ARTICULO ORIGINAL
Leishmaniasis visceral subclínica en 123 individuos de un cantón de la provincia Caranavi-La Paz
Sub-clinical infections by visceral leishmaniasis in Caranavi district: study in 123 individuals
María Delmans Flores Ch.*, Jorge R. Postigo I.***, Neida Mita Mendoza****, Israel Cruz*****, Jorge Alvar Ezquerra******, Brigitte Bastrenta.**
* Bioquímica UMSA, Instituto Carlos III, Madrid – España.
** Ph.D, Jefe Responsable de la Unidad de Epidemiología Molecular de Enfermedades Tropicales IRD–INLASA.
*** Medico, Unidad de Epidemiología Molecular de Enfermedades Tropicales IRD–INLASA.
**** Bioquímica UMSA, Unidad de Epidemiología Molecular de Enfermedades Tropicales IRD (Francia)–INLASA, (La Paz, Bolivia).
***** Biólogo, Servicio de Parasitología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España. ]]>
****** Ph.D. MD. Director del Servicio de Parasitología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España.
Organismos patrocinadores:
Institut de Recherche pour le Développment, (IRD, France).
Institutos Nacionales de Laboratorios de Salud, INLASA.
Dirección : Dra Bastrenta Brigitte. IRD/INLASA .Teléfono: 2 22 52 80. Bastrenta@ns.megalink.com
En 1999, en el Hospital del Niño se registró un nuevo caso de Leishmaniasis visceral sobre un niño de dos años proveniente del cantón de Taipiplaya (Provincia Caranavi). Por este motivo se realiza en este cantón una evaluación transversal de la leishmaniasis visceral mediante pruebas serológicas y moleculares involucrando a 122 individuos clínicamente sanos y un individuo con infección positiva a Leishmania cutánea, Se demostró la circulación de Leishmania sp. en 32,3% de sujetos estudiados. El 14.4% de la población examinada presentó anticuerpos anti-rk39, demostrándose la circulación de Leishmania chagasi responsable de la leishmaniasis visceral. No podemos descartar la posibilidad de la existencia de coinfecciones mixtas inter-especie de Leishmania como también de coinfecciones mixtas por Leishmania sp. y Trypanosoma cruzi, responsable de la enfermedad de Chagas.
Palabras claves:
Leishmania visceral, Leishmania chagasi, antígeno recombinante rk39, infección subclínica por L. chagasi.
In 1999, in the "Hospital del Niño". a new case of visceral leishmaniasis was identified in a 2 years old child from Taipiplaya in the Caranavi district. For this reason, a visceral leishmaniasis evaluation using serological and molecular tests was realized on 122 healthy people and also on one leishmania cutanea infected person. Leishmania spp was present in 32,3 % of the studied people and 14,4 % had an anti-rk39 antibody, attesting the existence of Leishmania chagasi responsible for visceral leishmaniasis. The possibility of mixed infections with other Leishmania species as well as mixed infections Leishmania spp and Trypanosama cruzi, responsible for chagas disease should not be discarded.
]]> Key words:Leishmania visceral, Leishmania chagasi, recombinant antigen, infection asympomatic due to L. chagasi
Por lo general una determinada especie de leishmania está asociada a una de las manifestaciones clínicas. En el nuevo mundo: la forma de leishmaniasis cutánea tiene principalmente como agentes etiológicos a L. L. mexicana, L. L. amazonensis, L .V. panamensis, L. V. guyanensis, L. V. peruviana o L. V. braziliensis. En el caso de la forma mucocutánea la especie responsable es L. V. braziliensis. La cutánea difusa se observa en infecciones por L. L. amazonensis, la visceral y formas cutáneas atípicas en casos de infecciones por L. chagasi. (1)
La leishmania visceral es potencialmente fatal, causada por un protozoario intracelular: L. L. donovani, L. L. infantum (chagasi). En humanos causa parasitismo y patología importante en hígado, bazo y médula ósea. En hígado, los amastigotes intracelulares se desarrollan rápidamente dentro de los 28 días siguientes a la infección, desapareciendo usualmente en los 30 días siguientes; en cambio, tanto en el bazo y en la médula ósea puede ser causa de infección crónica, sobreviviendo toda la vida del huésped. (2,3) Además, pese a que la leishmaniasis visceral en la mayoría de los casos es considerada una parasitosis subclínica, puede generar estado febril intermitente, astenia, cuadros diarreicos, vómitos y desnutrición.(3) Se acompaña de esplenomegalia indolora y hepatomegalia, anemia normocítica y normocrómica.(4)
La Leishmaniasis visceral es una parasitosis considerada hasta ahora, rara dentro de los países andinos (Colombia, Perú, Bolivia, Venezuela y Ecuador);(5) sin embargo, tiene alta morbilidad y mortalidad en algunas regiones brasileñas.(3) En zonas de alta endemicidad como en Ceara (Noreste del Brasil), se imforma una frecuencia de 10 personas por cada 1000 habitantes.(3) En Colombia y Venezuela se ha notifica un promedio de 50 casos por año en la década del 90 y en Ecuador y Bolivia sólo se reportaron casos ocasionales.(5)
Otros investigadores (3) demostraron en un estudio clínico y epidemiológico en Noreste del Brasil, que la infección por L. infantum/chagasi estaba presente en el 7,5% de niños menores de 15 años, de los cuales el 20% presentó Leishmaniasis visceral aguda, otro 20% con pocos síntomas clínicos y el restante 60% fueron niños con desarrollo de infección subclínica prolongada que resultó deletéreo en su crecimiento y desarrollo siendo marginados como niños desnutridos.
Bolivia se ha destacado principalmente por los más altos índices de Leishmaniasis mucocutánea (MCL) y Leishmaniasis cutánea (LCL). Entre los países andinos la proporción reportada de estas formas de Leishmaniasis es la siguiente: (LMC:LCL) Bolivia 1:4; Perú 1:7; Ecuador 1:13; Colombia 1:44; Venezuela 1:26,(5) justificando claramente la necesidad de un control periódico y constante.
La Leishmaniasis en la región sub andina del departamento de La Paz, en particular en los Yungas, ha sido objeto de estudio partiendo del conocimiento de la detección de algunos casos documentados de Leishmaniasis visceral (LV).(6) Los casos autóctonos en Bolivia fueron desconocidos hasta que Gatti en 1939,(7) confirmó por necropsia en un soldado paraguayo, prisionero de la guerra del Chaco y trasladado a la zona de los Yungas donde permaneció por 18 meses. En 1942 se publicó (8) otro caso humano en adulto procedente de Santa Ana, departamento de Santa Cruz. En 1949 se reportó (9) la detección de otro nuevo caso de infección en un trabajador brasilero que presumiblemente se infectó mientras trabajaba entre la ciudad de Santa Cruz y la frontera boliviana-brasileña, falleciendo posteriormente y confirmándose por necropsia. En 1982 otros investigadores,(10) confirmaron la presencia de Kala-azar visceral humana y canina considerando a este último como reservorio del parásito, mientras otro estudio mostró la presencia del vector Lutzomyia longipalpis en la zona de los Yungas paceños.(11, 12)
Actualmente, continúa siendo escasa la información epidemiológica de L. chagasi en Bolivia. Desde 1982 hasta 1999 se han reportado 9 casos de Leishmaniasis visceral, la mayoría de los cuales procedían de zonas subtropicales de La Paz (13). Recientemente, en Chulumani y otras localidades de Nor y Sud Yungas de La Paz, se ha establecido coinfecciones mixtas tanto en humanos como en animales con la presencia de agentes de los complejos L. V. braziliensis, L. L. mexicana , L. donovani/chagasi así como de T. cruzi agente etiológico de la enfermedad de Chagas.(14- 16)
]]> Los tres últimos casos de leishmaniasis visceral diagnosticados y registrados en el Hospital del Niño de la ciudad de La Paz en 1999, tenían residencia en la comunidad de Taipiplaya, cantón de la provincia Caranavi. (Dr. Mejía, comunicación personal). El incremento de los casos en los últimos años, es atribuido al desarrollo de nuevos asentamientos humanos y a cambios en los patrones de actividad humana, favoreciendo la exposición de humanos al ciclo zoonótico de la leishmaniasis.(5)En áreas endémicas el diagnóstico de leishmaniasis es prácticamente basada en la presentación clínica, el teñido de biopsia y aspirado como métodos de confirmación y ocasionalmente mediante el uso de la prueba de Montenegro, este último, aunque es altamente sensible, no permite la discriminación de una infección reciente o antigua y de la cepa involucrada en la infección.
El objetivo del estudio fue para evaluar las infecciones causadas por protozoarios viceralizantes, del género Leishmania (L. L. infantum/chagasi) y Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, mediante serología y por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica, en 123 habitantes del cantón de Taipiplaya.
Zona geográfica
Taipiplaya es un cantón que está ubicado en la provincia Caranavi en el departamento de La Paz, a una distancia de 176 km. de la capital del departamento por carretera. Se extiende en un pequeño valle al este de Caranavi, rodeado por serranías que alcanzan los 2500 metros de altura. Goza de un clima subtropical templado y húmedo, con un promedio anual de temperatura ambiente de 25 ºC. El cantón Taipiplaya cuenta con una población total de 3142 habitantes,(17) concentradas en 16 colonias principales que se hallan dispersas en un promedio de 30 Km. a la redonda de una pequeña población central que tiene el nombre de Taipiplaya.
Población de estudio
En el primer semestre de la gestión 2000, iniciamos el trabajo después de realizar la convocatoria a la comunidad en general a través de reuniones previas con las autoridades de la comunidad.
El trabajo contempló a 123 individuos residentes en la zona (3.9% de la población de Taipiplaya) pertenecientes en su mayoría al centro educativo Mixto Taipiplaya que nos permitió trabajar mayormente con niños escolares (110). El grupo de adultos (13) estuvo conformado en su mayoría por docentes del establecimiento
]]> Después de realizar una revisión clínica dirigida y el registro de la respectiva historia clínica individual, se consideraron con especial énfasis: la ocupación, lugar de residencia, actividad y lugar de trabajo, historia migratoria como también la identificación del domicilio en un croquis de la zona. Se estableció el estado nutricional de todos los individuos considerando la talla y el peso con aplicación de tablas.(18)
Muestras biológicas
Las muestras de sangre venosa periférica y sueros colectadas de 123 individuos, fueron almacenadas adecuadamente hasta su procesamiento en los laboratorios de Estudios Moleculares de Enfermedades Tropicales (EMET) con asiento en INLASA, La Paz y en el Instituto Carlos III con asiento en Madrid, España.
Pruebas serológicas
IFI-Leishmania sp.
La prueba convencional de inmunofluorescencia permite detectar infecciones con Leishmania sp. Para esta prueba se utilizó cultivos axénicos de promastigotes (Leishmania.sport IFâ , BioMeriux, France) o preparados frescos conteniendo organismos de amastigotes. El umbral para el diagnóstico fue de 1/80.
rk39 – Leishmania infantum
La sensibilidad y la especificidad de esta prueba para la detección de la leishmaniasis visceral es de 71.4% y 100% respectivamente.(19) Se realizó según lo descrito,(20) en resumen, las placas de 96 pocillos fueron sensibilizadas con 50 ng del antígeno rk39 diluido en tampón carbonato pH 9,6 durante toda la noche a 4°C, después del bloqueo con tampón fosfato salino conteniendo 1% de Tween 20 (a temperatura ambiente durante una hora y previo 5 lavados con PBS Tween 0,1%) se añadió 50 µl de los sueros diluidos 1/100. Las placas fueron incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente, se añadió 50 µl del sustrato 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diluido en tampón perborato 0,03% citrato sódico 0,05M pH 5,0 (ABTS). La incubación de las placas se realizó durante 30 min a temperatura ambiente y en oscuridad. La densidad óptica se midió a 492 nm.
]]> SLA ELISA – Leishmania infantumSe realizó según lo descrito,(21) esta prueba en la que se utiliza antígenos totales, tiene la desventaja de que puede presentar reacción cruzada con Chagas al igual que con las otras formas de leishmaniasis. En resumen se sensibilizaron placas de 96 pocillos con 1µg/pocillo de antígeno soluble obtenido a partir de promastigotes de L. infantum (Lem75) diluido en tampón carbonato pH 9,6 a 4°C durante toda la noche. Las placas fueron bloqueadas con tampón fosfato salino pH 7,4 Tween 0,1% (PBS-T), albúmina sérica bovina (BSA) 1% por una hora a 37°C. Después de 3 lavados con PBS-T se añadió 100 ul de los sueros diluidos 1/100 en PBS-T, BSA 0,3%. Las placas se incubaron a 37°C por 30 min. La detección de la reacción antígeno anticuerpo se realizó mediante el sistema avidina-biotina. La lectura de las absorbancias se realizó a 405 nm.
ELISA – T. cruzi
Enzime-Linked Immunoabsorbent assay (ELISA), para la detección de anticuerpos anti T. cruzi, se realizó según la descripción.(22) Se utilizó como antígeno extracto alcalino de Trypanosoma cruzi de la cepa Y, obtenido como describe.(23) La sensibilidad y la especificidad corresponden a 100% y 97.5% respectivamente. El control positivo y negativo se realizó con sueros de la seroteca del laboratorio EMET- IRD.
Pruebas moleculares
PCR para Leishmania sp.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó según lo descrito.(24) Se usaron oligonucleótidos derivados a partir del gen RNA ribosomal de la subunidad pequeña del ribosoma. Las secuencias de los 4 iniciadores son R221: 5’ GGT TCC TTT CCT GAT TTA CG 3’; R332: 5’ GGC CGG TAA AGG CCG ATT AG 3’; R223: 5’TCC CAT CGC AAC CTC GGT T 3’; R333 5’ AAA GCG GGC GCG GTG CTG 3’. Las condiciones de las dos reacciones (nested PCR) fueron las siguientes: 75 mM Tris-HCl pH9, 2.0 mM de (NH4)2SO4 al 0.001% de albúmina sérica bovina, 2mM de MgCl2, 0,2 µm de desoxinucleótidos de trifosfato, 15 pmol de los iniciadores R221 y R332 en la primera reacción y 3 pmol de cada R223 y R333, en la segunda reacción. La enzima empleada fue la Tth polimerasa (Biotools B&M laboratories, Spain) 1,4 U en la 1ª reacción (50 µl volumen total de reacción) y 0,7 U en la 2ª reacción (25 µl de volumen de reacción). La reacción de la amplificación se realizó usando el termociclador 2400 TM Perkin Elmer Gen Amp System. Las condiciones programadas para R221 y R332 fueron como paso inicial 94°C 5 min, 35 ciclos de 94°C 30 seg, 60°C 30 seg, 72°C 30 seg; y 72°C 10 min como paso final de extensión. Para R223 y R2333 las condiciones fueron similares a excepción de la temperatura de alineación que fue de 65°C.
PCR para Trypanosoma cruzi
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó según lo descrito.(25) Se realizó la amplificación de las regiones hipervariables del minicírculo de kDNA (DNA del cinetoplasto), el mismo que esta flanqueada por regiones conservadas que fueron utilizadas para elegir los iniciadores. El producto tiene un tamaño equivalente a 330 pb. La secuencia de los iniciadores fueron: 121: 5’-AAA TAA TGT ACG GG(T/G) GAG ATG CAT GA-3’ y 122: 5’ -GGT TCG ATT GGG GTT GGT GTA ATA TA-3’. Se realizó la preparación de la mezcla de amplificación utilizando 0,2 mM de desoxinucleótidos trifosfatados (Promega), 4 mM de MgCl2 (Promega), 200 ng de los iniciadores 121 y 122 (Amersham Pharmacia Biotech) 10 mM de Tris-HCL (pH 9), 50 mM de KCl, 0,1% de Triton® X-100 y 2,5 U de Taq DNA polimerasa (Promega) en un volumen final de 70 ul. La especificidad de los iniciadores 121 y 122 evaluada con extractos de DNA de cepas de referencia de T .cruzi, T. rangeli, T .brucei y cepas de Leishmania sp., alcanzaron 100% de especificidad para T. cruzi (26) y la sensibilidad de amplificación reportada es de 1 fg en extracto fenólico de sangre (14).
]]>La población
Durante el trabajo, se ha realizado el examen clínico a todos los individuos, y solamente uno de sexo masculino de 18 años de edad presentaba ulceraciones múltiples en ambos miembros superiores típicos de Leishmaniasis cutánea. El resto de la población (122 sujetos) fueron calificados dentro del grupo de "pacientes clínicamente sanos".
Se estratificó a los 123 individuos en cinco grupos por edades: de 0 a 9 años, de 10 a 14 años, de 15 a 19 años, de 20 a 55 años y más de 56 años de la siguiente manera: 40 sujetos (32.5%), 49 sujetos (39,8%), 21 sujetos (17,1%), 12 sujetos (9,8%) y 1 sujeto (70 años) (0,8%) respectivamente. cuadro # 1.
Detectamos un índice de desnutrición que alcanza al 21% de la población examinada (26 sujetos) de los cuales 20 (77%) mostraron una desnutrición leve y 6 (23%) una desnutrición moderada.
Pruebas serológicas para Leishmania y T. cruzi
En total 27 (21,9%) habitantes dieron positividad a una prueba serológica para Leishmania. Mediante IFI, rk39 y SLA–Leishmania, se detectó positividad en 7 (25,9%), 18 (66,6%) y 13 (48,1%) individuos respectivamente.
]]> Los individuos que dieron positivo a 2 pruebas simultáneamente fueron 9 y a 3 pruebas simultáneamente solamente 1, su distribución se muestra en la cuadro # 2.Si consideramos la prueba rk39 como la más especifica utilizada para la LV, llama la atención que el 14,6% de esta población (123 habitantes) resultan seropositivos. Dentro de los 27 seropositivos el 66,6% son rk39 positivos.
Dos niños de 5 y 10 años fueron detectados positivos por la serología de Chagas. El niño de 5 años también mostró positividad a las pruebas serológicas SLA-Leishmania e IFI. Mientras el niño de 10 años resultó negativo a todas la pruebas serológicas para Leishmania.
Resultados de PCR para Leishmania y T. cruzi
Leishmania fue detectado por PCR en 14 (11,4%) individuos y T. cruzi se detectó por PCR en 5 (4%) individuos. cuadro # 1.
2 individuos PCR-Leishmania positivos dieron una serología positiva para la prueba rk39 sin embargo los 12 restantes PCR positivos dieron serología negativa a las 3 pruebas (rk39, SLA e IFI), 25 (22,9%) individuos con serología positivas para Leishmania tuvieron PCR negativos. cuadro # 3.
Considerando la prueba serológica y la PCR, 7 (6,36%) individuos (niños entre 5 y 14 años de edad) fueron diagnosticados como positivos para la infección de Chagas de los cuales, 5 fueron PCR positivos y seronegativos y 2 PCR negativos con serología positiva.
]]> Un solo individuo de 14 años de edad, mostró una PCR positiva para Leishmania y T. cruzi, sin embargo, la serología para las dos enfermedades fueron negativos.
Discusión
La infección de Leishmania sp. en la zona de los Yungas ha sido descrita desde hace muchos años atrás.(6) Sin embargo, el estudio de leishmaniasis en esta región se ha limitado a un estudio de las formas cutáneas, y mucocutáneas considerando el riesgo de migrantes a los nuevos asentamientos humanos en áreas endémicas.(27, 28)
Es la primera vez que se realiza en Bolivia un estudio de infecciones subclínicas de LV en humanos. Desde 1982 hasta 1999, se han reportado solamente 9 casos humanos de LV procedentes de regiones subtropicales.(13) En los 4 últimos años se han registrado 3 nuevos casos en el Hospital del Niño de La Paz, procedentes del cantón Taipiplaya.
El uso del antígeno recombinante rk39 cuya sensibilidad y especificidad para la detección de infecciones por L. infantum es del 71,4% y 100% respectivamente (19, 20) ha permitido establecer una tasa de infección del 14,6% (18 habitantes) en el grupo de estudio.
Este porcentaje contrasta con los resultados obtenidos por IFI, cuya sensibilidad y especificidad reportadas son altas, detectó solamente en 7 individuos (5,7%) anticuerpos anti-antígenos totales de Leishmania sp. La prueba de ELISA-SLA utiliza como antígeno soluble promastigotes de L. infantum (Lem75), detectando anticuerpos anti-antígenos totales anti-leishmania en 13 individuos (10,6%) de los cuales 4 fueron seropositivos a la prueba de rk39 específica para L. infantum. La prueba ELISA-SLA puede tener reacción cruzada con otras infecciones parasitarias como Chagas y otras formas de leishmaniasis. Lo ilustra el único caso positivo con lesiones activas secundarias a infección de Leishmania sp (varón de 18 años de edad), quien no presentó anticuerpos anti-rk39, pero resultó seropositivo para SLA e IFI, además de ser seropositivo para T. cruzi detectado por IFI (1/80). Evidentemente, el paciente padeció una infección positiva para leishmania cutánea y presumiblemente también presentó reacción cruzada frente a antígenos totales de L. infantum (SLA) y a antígenos totales de T. cruzi.
La posible reacción cruzada también se ilustra con el caso del niño de 5 años de edad seropositivos para T. cruzi, y a las pruebas SLA-ELISA e IFI. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que estos dos pacientes sean portadores de infección mixta.
Recientemente se ha reportado la existencia de infecciones mixtas (T. cruzi y Leishmania sp.) circulantes tanto en reservorios como en humanos en regiones yungeñas norte y Sur (14-16) Es posible que en la región de Taipiplaya al ser también una zona yungueña con presencia de nichos ecológicos solapados de T. cruzi y Leishmania sp., se desarrolle infecciones mixtas en humanos. Por este razón se debe aplicar pruebas convencionales que presentan reacciones cruzadas con precaución, tratando en lo posible, de realizar varias pruebas específicas.
Por PCR-T. cruzi detectamos a 5 individuos (4,5%) con resultados negativos para ELISA-T. cruzi. La detección del material genético por PCR con una serología negativa deja suponer una infección reciente donde el número de parásitos circulantes es elevado, pero el paciente presenta un retraso para la repuesta inmune.(25)
]]> Llama también la atención la falta de concordancia entre los resultados obtenidos por serología y PCR para la leishmaniasis. Es probable que por consecuencia de una baja parasitemia la PCR no ha logrado detectar el material genético del parásito. Sin embargo, es posible que el individuo estuvo en contacto con el agente etiológico de leishmaniasis y que posteriormente, este agente fue eliminado, quedando solamente una seroprevalencia positiva como evidencia de un contacto previo registrado en la memoria inmunológica.Los 12 casos de la leishmaniasis positiva detectados solamente por PCR y que son negativos a las pruebas serológicas, pueden deberse a la detección de material genético de Leishmania sp. como consecuencia de una parasitosis aguda secundaria a una infección muy reciente y que aun no a logrado activar su sistema inmune. No esta por demás mencionar nuevamente, que la leishmaniasis puede causar por si misma un síndrome de inmunosupresión,(3) pudiendo constituirse en uno de los factores determinantes de un registro falso negativo serológico.
El grado de desnutrición puede ser un factor determinante de una respuesta inmune deprimida. Es conveniente hacer notar que de los 26 individuos con algún grado de desnutrición, solamente 4 dieron positividad a alguna prueba serológica, 7 dieron positividad a pruebas parasitológicas moleculares (PCR), siendo al mismo tiempo seronegativos. Estos resultados indicarían que el 26,9% de este grupo, serían portadores potenciales de una probablemente inmunodeficiencia secundaria a mal nutrición.
La LV no es considerada como un problema de salud pública en Bolivia. Gracias a la facilidad de uso y la especificidad de la prueba rk39, se a logrado estudiar a un grupo bastante amplio de residentes de una zona en la que se reportaron los últimos casos de Leishmaniasis visceral. Los altos porcentajes de serología positiva, sugieren que esta parasitosis no es una excepción. El porcentaje elevado de casos positivos detectados por el rk39 en el grupo estudiado y calificado como clínicamente sano, sugiere la posible existencia de un porcentaje significativo aun desconocido de casos fatales no diagnosticados. Muchos de los síntomas y signos de la LV al ser comunes a otras enfermedades, puede ser un factor desorientador en el diagnóstico, más aun, cuando se desconoce su existencia en la zona.
Para confirmar estos datos y la especificidad de la prueba rk39 dentro de un contexto epidemiológico especifico de LV, un estudio sobre el 30% de la población total del Cantón Taipiplaya está en curso.
Agradecimiento
Agradecemos al Director del Centro Educativo Mixto Taipiplaya, a la planta de profesores y toda la comunidad estudiantil del mismo por su apoyo en beneficio de la salud escolar. Igualmente agradecemos al personal del Centro de Salud Taipiplaya, en especial al Sr. Angel Quisbert Quispe, sanitario, quien colaboró de forma desinteresada durante el desarrollo del trabajo de campo, de la misma manera hacemos llegar nuestro agradecimiento a los Sres. Abdul Castillo, Julio Cesar Salinas y Félix García conductores del IRD, por su colaboración activa en el desarrollo del trabajo de campo.
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