en el control de afidos, ya que requieren concentraciones superiores a los propuestos para causar mortalidad.
Conflictos de intereses
El trabajo de investigación ha sido autofinanciado por los autores y no genera conflictos de interés.
]]> Agradecimientos
Los autores agradecen al responsable del Laboratorios de la Unidad Académica Campesina de Tiahuanacu dependiente de la Universidad Católica Boliviana “San Pablo”
Al personal técnico de los ambientes controlados (carpas solares) de la granja de centro de rehabilitación Remar del municipio de Viacha.
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