Cuantificación de niveles de INF-y - IL-13 y células T CD4+, CD8+ en pacientes con leishmaniasis tegumentaria con falla terapéutica

Quantifying levels of INF-y - IL-13 and CD4 + T cells, CD8 + in patients with therapeutic failure leishmaniasis

Amilcar Flores León^1,a, Ernesto Rojas Cabrera^2,b, Marisol Córdova Rojas^2,c, Mary Cruz Torrico^1,c, David Paz^3,d

¹Laboratorios de Investigación Médica (LABIMED), Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Simón. Cochabamba, Bolivia.²Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIBISMED), Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Simón. Cochabamba, Bolivia.³Hospital Dermatológico de Jorochito. Santa Cruz, Bolivia.^aBiólogo; ^bMédico especialista en medicina tropical; ^cBioquímico; ^dMédico*Correspodencia a: Amilcar Flores León.Correo electrónico: leonamilcar@hotmail.com

Recibido el 15 de mayo de 2013.

Aceptado el 5 de junio de 2013

Resumen

Objetivos: se realiza un estudio del estatus inmunológico, cuantificando el perfil de citoquinas Thl (INF-y) y Th2 (IL-13) y células T CD3+, CD4+ y CD8+ como variables que puedan brindar información sobre el vinculo y/o asociación a la falla terapéutica.

Métodos: se cuantifi-co los niveles de INF-y , IL-13, CD4 + y CD8+ en tres grupos de estudio: a) Pacientes con LT y falla terapéutica (RESISTENTES), b) Pacientes tratados que respondieron al tratamiento de forma exitosa (SENSIBLES) c) Pacientes sanos (GRUPO CONTROL).

Resultados: los resultados indican, que la respuesta específica inmune de los pacientes Resistentes y Sensibles esta polarizada hacia la respuesta TH1 y los valores de los Linfocitos T CD4+ y CD8+ estaban por debajo de los valores normales en los tres grupos de estudio. Los niveles de producción de INF- y fue mayor que la IL-13, siendo mas pronunciada en pacientes Resistentes que Sensibles en respuesta al Ag de Leishmania, la tipificación de las cepas que fueron aisladas de los pacientes resistentes, identificaron a: Leishmania brasiliensis y Leishmania guayanensis.

Conclusiones: en relación a la falla terapéutica de los pacientes resistentes, estarían también involucrados los factores relacionados al parásito y otros factores extrínsecos al huésped.

Palabras claves: leishmaniasis cutánea; fracaso del tratamiento; citocinas; recuento de linfocito CD4; interferones.

Abstract

Objectives: is a study of the immune status, quantifying the Th1 cytokine profile (IFN-y) and Th2 (IL-13) and CD3 + T cells, CD4 + and CD8 + as variables that can provide information on the link and / or association therapeutic failure.

Results: the results indicate that the specific immune response of resistant and sensitive patients is polarized toward the TH1 response and values of CD4 + T lymphocytes and CD8 + were below normal values in the three groups. The levels of IFN-y production was higher than IL-13, being more pronounced in patients resistant to sensitive in response to Leishmania Ag, the typing of the strains that were isolated from patients resistant identified: Leishmania brasiliensis and guayanensis Leishmania.

Conclusions: regarding treatment failure resistant patients, would also be involved factors related to the parasite and other extrinsic factors to the host.

Keywords: leishmaniasis, cutaneous; treatment failure; cytokines; CD4 lymphocyte count; interferons.

La leishmaniasis es una enfermedad que constituye una zoonosis endémica de las regiones tropicales y sub tropicales del mundo, causado por un parásito intra-macrófago del género Leishmania. Los parásitos se transmiten por la picadura de mosquitos hembras que se alimentan de sangre, causando diversas manifestaciones de la enfermedad en humanos, que va desde la forma cutánea benigna (auto curación) pasando por las formas diseminadas y difusas, hasta la forma más severa de la enfermedad como es la leishmaniasis visceral.

Existe tres formas clínicas dominantes de la enfermedad: leishmaniasis cutánea (LC), leishmaniasis Mucocutánea (LMC) y leishmaniasis visceral (LV). Esta enfermedad es la causa de la morbi-mortalidad en varios países del mundo^1-3. La Organización Mundial de la Salud (OMS) la considera como la cuarta enfermedad más importante de las regiones tropicales. Casi 350 millones de personas viven en áreas endémicas y se calcula que 12 millones de individuos están infectados con el parásito, de los cuales 1,5 millones son casos notificados en fechas recientes⁴.

En Bolivia la leishmaniasis es endémica en 7 de sus 9 departamentos, siendo la Leishmanisis cutánea la forma clínica predominante, causada en la mayoría de los casos por Leishmania braziliensis (más del 85% de los casos), seguida de L. (Leishmania) amazonensis y L. lainsoni y algunos casos recientes por L. guyanensis^5-7. Los dos departamentos sin casos notificados son Oruro y Potosí, por la altitud a la que se encuentran, limite geográfico para el hábitat del vector transmisor.

Varios factores, como los relacionados al parásito, especies de vectores, respuesta inmune del paciente, genética y factores ambientales tienen influencia sobre el éxito del parásito para producir la infección².

El control de la infección y cura esta asociado con una polarización en la respuesta Th1, mientras que la no cura esta atribuido a una dominante respuesta Th2. Sin embargo, la regulación de la respuesta inmune frente a leishmania es com

pleja y el dominio de la respuesta Th2 no explica completamente la no cura o formas reactivas de la enfermedad^2,9.

En modelos experimentales (murinos) el resultado de la enfermedad depende del desarrollo de la respuesta inmune mediada por células y es fuertemente influenciada por la expansión de subset específicas de células T. En ratones resistentes a la infección (C57BL/6, CBA, y C3H/He), e infectados con L. mayor la autocuración de la lesión, esta asociada con la proliferación de células T CD4+ y producción de interferón gamma (INF-y) (respuesta TH1). Por el contrario, la infección con el mismo parásito en ratones susceptibles a la enfermedad (BALB/c), desarrolla la lesión que no se autocura, con producción de altos niveles de IL-4, IL-10 y otras citoquinas relacionadas a la respuesta TH-2^10-12.

La IL-13 es un importante componente para la generación y mantenimiento de la respuesta inmune frente a la infección con L. mayor, sin embargo la sobreexpresión de IL-13 promueve la susceptibilidad en ratones resistentes a la infección¹¹. En la Leishmaniasis se ha observado la activación de clonas especificas de LT CD8+ en respuesta a antígenos de leishmania que inducen una inmunidad protectora y un cambio en la respuesta temprana de Th1 a TH2. En seres humanos se piensa que linfocitos T CD8+ juegan un papel crucial en la infección, se ha notificado un elevado número de células T CD8+ en lesiones y sangre periférica durante la fase aguda de la infección y el proceso de eliminación de Leishmania mayor y Leishmania mexicana.

Al no existir estudios a nivel inmunológico sobre pacientes con leishmaniasis cutánea y fracaso terapéutico a medicamentos de primera línea, el equipo de investigadores realizó un estudio del estatus inmunológico, cuantificando el perfil de citoquinas Th1 (INF-y) y Th2 (IL-13), CD4+ y CD8+ como variables que puedan brindar información sobre el vinculo y/o asociación a la falla terapéutica.

Materiales y métodos

Área de estudio

El trabajo de investigación se realizó en los Laboratorios de Investigación Médica (LABIMED) y el Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIBISMED) de la Facultad de Medicina de la Universidad Mayor de San Simón, previa aprobación por el comité ético/científico de dicha Institución.

Pacientes

Pacientes con antecedentes de Leishmaniasis, que acudieron al Centro de Salud de Tacopaya en el municipio de Villa Tunari- Cochabamba y Hospital Dermatológico del municipio de Jorochito de Santa Cruz, fueron reclutados previo consentimiento informado escrito.

Grupos de estudio

Pacientes que han cursado la infección por leishmania fueron clasificados en tres grupos de estudio: Pacientes Resistentes al tratamiento, Pacientes Sensibles al tratamiento y Pacientes Sanos que viven en zonas endémicas (Grupo Control).

Los criterios de inclusión para estos grupos de estudio fueron los siguientes:

b)    Sensibles: Grupo de pacientes (n=10) con leishmaniasis tegumentaria confirmada que respondieron exitosamente al tratamiento específico con medicamentos de primera línea y que después del tratamiento muestran una lesión cicatrizada con una historia de infección no mayor a un año.

c)    Sanos: Grupo de pacientes (n=10) que viven en la zona endémica sin antecedentes de leishmaniasis.

Pacientes con enfermedades crónicas, lesiones tegumentarias mixtas o sobre infectadas con otras patologías fueron descartados del estudio (criterios de exclusión).

Antígenos y Mitógenos empleados

La obtención del antígeno soluble de Leishmania (ASL) fue a partir de Promastigotes de Leishmania sp en fase estacionaria de crecimiento, los cuales fueron lavados tres veces con fosfato buffer salino (PBS), y resuspendidos a una concentración de 10 millones de parásitos/mL. Posteriormente la suspensión fue sometida a shock térmico por ocho ciclos cortos de congelamiento y descongelamiento (nitrógeno líquido / baño maría a 36 °C) luego fue centrifugado a 9000 rpm por 30 minutos. La suspensión fue almacenada a -70 °C hasta su uso. La concentración de proteínas antigénicas fue determinada por el método de Bradford. Staphylococal Enterotoxina B (SEB) (Sigma Aldrich) Mitógeno, empleado como control positivo en el cultivo celular, este tiene la capacidad de activar a las células T no especificas (súper antígeno).

Recolección de muestras de sangre, aislamiento de células mono nucleares de sangre periférica y cultivo in vitro

Sangre periférica (10 ml) fueron colectados en tubos he-parinizados libres de endotoxinas. El aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se realizó por centrifugación sobre un gradiente de densidad Nycopret (Nycomed Pharma AS. Oslo. Norway). PBMC (2x10⁶ cels/ mL) fueron cultivados por 6 días a 37 °C con 5% de CO2 y humedad relativa, en RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% (SBF), 100 U pencilina/ml y 100 ^g de streptomocina (Cam-brex Bio Science), para medir la producción de citoquinas en las diferentes condiciones: síntesis espontánea (control negativo de proliferación), en presencia de 20 ^l ASL (1 millón/ ml) y 20 ^l SEB (10ng/mL) control positivo de proliferación. Posterior al cultivo, las células fueron centrifugadas y sobrenadantes fueron conservados a -70 °C para el análisis de cito-quinas Th1 y Th2.

Determinación de citoquinas

La INF-y y IL-13 fueron empleados como marcadores de respuesta Th1/Th2 respectivamente. Niveles de estas citoquinas fueron medidos en los sobrenadantes del cultivo celular, con un ELISA (sandwich enzyme linked immunosorvend assay) para lo cual se empleo kits comerciales: Kit de INF- y (R&D Systems. INC, Minneapolis, EEUU); Kit de IL-13 (ultrasensible de R&D Systems. INC, Minneapolis EEUU). El ensayo fue calibrado para detectar INF- y e IL-13 dentro de un rango de 1000 a >8 pg/mL y 4000 a >32 pg/mL respectivamente.

Figura 1. Producción de IFN-y: en presencia de Ag solubles de leishmania (ASL) por PBMC de pacientes con falla terapéutica (Resistentes n=10) pacientes tratados exitosamente (Sensibles n=10) y pacientes Controles (n=10). Células fueron cultivadas por 6 días en presencia de 50 pg/ml de ASL. La medición deniveles de IFN-yse realizó por ELISA, los resultados son expresados como ± SEMpg/ml y las diferencias estadísticas entre grupos son mostrados como: *: p<0.05 y **p<0.005 (Mann Whitney U Test).

PBMCs de los cultivos celulares de los 3 grupos de estudio, fueron separadas por centrifugación. Estas células (50 ^l) fueron puestas en contacto con microesferas y anticuerpos monoclonales conjugados CD4+ y CD8+ en solución tampona-da. Una vez fijadas las células se procedió a realizar la lectura por citometría de flujo, (10 000 eventos por muestra) usando el equipo FACSCount Becton DicKinson. El recuento absoluto de linfocitos T CD4+ y CD8+ se realizó con el Kit BD FACS Count Reagents (Cat. No 340167 BD Biociences) siguiendo las especificaciones del kit.

Figura 2. Producción de IL-13: en presencia de ASL por PBMC de pacientes con falla terapéutica (Resistentes n=10),pacientes tratados exitosamente (Sensibles n=10) y pacientes Controles (n=10). Células fueron cultivadas por 6 días en presencia de 50 pg/ml de ASL. Los resultados de la medición de niveles de citoquinas por ELISA son expresados como ± SEMpg/ml y las diferencias entre grupos son mostrados como; *: p<0.05 y **p<0.005 (Mann Whitney U Test).

Expresión de resultados y análisis estadístico

Los resultados fueron expresados como medias aritméticas ± SEM. Comparación de concentraciones de citoquinas entre grupos de pacientes Resistentes, Sensibles y Controles así como el análisis de células CD4+ y CD8+, fueron desarrollados con Mann Whitney test. El análisis estadístico fue conducido usando Graph Pad Prism software (GraphPad Prism 4 San Diego, CA, EEUU).

Resultados

Niveles de INF-y producidos por PBMC de pacientes Resistentes indican su nivel de activación de la respuesta Th1, la cual esta más activada en comparación con pacientes sensibles y controles.

La concentración de IFN-y fue empleada como marcador de la respuesta Th1. Estos niveles de citoquinas fueron medidos en sobrenadantes de cultivo celular por ELISA.

Figura 3. Producción de INF- y e il-13 en respuesta a ASL (50 pg/ml) por PBMC de pacientes con falla terapéutica (Resistentes n=10), pacientes tratados exitosamente (Sensibles n=10) y pacientes Controles (n=10). Los resultados de la medición de niveles de citoquinas por ELISA son expresados como ± SEMpg/ml y las diferencias entre grupos son mostrados como; *: p<0.05 y **p<0,005 (Mann Whitney U Test).

La figura 1 muestra que PBMC estimuladas con Ag soluble de Leishmania sp. (ASL), de pacientes Resistentes producen mayor IFN-y que pacientes Sensibles y Controles (846.2 ± 95,24; 569,6 ± 146,1 y 377,4±136,6 pg/ml respectivamente), estos valores muestran los diferentes niveles de producción de INF- y entre los grupos de estudio, donde se observa una diferencia no significativa entre pacientes Resistentes y Sensibles y hallándose diferencia estadísticamente significativa de producción de citoquinas Th1 al comparar con el grupo Control (p<0,05).

En general, los niveles de INF-y producidos por PBMC de pacientes Resistentes indican su nivel de activación de la respuesta Th1, la cual esta más activada en comparación con los pacientes Sensibles y Controles, si bien esta mayor producción de INF-y, refleja una respuesta activa y especifica frente a leishmania, esta no explica del porque ocurrió la falla terapéutica.

Bajos niveles de IL-13 producidos por PBMC de pacientes Resistentes indican una polarización de la respuesta inmune hacia el tipo TH1.

Niveles de IL-13 fue empleada como marcador de la respuesta TH2. Estos niveles de citoquinas fueron medidos en sobrenadantes de cultivo celular por ELISA

La figura 2, muestra la estimulación de PBMC de los grupos Resistentes, Sensibles y Controles, con ASL (Antígeno soluble de leishmania), los resultados muestran que los tres grupos de estudio producen bajos niveles de IL-13 y/o hasta no detectables, estas diferencias, no son significativas en términos estadísticos (44,26 ± 14,58; 19,91± 7,8 y 28,81 ± 16,84 pg/ml respectivamente). Lo cual indica que las PBMC de los tres grupos de estudio no producen una respuesta Th2 en respuesta al ASL.

La figura 3 muestra la comparación de los niveles de producción de INF- y e IL-13 por PBMC de los tres grupos de estudio, estimuladas con ASL. La figura 3a muestra los niveles de producción de INF- y (846,2± 95,24pg/ml) e IL-13 (44,26±14,58pg/ml) por PBMC de pacientes Resistentes, donde se observa que existe una diferencia estadísticamente significativa entre los niveles de producción de INF-y e IL-13 (p=0,005). Este mismo comportamiento se observó en pacientes Sensibles (figura 3b) donde los niveles de INF-y fueron superiores a los niveles de IL-13 producidos (569,6±146,1; 19,91 ±7,8 pg/ml respectivamente), diferencias estadísticamente significativas (p=0,05). La figura 3c muestra una mayor producción de INF- y que IL-13 por PBMC de pacientes controles estimulados con ASL (377,4±136,6; 28,81 ± 16,84 pg/ml respectivamente) diferencias estadísticamente significativas (p=0,05).

Estos resultados confirma que la respuesta inmune de pacientes Resistentes y Sensibles esta polarizada a hacia una respuesta Th1 siendo más pronunciada esta diferencia en pacientes Resistentes y que los niveles detectados de IL-13 corresponde a niveles basales normales.

Células T CD4+ y CD8+ se encuentran por debajo de los valores normales de referencia en pacientes Resistentes y sensibles, lo cual es un indicador de una inmunodeficiencia del sistema inmune.

Se observó inmunodeficiencia celular en pacientes Resistentes y Sensibles, caracterizada por la disminución de los lin-focitos CD4+ (células T Helper), CD8+ (células T supresoras/ citotoxicas) y la relación CD4/CD8, en comparación con los valores normales de referencia. Por otro lado se observó que los linfocitos T CD4+ y CD8+ se encuentran próximos a los valores normales de referencia en los pacientes sanos (controles), estos datos muestran que los pacientes resistentes y sensibles presentan algún grado de inmunodeficiencia de su sistema inmune.

Discusión

El desarrollo de la inmunidad protectora contra diferentes formas de leihmaniasis humana es usualmente asociado con la producción de INF-y que son inducidos por células T específicas para leishmania. Esta respuesta no siempre indica protección porque esta infección está asociada a una respuesta de tipo Th2, la cual conduce a la persistencia de la enfermedad como la forma crónica de leishmania cutánea no curada o leishmaniasis mucosa donde niveles de INF- y permanecen elevados¹⁰.

En este estudio Antígeno soluble de leishmania sp., fue empleado para estimular PBMC de pacientes de los tres grupos de estudio y valorar los niveles de INF - y, los sobrenadantes. Los resultados indican que todos los grupos de estudio mostraron altos niveles de producción de INF -y, siendo el grupo de pacientes resistentes que mostraron mayor producción, inducido por células T (fig. 1). Aunque la correlación de INF-y con la protección no está aceptada universalmente, existe evidencia que INF-y es la principal citoquina de la respuesta TH1 y esta implicada en la inmunidad protectora contra leishmaniasis¹⁰. Respecto a la producción de INF-y en pacientes con

troles, muestran niveles de INF- y detectados en respuesta al antígeno soluble de leishmania, sin embargo algunos autores mencionan, que existen otros factores asociados que inducen la producción, como la pre-exposición a organismos con antí-genos que ocasionan reacciones cruzadas (ie. Mycobacterium sp.)¹⁰. Sin embargo, la producción de INF-y por células T no relacionadas a leishmania de personas sanas no esta claro^10,13.

Con respecto a IL-13, diferentes estudios en modelos mu-rinos de leishmaniasis cutánea muestra ser importante en la susceptibilidad y asociación de la respuesta relacionada a la no cura en L. mayor y L. mexicana y que además contribuiría a producir la enfermedad. IL-13 reduce la respuesta de INF-y, así como la activación de macrófagos desencadenando el éxito de la infección¹⁴.

Nuestros datos muestras que niveles de IL-13 detectados en pacientes resistentes son relativamente mas altos (diferencia estadísticamente no significativa) y que estos decrecen en pacientes Sensibles (fig.2), otros autores coinciden con los resultados, donde pacientes con previo tratamiento fallido muestras elevados niveles de IL-13 mRNAs detectados y decrece significativamente en pacientes que respondieron al tratamiento¹⁵.

En general, encontramos que niveles de INF-y decrecen significativamente en pacientes que respondieron al tratamiento (Sensibles) pero no en pacientes con falla terapéutica (Resistentes). Entonces basados en nuestros datos es difícil señalar una preferencia a la respuesta ^2 como único elemento causante de la resistencia al tratamiento en leishmania Tegumentaria, parecería que ambas citoquinas ^1 y ^2 contribuyen a esta patología.

Con respecto a la medición de Linfocitos T CD4+ (células T Helper), CD8+ (células T supresoras/citotoxicas) en pacientes resistentes y sensibles al tratamiento, se pudo observar que los valores están por debajo de los estándares normales de referencia (tabla 1), contrariamente los valores de CD4+ y CD8+ de pacientes sanos(controles) se encuentran próximos a los valores normales de referencia. Estos datos sugieren que leishmania podría modular la respuesta inmune para favorecer la infección. Sin embargo algunos autores indican que pacientes infectados con L. braziliensis presenta una mayor proporción de células T CD4+, en comparación de células T CD8+, durante la infección activa y en el proceso de curación^15,16, contrariamente a los resultados reportados en nuestro estudio donde ambos CD+ en pacientes resistentes y sensibles, se encuentran con valores inferiores a los estándares normales.

Maurer et al¹⁵, indica que una corta permanencia del paciente (menor a 72 meses) en áreas endémicas para la transmisión de la enfermedad, es un factor de riesgo para la falla del tratamiento, indicando que la inmunidad protectora se incrementa con el tiempo de residencia en áreas donde la enfermedad es endémica. Porque la intensa producción de INF-y resulta en no control del parásito, mas bien en la destrucción del tejido. En base a lo mencionado podríamos decir que nuestra población con falla terapéutica, tienen antecedentes de ser personas migrantes en las zonas endémicas para esta enfermedad ingresando solo por periodos cortos de tiempo (datos no mostrados) por lo que podríamos pensar que este factor también podría condicionar el fracaso terapéutico en estos pacientes, además podrían intervenir otros factores como: Infecciones tratadas tempranamente (menor a 5 semanas antes del inicio de la infección), múltiples lesiones, edad, y especies de parásitos¹⁷.

En conclusión, la respuesta específica inmune de pacientes Resistentes y Sensibles esta polarizada hacia TH1 sin embargo esta polarización no explica del porque existe falla o fracaso terapéutico. Valores de linfocitos T CD4+, CD8+ indican una inmunodeficiencia en ambos grupos de estudio, indicando que el parásito modula la respuesta inmune el huésped ya que pacientes sanos muestran valores de CD4+ y CD8+ cercanos a los valores normales de referencia . Estudios de Biología Molecular, demostró una predominancia de la cepa L. braziliensis (datos no mostrados).

Agradecimientos: Agradecemos a la Agencia de Cooperación Sueca (ASDI), y a la DICyT (Dirección de Ciencias y Tecnología ) - Proyecto Concursable FC25 por hacer posible la ejecución de este trabajo de investigación.

Conflictos de interés: los autores declaramos que no existe conflicto de intereses.

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