ACTIVIDAD LEISHMANICIDA DE PLANTAS MEDICINALESDE LA AMAZONIA PERUANA
Joahan Rojas U., Johann R. Satalaya A., Maritza Grandez, R., Luis Vilchez, A., Elsa Rengifo, S., Efrain Salamanca, C., Ninoska Flores Q., Alberto Giménez T., Juan Antonio Ávila I., Grace Ruiz P.
aFacultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional de la Amazonia Peruana, Sargento Lores 385, Iquitos, Perú. Telf: 51 65 232186.
bInstituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana, Av. José A. Quiñones km. 2.5 - Apartado Postal 784, Loreto – Perú. Telf: +51+65+265515,
c Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés. Av. Saavedra 2224, 2º Piso, Miraflores, La Paz-Bolivia Telf: 591 2 2229021
Keywords: Extractos, plantas de la amazonía peruana, leishmanicida, óptico, test de reducción de tetrazoilo
ABSTRACT In this study the eight medicinal plants from the Peruvian Amazon were evaluated searching their parasiticide activity in vitro: Ampelozizyphus amazonicus, Andira inermes, Bellusia pentamera, Couma macrocarpa, Croton lechleri, Unonopsis spectabilis, Urena lobat and, Xilopia parviflor. The study was performed using different species of promastigotes from Leishmania: L. amazonensis (IFLA/BR/75/PH8), L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) and L. donovani (MHOM/74/PP75) . The assays were developed by count trough an optical method in a Neubauer camera and fractions that were active have been evaluated with the colorimetric the method using XTT. The organic CH2Cl2 extract from Unonopsis spectabilis was the more active with an IC50 65.3, 54.2 and 24.5 mg/mL vs. L. amazonensis (IFLA/BR/75/PH8), L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) and L. donovani (MHOM/74/PP75) from the optical method respectively. In order to determine the leishmanicide activity of the organic fraction the colorimetric XTT method was used against L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) and L. amazonensis (MHOM/BR/76/LTB-012). The results showed values of IC50 between 10.6 mg/mL and 11.8 mg/mL respectively./ En el presente trabajo se evaluó el efecto parasiticida in vitro de ocho plantas medicinales de la amazonia peruana: Ampelozizyphus amazonicus, Andira inermes, Bellusia pentamera, Couma macrocarpa, Croton lechleri, Unonopsis spectabilis, Urena lobata, Xilopia parviflora. Los estudios in vitro fueron realizados sobre promastigotes de diferentes especies de Leishmania: L. amazonensis (IFLA/BR/75/PH8), L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) y L. donovani (MHOM/74/PP75) a través del método óptico por conteo en cámara de Neubauer y las fracciones que resultaron activas fueron evaluadas a través del método colorimétrico XTT. El extracto CH2Cl2 de Unonopsis spectabilis fué el mas activo con una CI50 de 65.3, 54.2 y 24.5 mg/mL frente a L. amazonensis, (IFLA/BR/75/PH8), L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) y L. donovani (MHOM/74/PP75) por el método óptico respectivamente. A si mismo la actividad leishmanicida de las fracciones por el método colorimétrico XTT contra las cepas L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) y L. amazonensis (MHOM/BR/76/LTB-012), dieron valores de CI50 entre 10.6 mg/mL y 11.8 mg/mL respectivamente.
Corresponding author: gracerfm@hotmail.com
INTRODUCCION
]]> Una de las preocupaciones de la humanidad en todos los tiempos, ha sido mantener el buen estado de su salud. Las sociedades amazónicas no han sido ajenas a esta preocupación, desde su propia concepción de salud y enfermedad y la diversidad biológica de su entorno, cada uno de los pueblos indígenas amazónicos ha desarrollado conocimientos acerca de las propiedades curativas de las plantas 1. La Amazonía Peruana comparte con los ocho países amazónicos no sólo la más grande cuenca del planeta, sino también la mayor diversidad biológica del mundo. Se considera 3.140 especies útiles, de las cuales 1.044 tienen uso medicinal y constituye una de las más grandes reservas de recursos terapéuticos. El hombre amazónico, a través de toda su historia, ha logrado identificar importantes especies que presentan compuestos biológicamente activos que han contribuido aliviar y curar diversas enfermedades entre ellas la leishmaniasis.2 Las enfermedades infecciosas tropicales constituyen un problema, para un gran porcentaje de seres humanos que habitan en zonas tropicales de nuestro planeta, se evidencia una urgente necesidad en la búsqueda de alternativas terapéuticas de nuevas moléculas seguras efectivas, económicas y fáciles de administrar 3 4. Los conocimientos empíricos étnicos son un primer paso para la evaluación de la actividad antiparasitaria in vitro5 y por medio de este estudio validar la actividad leishmanicida de las especies vegetales. El Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas IIFB de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas de la Universidad Mayor de San Andrés de La Paz - Bolivia, esta realizando este tipo de estudios, para que existan respaldos científicos del uso tradicional de las plantas.RESULTADOS, DISCUSION
De todas las especies evaluadas la que presentó actividad leishmanicida in vitro contra las tres cepas de Leishmania fue el extracto de CH2Cl2 de U. spectabilis, con una CI50 de 65.3, 54.2 y 24.5 mg/mL frente a L. amazonensis (IFLA/BR/75/PH8), L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) y L. donovani (MHOM/74/PP75) respectivamente. El extracto EtOH de la misma especie, presentó actividad frente a L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) con CI50 64.3 ug/mL y L. donovani (MHOM/74/PP75) con CI50 = 25.5 ug/mL. Otra de las especie que presento buena actividad es el extracto (EtOH), de Xylopia parviflora con una CI50 31.2 µg/mL frente L. donovani, mientras que el extracto CH2Cl2, dio actividad frente a L. braziliensis con una CI50 61.7 ug/mL. El extracto EtOH y EtOH (2) de Urena lobata presento actividad frente a L. donovani con una CI50 de 41.9 y 63.9 ug/mL, mientras que el extracto EtOH de Bellucia pentamera presento baja actividad frente a promastigote de L. donovani CI50 = 71.7 mg/mL. (Tabla 1).
Tabla 1. Actividad leishmanicida in vitro de los extractos sobre promastigotes de Leishmania, CI50 expresadosen µg/mL
De la especie Unonopsis spectabilis se obtuvieron 9 fracciones, las que presentaron mayor actividad antiparasitaria in vitro, fueron las fracciones (F2) con un CI50 = 50 mg/mL en L. braziliensis y L. donovani; la fracción (F6) con un CI50 = 54.8 mg/mL en L. braziliensis y en L. donovani con un CI50 = 52 mg/mL; y la fracción (F7), en L. braziliensis y en L. donovani ambos con un CI50 = 50 mg/mL. (Tabla 2)
Tabla 2. Actividad leishmancida in vitro sobre promastigotes de Leishmania, (CI50) expresados en µg/mL de las fracciones de Unonopsis spectabilis
La fracción F6 se subfraccionó dando como resultado 6 subfracciones de las cuales se observó que las únicas subfracciones que presentaron actividad antiparasitaria in vitro fueron las fracciones F6.1-JUS con un CI50 = 17.1mg/mL, CI50 = 15.8 mg/mL en L. braziliensis y L. donovani respectivamente; la fracción F6.2 dió un CI50 = 8.05 mg/mL en L. braziliensis y en L. donovani; mostrando actividad moderada frente a L. amazonensis con un CI50= 67.3 mg/mL; y la fracción F6.3 con un CI50 = 32.2 mg/mL en L. braziliensis y L. donovani. Cabe hacer notar que la actividad antiparasitaria in vitro de las subfracciones se incrementa con respecto a la fracción principal (F6) CI50 = 54.8 mg/mL, CI50 = 52 mg/mL en L. braziliensis y L. donovani respectivamente (Tabla 3).
Tabla 3. CI50 de las subfracciones expresados en µg/mL de F6 de la especie vegetal Unonopsis spectabilis contra promastigote de Leishmania in vitro
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Tabla 4. CI50 de las subfracciones de F7 de la especie vegetal Unonopsis spectabilis contra promastigote de Leishmania in vitro expresados en µg/mL
De la misma manera la fracción F7 fue subfraccionada en 7 subfracciones, cuya evaluación antiparasitaria nos revela que frente a L. amazonensis las fracciones disminuiyen la actividad; frente a L. braziliensis la actividad de las fracciones F7.1 (CI50 = 8 mg/mL), F7.2 y F7.3 (CI50 = 7.9 mg/mL), y F7.7 (CI50 = 44.3 mg/mL) se incrementan con respecto a la fracción principal (F7) (CI50= 50 mg/mL); frente a L. donovani en las fracciones F7.1 (CI50 = 8 mg/mL), F7.2 (CI50 = 7.8 mg/mL), F7.3 (CI50 = 7 mg/mL) y F7.7 actividad antiparasitaria con respecto a la (CI50 = 39.1 mg/mL), fue mayor la fracción principal (F7) (Tabla.4).
Evaluación de la actividad por el Método colorimétrico: Test de reducción de tetrazoilo (XTT-PMS)
Por este método fueron evaluados los extracto mas activo, así como las fracciones y subfracciones de la especie vegetal Unonopsis spectabilis observandose que frente a L. amazonensis (MHOM/BR/76/LTB-012); se observa que la actividad mejora a medida que se va fraccionando. Frente a L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), la actividad de las fracciones F6.2 (CI50 = 11.8 mg/mL), mejoró con respecto a la fracción (F6), las fracciones F7.1 (CI50 =11.7 mg/mL), F7.2 (CI50 = 10.9 mg/mL), y F7.3 (CI50 = 10.6 mg/mL), mejoro con respecto a la fracción principal (F7) (CI50= 49.34 mg/mL). (Tabla 5).
Tabla 5. CI50 del extracto activo de Unonopsis spectabilis, fracciones y subfracciones frente apromastigotes de Leishmania por el test de reducción de tetrazoilo (XTT- PMS) expresados enµg/mL.
PARTE EXPERIMENTAL
Colección del material vegetal
]]> El material vegetal se recolectó de la Reserva de Allpahuayo Mishana (73° 26′; 0.66′′ W 04°00′′; 175′′ S), Km 31.5 de la carretera Iquitos–Nauta en el Distrito de San Juan, Provincia de Maynas del Departamento de Loreto, Iquitos, Perú; en Junio del 2008, las cuales fueron depositadas y contrastadas en el Herbario de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana. (Tabla 6)Preparación de los extractos
El material vegetal seco y finamente pulverizado, de cada una de las especies, se sometió a procesos de extracción con diclorometano (CH2Cl2), Etanol (EtOH) y Agua (H2O) por separado, durante 48 horas a temperatura ambiente. Posteriormente fueron filtrados y el residuo obtenido se concentró a sequedad en Rota evaporador (Laborota 4000) acoplado a una bomba de vacío, a una temperatura de 40° C (90 rpm) obteniéndose de esta forma los extractos crudos libres de solventes orgánicos. El residuo vegetal (marco) del extracto de CH2Cl2, ha sido procesado con etanol a temperatura ambiente por 48 Hrs, posteriormente filtrado y concentrado a sequedad, obteniéndose el extracto etanólico EtOH (2); el residuo vegetal nuevamente fue sometido a cocción en agua durante 30 minutos, posteriormente filtrado, este liquido ha sido congelado a -45° C y liofilizado, consiguiéndose el extracto acuoso. Todo este proceso fue realizado en el Instituto de Investigación Fármaco Bioquímicas (IIFB) en el área de Fitoquímica.
ESTUDIOS BIOLÓGICOS
Evaluación de la actividad Leishmanicida por el método óptico: Conteo en cámara de Neubahuer
Formas promastigotes de Leishmania: L. donovani (MHOM/74/PP75), L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) y L. amazonensis (IFLA/BR/75/PH8), fueron cultivada a 26°C en medio Schneider drosophila (S-9895 Sigma-Aldrich) suplementado al 5% con suero bovino fetal (F-4135 Sigma-Aldrich) inactivado (56°C por 30 minutos), los parásitos en fase de crecimiento logarítmico fueron distribuidos en una microplaca de 96 pozos (Nunc) a una concentración de 1x106 parásitos/mL y cada pozo fue tratado con diferentes concentraciones (100, 50 y 25 µg/mL) de los extractos o fracciones durante 72 horas. El vehículo utilizado para la disolución de los extractos fue Dimetíl Sulfóxido (DMSO) (Sigma – Aldrich), en una concentración no superior al 1% (concentración no tóxica para los parásitos). La actividad se evaluó mediante conteo óptico en cámara de Neubauer a través de un microscopio (LEITZ-ARISTOPLAN) comparándose con los controles: parásitos sin tratar, parásitos tratados con la droga de referencia anfotericina B (A-2411 Sigma-Aldrich) y alcaloides totales obtenida de la corteza de la planta de Galipea Longiflora (Evanta) utilizada como droga control de un producto de origen natural. La prueba se realizó por triplicado6
Tabla 6. Plantas de la Amazonía Peruana y su uso tradicional
Evaluación de la actividad leishmanicida por el método colorimétrico: Test de reducción de tetrazoilo (XTT-PMS)
La actividad de los compuesto fue evaluada a través del método colorimétrico XTT (X-4251Sigma-Aldrich), que tienen como base la reducción de la sal de sodio 2,3-bis (2metoxi-4-nitro-5-sulfofeníl-2-h-tetrazolium-5 carboxanilide) por las deshidrohenasas mitocondriales hasta cristales de formazán, reacción que se acelera por la adición de un acoplador de electrones como la fenosina metosulfato (PMS) (P-5812 Sigma-Aldrich) el cual permite acelerar la reducción del sustrato. Formas promastigotes de L. amazonesis (MHOM/BR/76/LTB-012) y L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903), se evaluaron siguiendo la misma metodología descrita para el método óptico hasta su evaluación a las 72 horas. Pasado este tiempo se preparó una solución de XTT (1 mg/mL) / PMS (0.001 mg/mL), y se añadió 50 ml en cada pozo para luego incubar por 4 horas. Al término de la misma se dio lectura en un espectofotómetro de Elisa (Model 2100 serie-Plate Reader) a 450 nm. La prueba se realizó por triplicado. En cada modelo la CI50 del extracto fue determinada mediante análisis de regresión lineal (porcentaje de inhibición vs logaritmo de la concentración del extracto). Ambas pruebas se realizaron en el Laboratorio de Quimioterapia Experimental del Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas de la Universidad Mayor de San Andrés (La Paz - Bolivia).
]]> CONCLUSIONESDe las 8 especies vegetales evaluadas frente a promastigotes de Leishmania, la especie vegetal Unonopsis spectabilis es la mas activa con una CI50 de 65.3, 54.2, y 24.5 mg/mL frente a L. amazonensis, L. braziliensis y L. donovani respectivamente. Las sub-fracciones F6.2, F7.1, F7.2 y F7.3 con valores de CI50 mg/mL que van desde 7 a 9 ug/mL respectivamente resultó tener mayor actividad que la droga control (Pentamidina CI50 = 10 ug/mL) y mucho mejor que la corteza de alcaloides totales de (Evanta) (CAT) CI50 33 – 43.
RECONOCIMIENTOS
J. U. Rojas, J. R. Satalaya, agradecemos al Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas y a la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, de la UMSA, por habernos acogido en sus laboratorios y llevar adelante el presente trabajo, que nos permitirá obtener el grado de Químico Farmacéutico en la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana, de Iquitos, Perú. Así como también al Instituto de Investigaciones de la Amazonia Peruana.
REFERENCIAS
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