Estudio in vitro de la actividad antifúngica de extractos vegetales del género Baccharis sobre Candida albicans
Silvia Martínez1,2, Patricia Mollinedo1, Oscar Mamani 3, Giovana Almanza3, Enrique Terrazas2
1Instituto de Investigaciones en Productos Naturales, Carrera de Ciencias Químicas, Universidad Mayor de San Andrés, Campus Universitario, Edificio FCPN, Calle27, Cota-Cota,
2Instituto de Investigaciones Fármaco-Bioquímicas, Av. Saavedra 2224, Miraflores,
3Instituto de Investigaciones Químicas, Edificio FCPN, Calle27, Cota-Cota
Keywords: Candida albicans, Baccharis, Curvas de Letalidad, in Vitro
ABSTRACT
]]>The research goal was to find alternatives for controlling the growth of microoganism. Thus antifungal activity was determined from polar an non polar plants crude extracts of Baccharis, using non-polar and polar extracts, of Baccharis latifolia, Bacharis genistelloides, Baccharis obtusifolia, Baccharis papillosa, Baccharis santelicis, genus, against species on ATCC strains of Candida albicans. Extract of Baccharis latifolia, growth inhibition was observed.
Corresponding author: sssilmar92@gmail.com
RESUMEN
Con la finalidad de buscar alternativas para el control del crecimiento de microorganismos patógenos, se investigó la actividad antifúngica de plantas del género Baccharis, utilizando extractos no polares y polares, de las especies Baccharis latifolia, Baccharis genistelloides, Baccharis obtusifolia, Baccharis papillosa, Baccharis santelicis, sobre cepas ATCC de Candida albicans. Presentando actividad inhibitoria los extractos de Baccharis latifolia.
INTRODUCCION
La Fitoterapia es una parte de la Terapéutica, cuyo desarrollo nos permite disponer de medicamentos a base de plantas, para prevenir, atenuar o curar un estado patológico, generalmente con una actividad suave o moderada, con márgenes terapéuticos relativamente amplios, que dan lugar a tratamientos menos agresivos.[1],[2] De esta manera las plantas juegan un papel primordial en los sistemas de salud pública de países en desarrollo. Es más, durante las últimas décadas, el interés del público en las terapias naturales ha aumentado enormemente en países industrializados y se halla en expansión el uso de plantas medicinales y medicamentos cuyas materias primas son drogas vegetales o sus extractos.[3],[4] En el desarrollo de un antimicrobiano se requiere de ensayos preclínicos y clínicos, dentro de los primeros, se distinguen dos grupos encaminados a investigar diferentes efectos del compuesto: ensayos toxicológicos y estudios de actividad, para asegurar una eficacia demostrada in vitro y posteriormente in vivo.[5],[6] El uso de fitocomponentes con propiedades microbicidas y/o microbiestáticas, además de incrementar el gradiente de acción en el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos, también promueve el uso alterno de ciertas plantas y el desarrollo de las regiones donde ellas crecen, incentivando al lugareño a asentarse y tener un medio de sustento familiar.[7],[8]Además, existen problemas de seguridad y toxicidad de los fármacos o la aparición de resistencias, lo cual motiva el desarrollo de nuevos antifúngicos naturales que aporten ventajas apreciables respecto a los actuales fármacos.[9],[10] Dentro de la biodiversidad vegetal,[11], [12] se tienen estudios de especies del género Baccharis, de uso tradicional en América Latina. [13],[14] Su fitoquímica destaca la presencia de Flavonoides, Diterpenos y Triterpenos, observándose mayor acumulo de Flavonas, Flavonoides y Diterpenos Labdanos y Clerodanos. [15],[16] También presentan actividad antioxidante que parece correlacionar con esta actividad antiinflamatoria y con el contenido de compuestos Fenólicos. [17],[18] Además presentan otras actividades biológicas como ser antimicrobiana, espasmolítica, antiviral, gastroprotectiva, antileucémica. [19],[20] El estudio ha sido enfocado hacia el uso de Productos Naturales, extractos vegetales, centrándonos en la actividad antifúngica in vitro.[21],[22] Para lograr que la población disponga de fitofármacos rigurosamente estudiados. Se decidió probar la actividad antifúngica[23],[24] in Vitro de un grupo de extractos vegetales de la especie Baccharis frente a microorganismos causantes de diversas patologías tanto en humanos y animales, lo cual podría llevarnos al desarrollo, a partir de plantas utilizadas tradicionalmente a formular la preparación de diferentes formas farmacéuticas con actividad farmacológica definida y colaborar con la gran demanda social de nuevos agentes antimicrobianos, con el fin de contribuir a preservar el recurso vegetal y permitir una explotación racional de la vegetación autóctona medicinal, es así que la composición química de las diferentes especies, en unión a sus propiedades farmacológicas, microbiológicas, permitirán valorizarlas, ofreciendo un respaldo científico que avale su aplicación en la medicina tradicional.
]]> RESULTADOS, DISCUSION
Mediante microensayos de Microdilución y el Método de Susceptibilidad por Difusión Bauer-Kirby con Disco de Papel impregnado con Extracto sobre Agar, se determinó cualitativamente las especies vegetales que presentan actividad inhibitoria del extracto frente a la cepa Candida albicans. (Figura 1). De los extractos ensayados como se muestra en la Figura 1, se tiene que el extracto acuoso de Baccharis latifolia S2 presenta poca o ninguna turbidez, indicio de que existe una actividad inhibitoria en las primeras concentraciones diluidas. Por otro lado se observa la presencia de poca turbidez para los extractos S1 y S3, lo que indica que puede existir cierto porcentaje de inhibición. Lo cual concuerda con el Método de Susceptibilidad por Difusión BAUER-KIRBY con disco de papel impregnado con extractos vegetales sobre agar. Para conocer el extracto que presenta actividad antifúngica se toma en cuenta los halos de aquellos que fueron igual o están por encima de 30% de inhibición. La Tabla 1 presenta el porcentaje del halo de inhibición de los extractos acuosos de B. latifolia S2 de 37 %, de S2O de 35%, también se tomo en cuenta a B. genistelloides S1 de la Paz y S3 de Cochabamba ambos extractos acuosos con 42% de inhibición.
Figura 1. Microdilución de extractos polares y no polares de plantas del genero Baccharis frente a Candida albicans C(-).
La Tabla 1 y Figura 2 representan el porcentaje del halo de inhibición de los extractos acuosos de B. latifolia S2 de 37 %, de S2O de 35%, también se tomo en cuenta a B. genistelloides S1 de la Paz y S3 de Cochabamba, ambos extractos acuosos con 42% de inhibición. Para determinar la actividad fungicida y/o fungistática, se realizó la prueba de la dinámica de acción inhibitoria en el tiempo, donde se obtienen Curvas de letalidad para cada uno de los extractos antimicrobianos, realizándose el ensayo para los extractos activos de B. latifolia y B. genistelloides. En la Figura 3 podemos ver que las curvas de mortalidad tiempo de los extractos acuosos de B. genistelloides de La Paz S1C y S1P que descienden dos unidades logarítmicas en las dos primeras horas, para luego incrementar su concentración cerca al inóculo inicial. Al no presentar tres unidades de logaritmo de diferencia con el control negativo C.A. y llegar a 4,8 y 4,3 log U.F.C./mL respectivamente, podemos considerar que los extractos de B. genistelloides pueden presentar un comportamiento fungistático utilizando cantidades mayores de1 mg de extracto. Los extractos acuosos en la Figura 4 de B. genistelloides de Cochabamba S3C y S3P no descienden más de 1 Log U.F.C./mL, en las dos primeras horas y luego aumenta ligeramente la población microbiana permaneciendo casi constante muy cerca del valor del inóculo inicial. Comparando con el control negativo C.A. se puede decir que existe la posibilidad de un comportamiento fungistático a cantidades mayores de 1 mg de extracto acuoso.
Figura 2. Halos de inhibición en mm de extractos polares de plantas del genero Baccharis frente a Candida albicans.
Para Baccharis latifolia (Figura 5), el extracto S2P inhibe de 5,8 a cerca de 1 U.F.C./mL hasta las 12 horas de ensayo, para luego permitir un moderado incremento de la concentración microbiana llegando a una concentración de 3 log U.F.C./mL. El extracto S2C descienden inicialmente de 5,8 a 3,0 U.F.C./mL hasta las 6 horas, posteriormente incrementa su concentración microbiana de Candida albicans hasta permanecer casi constante a 3,5 U.F.C./mL.
Figura 3. Actividad antifúngica de extractos polares acuosos de Baccharis genistelloides de La Paz contra Candida albicans Control negativo c.a.
]]> Pasadas las 2 horas de ensayo el extracto S2O inhibe a cerca de 3 log U.F.C/mL, luego se observa un ligero incremento a 3,6 U.F.C./mL, para continuar estable a lo largo de las otras 24 horas. La representación de la letalidad de los extractos etanólicos se observa en la Figura 6, donde a las primeras horas existe una inhibición total al inóculo de Candida albicans con E10C y E10P para luego pasadas las 12 horas comenzar a disminuir su actividad inhibitoria poco a poco hasta llegar a 1,8 U.F.C./mL, pero aun mantiene 3 unidades logarítmicas por debajo de la curva de crecimiento de Candida albicans en color verde claro. Con el extracto E20C y E20P se observa inhibición total del desarrollo de C. albicans desde un inicio hasta las 48 horas de ensayo en comparación al control negativo en línea verde claro, que representa el crecimiento de C. albicans.
Figura 4. Actividad antifúngica de extractos polares acuosos de Baccharis genistelloides de Cochabamba contra Candida albicans Control negativo c.a.
Figura 5. Actividad antifúngica de extractos polares de Baccharis latifolia contra Candida albicans Control negativo c.a.
Figura 6. Actividad antifúngica de extractos polares etanólicos de Baccharis latifolia de La Paz contra Candida albicans Control negativo c.a.
SECCION EXPERIMENTAL
]]> Las especies vegetales Baccharis santelicis, Baccharis genistelloides, Baccharis latifólia, Baccharis papillosa, Baccharis obtusifolia, se recolectaron e identificaron para luego utilizar las partes aéreas realizando el secado, trituración y preparación de los extractos polares y no polares, según la metodología estandarizada por el área de Productos Naturales del Instituto de Investigaciones Químicas, de la Carrera de Ciencias Químicas. Los extractos obtenidos se concentran en un rotaevaporador. Los residuos secos obtenidos se guardan en frascos estériles en ambiente seco y oscuro. Como fármacos Control se utilizaron Ketoconazol 20 mg/mL, Fluconazol 40 mg/mL. Se aplicó el método de Curvas de letalidad para determinar la característica Fungicida o Fungiestática de los extractos. Se utilizó la cepa de Candida albicans 98001 ATCC como población celular de partida entre 1 a 5 x 105 UFC/ml, incubadas a 35 ± 2°C, aplicando el método de Curvas de letalidad según la NCCLS, realizado en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas. Nota. B6 es el Extracto etanólico de B. genistelloides de Cochabamba, R3 es el Extracto no polar de B. papillosa en diclorometano por 18 horas, R4 es el Extracto etanólico de B. latifolia por 37 horas, R5 es el Extracto no polar de B. papillosa en diclorometano por 2 horas, S1, S1C, S1P son Extractos acuosos de B. genistelloides de La Paz, S2, S2C y S2P son Extractos acuosos de B. latifolia, S2O es el Extracto fenólico de polaridad media de B. latifolia, S3, S3C S3P son Extractos acuosos de B. genistelloides de Cochabamba, E10C, E10P, E20C y E20P son extractos polares etanólicos de B. latifolia. Los Controles positivos Ketoconazol comprimidos simbolizado como K, KJ representa a Ketoconazol Jarabe y F es Fluconazol I.V.
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