Determinacion de la Homoresistencia y Heteroresistencia de Staphylococcus Aureus Meticilinoresistente aislado de muestras de pacientes internados en los hospitales Boliviano Holandes, Hospital Obrero, y Hospital de Clínicas
Líc. Lorena Adamczyk Wíeler*, Dr. Christian Trígoso Agudo**, Líc. Aneth Vasquez Míchel***, Líc. Loretta Duran Arias****
* Facultad de Ciencias Farmaceúticas y Bioquímicas
** Instituto Nacional de Laboratorios en Salud (INLASA)
*** Facultad de Ciencias Farmaceúticas y Bioquímicas
**** Instituto Nacional de Laboratorios en Salud (INLASA)
RESUMEN
Pregunta de Investigación
¿Las cepas de Staphylococcus aureus meticilino resistentes circulantes en nuestro medio, serán homoresistentes o heteroresistentes?
Objetivos
Determinar los fenómenos de homoresistencia y heteroresistencia a meticilina en aislamientos de Staphylococcus aureus de muestras de pacientes internados en los Hospitales Boliviano Holandes, Hospital Obrero y Hospital de Clínicas de la Ciudad de La Paz.
Determinar el porcentaje de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina en los aislamientos obtenidos.
Diseño
]]> Corte transversalLugar
Instituto Nacional de Laboratorios en Salud (INLASA)
Muestras
Las cepas fueron aisladas de muestras de exudados purulentos de abscesos, heridas y quemaduras provenientes de pacientes internados en los Hospitales Boliviano Holandes, Hospital Obrero y Hospital de Clínicas.
Métodos
* Se realizo la identificación de género y especie aureus mediante pruebas de catalasa; coagulasa y manitol respectivamente.
* La determinación de sensibilidad y/o resistencia se las hizo mediante difusión en disco (Bauer-Kirby) con discos de Oxacilina de 1 μg
* La Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) se la determinó por microdilución en caldo con Oxacilina p.a en polvo
Resultados
]]> De 100 aislamientos de Staphylococcus aureus, el 16% son resistentes a la meticilinaEn ninguna de las cepas resistentes se pudo evidenciar homoresistencia a la meticilina, por tanto el 100% de las cepas son heteroresistentes.
Conclusiones
Se determina que en nuestro medio la meticilina mantiene una buena actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus.
No existe el fenómeno de homoresistencia en las cepas aisladas en este estudio.
Palabras claves
Rev. Cuadernos 2005;50(2): 7-11 Meticilina, Staphylococcus aureus, homoresistencia, heteroresistencia, difusión en disco, concentración inhibitoria mínima
ABSTRACT
Research Question
Are the circulating methicillin resistant staphylococcus aureus strains in our patients homoresistant or heteroresistant?
]]> ObjectivesTo assess the homoresistance and heteroresistance to methicillin of Staphylococcus aureus isolated from purulent exudate samples obtained from patients admitted to the Hospital Boliviano Holandes, Hospital Obrero and Hospital de Clínicas in La Paz.
To determine the percentage of methicillin resistant Staphylococcus aureus in these samples.
Study Design
Cross sectional
Study Location
Instituto Nacional de Laboratorios de Salud (INLASA)
Samples
The strains were isolated from samples of purulent discharges from abscesses, wounds, infected burns from patients admitted to the Hospital Boliviano Holandes, Hospital Obrero, and Hospital de Clinicas.
Methods
]]> Staphylococcus aureus was identified by tests of catalase, coagulase and manitol. Sensitivity and/or resistance was determined by disc diffusion (Bauer Kirby) with discs of Oxacilina of 1 μg . The Minimal Inhibitory Concentration (CIM) was determined by microdilution.Results
Of 100 Staphylococcus aureus isolations, 16% were methicillin resistant. None of these strains was shown to be homoresistant. Therefore, we assume that 100% of the strains were heteroresistant.
Conclusions
Methicillin maintains a good antimicrobial activity against Staphylococcus aureus. The isolations in our study did not show homoresistance.
Key words
Methicillin, Staphylococcus aureus, homoresistance, heteroresistance, disc diffusion, minimal inhibitory concentration.
INTRODUCCIÓN
]]> Las cepas de Staphylococcus meticilino resistentes fueron identificadas inmediatamente después de la introducción de la meticilina en la clínica(1,2). Este tipo de resistencia fue denominada intrínseca ya que no era debida a la destrucción del antibiótico por ß-lactamasas. La primera epidemia causada por MRSA fue en hospitales de Europa en 1960 (1,2), desde entonces las cepas de Staphylococcus aureus meticilino resistente (MRSA) y los Staphylococcus coagulasa negativa resistente a la meticilina se han expandido a nivel mundial y no solo en hospitales si no también fuera de ellos, particularmente entre pacientes crónicos bajo terapia y en personas que abusan de drogas parenterales.(3,4,5)Los MRSA son generalmente resistentes a otras importantes familias de antibióticos (macrólidos, lincosaminas y aminoglucocidos) por lo que desde la aparición de estas bacterias multiresistentes , los glucopéptidos, en particular la Vancomicina, se han convertido en las drogas de elección y muchas veces en las únicas opciones terapeúticas.(6)
Una característica distintiva de la resistencia a la meticilina es su naturaleza heterogénea(3), el nivel de resistencia varia de acuerdo a las condiciones del cultivo y al antibiótico ß-lactamico a utilizarse, la mayoría de las células en las cepas heterogéneas (típicamente 99,9% o más) son susceptibles a bajas concentraciones de antibiótico ß-lactamico es decir de 1 a 5 μg/mL de meticilina con una pequeña proporción de células (1 en 105) que crecen a concentraciones de meticilina de 50 μg/mL o más.
El fenómeno de resistencia homogénea versus heterogénea en cepas silvestres es completamente inexplicable. La pared celular de cepas heterogéneas es indistinguible mediante ensayos de cromatografía liquida de alta presión de la pared celular de cepas designados chr*, susceptibles(4).
Los clones homogéneos estables seleccionados después de la siembra de cepas heterogéneas en antibióticos ß-lactamicos tienen mutaciones en loci genéticos designados chr*, que no son fem (factor esencial para la resistencia a la meticilina) y tampoco son mecA (gen codificador de la proteina PBP2a, que confiere resistencia a la meticilina) indicando que pueden ser logrados niveles altos de resistencia a través de varias rutas.(4) La introducción de una cepa heterogénea mecA en una cepa homogénea que tiene chr* en la cual el mecA ha sido inactivado produce un fenotipo homogéneo. Se han reportado elementos cromosomales y clónales que confieren resistencia homogénea de alto nivel a mutantes seleccionadas con imipenem.
En nuestro medio se conoce muy poco acerca del tipo de cepas circulantes (homogénea o heterogéneamente resistentes), es más, no existen datos bien establecidos en torno al porcentaje de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina, especialmente intrahospitalarios. Por ello, este estudio nos dará una idea de cual es el porcentaje de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina y si estas son homogénea o heterogéneamente resistentes.
Objetivos
Los objetivos de este trabajo son:
1. Identificar las cepas de Staphylococcus aureus de exudados purulentos de heridas, abscesos y quemados mediante pruebas bioquímicas estandarizadas.
2. Determinar la resistencia a la meticilina en los aislamientos de Staphylococcus aureus por los métodos Kirby-Bauer, test de screening y CIM.
]]> 3. Determinar si las cepas son fenotípicamente homoresistentes o heteroresistentes.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tamaño muestral
Se procesaron un total de 113 muestras de las cuales se tomaron en cuenta para los tests de sensibilidad 100 aislamientos, aquellas que en la tinción Gram son cocos Gram positivos y en las pruebas bioquímicas Catalasa, Coagulasa y Manitol dan positivo. Los 13 aislamientos restantes se los descarta por presentar contaminantes.
Lugar
Las muestras fueron analizadas en la Unidad de Bacteriología del Instituto de Laboratorios en Salud (INLASA).
Pruebas de Identificación de especie.
Catalasa
Con una aguja de inoculación transferir parte del centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos, agregar una gota de peroxido de hidrógeno al 3 % y observar la formación de burbujas abundantes luego de 30 a 40 segundos.
]]> Prueba de coagulasa libre (tubo)Emulsificar una pequeña cantidad de la colonia del microorganismo en un tubo que contenga 0,5 mi de plasma, incubar a 35°C durante 4 horas e inclinar el tubo observando si se forma un coagulo, las cepas que no forman coagulo en ese momento, deben ser reincubadas a temperatura ambiente, por 18 horas y nuevamente realizar la lectura.
Pruebas de determinación de resistencia
Todos los procedimientos de determinación de sensibilidad y resistencia, así como valores de referencia se basaron en parámetros establecidos por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (8).
Prueba de difusión de disco en agar (Bauer-Kirby)
Utilizar discos de 1 μg de meticilina (Difco Laboratories, Detroit, MT, USA) colocados en agar Muller Hinton (bioBRAS), con adición de 2% de NaCl. Las zonas de inhibición son determinadas luego de 48 horas de incubación a 35°C. La resistencia a la Meticilina, es definida de acuerdo a los puntos de corte que da el NCCLS(8). Los controles incluyen una cepa (ATCC 43300) y una cepa meticilina sensible (ATCC 25923).
Prueba de confirmación o test de screening
Las cepas resistentes (y si hubieran dudosas), son inoculadas en placas de agar Muller Hinton, suplementadas con 4% de NaCI y 6mg de meticilina por ml, son incubadas a 35 °C por exactamente 24 horas, para confirmar el crecimiento o no de las mismas.
Concentración inhibitoria mínima (CIM)
La CIM de la meticilina (Sigma, St Louis, MO, USA) es determinada por el método de microdilución en caldo, con 2 % de NaCl, luego de 24 horas de incubación a 35 °C, usando 105 UFC/ml. La cepas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus Coagulasa Negativos, que son resistentes a la meticilina, presentan valores 4μg/ml y 0.5 μg/ml, respectivamente, de acuerdo a los estándares (NCCLS). Entonces, las concentraciones de meticilina utilizadas para el estudio comprenden desde 0,25 μg/ml hasta 128 μg/ml. Los controles utilizados fueron ATCC 43300 (cepa S.aureus meticilina resistente). El control negativo de resistencia fue ATCC 29213 (cepa S.aureus meticilina sensible).
]]>RESULTADOS
De un total de 113 muestras recolectadas como Staphylococcus aureus de los diferentes nosocomios, solamente 100 fueron confirmadas como Staphylococcus aureus en el aislamiento e identificación, dando 88% de cepas utilizadas para las pruebas de sensibilidad y un 12% descartadas por razones de contaminación. (Cuadro N° 1).
A 100 cepas aisladas se les realizó las pruebas de sensibilidad a la Oxacilina por los métodos de difusión por disco (Bauer-Kirby), Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) y prueba de confirmación (test de screening), las tres pruebas se realizaron del mismo inoculo, de las cuales se determinó que 16% presentaban resistencia a la oxacilina por Bauer-Kirby y Test de Screening y 18% por CIM. (Cuadro N° 2, 3)
De todos los aislamientos de Staphylococcus aureus meticilino resistente (MRSA) se determinó que 100% presentan una resistencia heterogénea (Cuadro N° 4).
DISCUSION
El INLASA elaboró informes semestrales a nivel nacional los años 1999 y 2000, con la colaboración de 20 laboratorios que son parte de la red de vigilancia de resistencia, en los que se reporta un aumento de 3% (1999) a 6,9%(2000) de MRSA, este es un aumento de mas del doble(7).
En el presente estudio realizado entre octubre del 2003 y abril del 2004 se obtuvo 16% de MRSA, por lo que se tiene que pensar que mas o menos la resistencia de Staphylococcus aureus a la meticilina va aumentando de 3 a 10% por año, por lo tanto se tienen que tomar medidas de prevención para que estos porcentajes de MRSA en un futuro no alcancen niveles alarmantes. Sin embargo, se debe tomar en cuenta que los datos de este estudio no son nacionales sino regionales.
Los porcentajes de MRSA encontrados en este trabajo coinciden con algunos resultados reportados en Ecuador, pero son más bajos que los reportados en Lima (36-90%), Arequipa (67-71%), que son los más altos en Latinoamérica, pero comparables con los encontrados en Europa (75%) (9,10).
En lo referente a algunos detalles del procedimiento, en la determinación del CIM se realizó la dilución de 128 μg/ml que es bastante alta, debido a que las cepas de Staphylococcus aureus que presentan una resistencia homogénea, se identifica más certeramente a altas concentraciones de antibiótico a partir de una concentración de 64 - 128 μg/ml, ya que mediante el antibiograma es un tanto difícil determinar este tipo de homogenicidad por que si bien estas cepas presentan un halo uniforme, muchas veces las cepas intra halo son imperceptibles a simple vista, pudiendo dar resultados errados.
]]> No se determinó ninguna cepa de Staphylococcus aureus con una sensibilidad intermedia en el antibiograma, por razones de que el rango del diámetro del halo para que una cepa se considere con sensibilidad intermedia es muy pequeño (11 - 12 mm), y también porque en la CIM no se tiene esta categoría para estos resultados(8), entonces las cepas que dan este tipo de sensibilidad deben ser muy pocas.Se encontró que el 100% de las cepas de Staphylococcus aureus meticilino resistentes presentan resistencia del tipo heterogénea, lo cual concuerda con la mayoría de estudios realizados que indican que un 99.9% de las cepas aisladas de casos clínicos poseen una resistencia heterogénea (3,4,5)
CONCLUSIONES
No se identificaron en este estudio, cepas de Staphylococcus aureus homogéneamente resistentes a meticilina.
Se determina que en nuestro medio la meticilina mantiene una buena actividad antimicrobiana frente
REFERENCIAS
1. Bouza E, Cosín J y Grupo Cooperativo para el Estudio de la Infección. Estudio de Prevalencia hospitalaria y consumo de antibióticos. Med Clin (Barc): 353-358. 1997;98
2. Patterson, J.. En torno a la situación real de Staphylococcus aureus meticilino resistente. The Lancet. 2000 348:836-37.
]]> 3. Matthews, P.R. y P.R. Stewart.. Resistance heterogenity in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol. 1998 Lett. 22:161-166.4. Chambers,H.F. Methicillin resistance in Staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin Microb Rev 1997; 10:781-91. [ Links ]
5. Franklin D. Lowy.. Staphylococcus aureus infectious. New England Journal of medicine 1998. 339:520-32. [ Links ]
6. Jauregui Peredo L. E.. Antimicrobianos: Uso Terapéutico en Infectología Clínica. Editorial Plural. Primera Edición. 2002 81-85. [ Links ]
7. Ministerio de Salud y Previsión Social, Instituto de Laboratorios en Salud. Laboratorio Nacional de Referencia Bacteriología Clínica. 2001. Vigilancia Epidemiológica de Resistencia a los Antimicrobianos (VERA) ,1999-2000. Boletín Informativo
8. Witte,W., M.Kresken, C. Braukle, and C.Cuny..Increasing incidence and widespred dissemination of methicilin - resistant Staphylococcus aureus 1997 (MRSA) in hospitals in central Europe, with special reference to German hospitals.Clin Microbiol Infect 3:414-422.
9. Mehndirrata,P.L., S. Vidhani, and M.D. Mathur.. A study on Staphylococcus aureus strains submitted to a reference laboratory. 2001 Indian J med Res 114:90-4.
10. NCCLS.. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for Bacteria that grow aerobically Approved Standard M7-A4. 2003 National Committee for Laboratory Standards.
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