Método fluorométrico para identificar agentes naturales citotóxicos
y su aplicación en la evaluación de agentes
antiparasitarios selectivos

Fluorometric method for the identification of cytotoxic natural
agents and its application in the evaluation of
selective antiparasitic agents

Palma Tovar, Camila Isabel¹ Salamanca Capusiri, Efraín² Ticona Huallpara, Juan Carlos³
Udaeta Velásquez, Enrique⁴ Mita Díaz, Veronica⁵ Vela Ramirez, Catherine Elena⁶
Alacama Condori, Wara⁶ Ibaguari, Lucio⁷ Ibaguari, María⁷ Navi, Victoria⁷
Tito Avirari, Demetrio⁸ Serrato, Alsides⁹ Marupa, Natalio⁹
Chao, Benigno⁹ Giménez Turba, Alberto*^10
1Licenciada en Bioquímica, Maestrante de la Maestría en Ciencias Biológicas y Biomédicas en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas. e-mail: camila.i.palma.t@gmail.com
²Master of Science. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas. e-mail: efrain_salamanca@hotmail.com
³Philosophy Doctor. Instituto de Investigaciones Fármaco e-mail: biojuancarlos@yahoo.com
⁴Licenciado en Bioquímica y Farmacia. Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas. e-mail: udaepuma@gmail.com ]]> ⁵Estudiante de Internado Rotatorio. Carrera Química Farmacéutica. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas.
⁶Estudiantes de 1er año Carrera de Bioquímica. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas.
⁷Comunarios de San Silvestre, Provincia Abel Iturralde. Médicos tradicionales.
⁸Comunario de San Miguel, Provincia Abel Iturralde. Médico tradicional
⁹Comunarios de Buena Vista, Provincia Abel Iturralde. Médicos tradicionales.
*¹⁰Philosophy Doctor. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas. e-mail: agimenez@megalink.com
Fecha de recepción: 13 febrero de 2019, Fecha de aceptación: 16 de abril de 2019

Resumen

Los laboratorios dedicados al descubrimiento de moléculas naturales con actividad antiparasitaria, tienen el desafío de desarrollar protocolos que permitan detectar biomoléculas selectivas, efectivas y menos tóxicas que las disponibles. Por ende, las evaluaciones antiparasitarias in vitro (CI₅₀), deberían ir acompañadas de evaluaciones de citotoxicidad (DL₅₀), con el fin de calcular un Índice de Selectividad (IS=DL₅₀ / Cl₅₀ como parámetro de especificidad biológica. La citotoxicidad fue medida sobre líneas de macrófagos (RAW 264.7, murino), células involucradas en las infecciones por parásitos intracelulares. El protocolo fluorométrico parte con una población de 5x10⁴ células/ mL, incubada a 37°C en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's médium), por 96 horas, con adición de resazurina (2mM) 3 horas antes de las lecturas finales. Bajo estas condiciones se evaluó la citotoxicidad de drogas control y 15 extractos vegetales seleccionados por su actividad anti-kinetoplastida. El extracto de Cosmailu fue el más citotóxi-co, Ejije bid'u resultó selectivo para T. cruzi y Leishmania amazonensis, mientras que Id'ene eidhue, fue selectivo para L. amazonensis. Finalmente, los otros 12 extractos resultaron ser poco selectivos o citotóxicos.

Palabras clave: Trypanosoma cruzi, Leishmania amazonensis, Células RAW 264.7, Cultura Tacana, Método Fluorométrico Resazurina, Indice de Selectividad.

Abstract

The Ministry of Health has infectious diseases as one of the research priorities, including leishmaniasis and American try-panosomiasis. The Faculty of Pharmaceuti-cal and Biochemical Sciences develops eval-uations of medicinal plant species used by the Tacana culture as a source of potential antiparasitic agents.

Laboratories dedicated to the discovery of natural molecules with antiparasitic ac-tivity, have the challenge of developing pro-tocols that allow the detection of selective, effective and less toxic biomolecules than those available. Therefore, in vitro antipar-asitic evaluations (IC₅₀) should be accompa-nied by cytotoxicity evaluations (LD₅₀), in order to calculate a Selectivity Index (IS = LD₅₀ / IC₅₀) as a parameter of biological specificity. The cytotoxicity was measured on mac-rophage line (RAW 264.7, murine), cells en-gaged on intracellular parasites infections. The fluorometric protocol starts with an ini-tial population of 5x10⁴cells/mL, incubated at 37°C, in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) for 96 hours with addition of resazurin (2mM) 3 hours, before final read-ings. Under these conditions the cytotoxicity of control drugs and 15 plant extracts, se-lected by their anti-kinetoplastid activity, was evaluated. Cosumailu extract was the most cytotoxic, Ejije bid'u was selective for T. cruzi, and Leishmania amazonensis, while Id'ene eidhue, was selective for L. amazonensis. Finally, the other 12 extracts were lit-tle selective or cytotoxic.

Keywords: Trypanosoma cruzi, Leishmania amazonensis, RAW 264.7 cells, Tacana culture, Resazurin Fluorometric Method, Selectivity Index.

INTRODUCCIÓN

El benznidazol y el nifurtimox son agentes antiparasitarios empleados en el tratamiento de la enfermedad de Chagas, mientras que el glucantime y la anfotericina B son utilizados en el tratamiento de las leishmaniasis. Los efectos adversos, de todas estas drogas, denotan la necesidad de encontrar agentes antiparasitarios menos tóxicos (WHO, 1995). La medicina tradicional es una base interesante en la búsqueda de nuevos tratamientos, ya que las plantas son fuente de moléculas bioactivas, que podrían servir de base para el desarrollo de nuevos tratamientos antiparasitarios. La etnia Tacana, ubicada al norte del Departamento de La Paz, cuenta con centenares de especies vegetales documentadas que se utilizan para el tratamiento de diferentes dolencias, por lo que el Área de Química Farmacéutica del Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas se ha interesado en valorar su medicina tradicional, con el propósito de buscar agentes antiparasitarios eficaces y selectivos.

Históricamente, el inicio del proceso de descubrimiento de fármacos se concentra en reconocer la efectividad in vitro y/o in vivo de las drogas candi-datas, utilizando como parámetro el valor estimado de la Concentración Inhibitoria Máxima Media (CI₅₀), que indica la cantidad de una sustancia necesaria para inhibir un proceso biológico a la mitad (Aykul et al., 2016). Al mismo tiempo, la seguridad de las drogas es un criterio clave para el desarrollo de nuevos tratamientos. Las observaciones que se logran obtener en ensayos de eficacia y seguridad, in vitro, se encuentran en los primeros pasos de desarrollo de un fármaco y sirven para justificar y ahondar en mediciones de seguridad y eficiencia en modelos más próximos al desarrollo, de estas complejas enfermedades parasitarias (Muller et al., 2012).

Las células RAW 264.7 son macrófagos murinos transformados con el virus Abelson de leucemia murina (ATCC, 2017) y suelen ser utilizados para estudios de citotoxicidad (Habtemariam, 1997) y para evaluar el efecto, de productos naturales, en la producción de citosinas y mediadores inflamatorios (Kolodziej et al., 2005). La citotoxicidad in vitro se mide por medio de ensayos de proliferación como el método fluorométrico con resazurina, un compuesto azul no tóxico y no fluorescente, que es reducido a un colorante rojo fluorescente, llamado resofurina, debido a la transferencia electrónica mediada por enzimas mitocondriales, en todas las células vivas. La detección de esta reacción se realiza empleando un lector de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 530 a 560 nm y una lectura de emisión a 590 nm longitud de onda. La reducción de la resazurina se correlaciona con el número de organismos vivos con actividad metabólica. Es un ensayo rápido, confiable, sensible, seguro y económico (Biotium: Glowing Products for Science, 2015; Carneiro-Borra et al., 2009). El contar con datos de dosis letal media frente a células (DL₅₀) y datos de Inhibición media frente a parásitos (IC₅₀), permite calcular el Índice de Selectividad (IS), herramienta matemática utilizada para identificar compuestos que son tóxicos para los parásitos pero no para las células huésped, en infecciones intracelulares (leishmaniasis y el mal de Cha-gas), en una etapa temprana del complejo proceso de selección de candidatos para el descubrimiento de nuevos fármacos (WHO, 2015).

En este trabajo se seleccionaron extractos de plantas medicinales de la cultura tacana que previamente presentaron diversos niveles de actividad biológica (IC₅₀) frente a parásitos de Leishmania amazonensis y Trypanosoma cruzi, para evaluar su citotoxicidad, frente a células RAW 264.7, utilizando el método fluorométrico de la resazurina, con el fin de calcular sus respectivos Índices de Selectividad.

MATERIALES Y MÉTODO

Materiales y equipos

Cabina de Seguridad Biológica (SECURIPLUS PSM Classe II, Francia); Centrifuga (Jouan CR3i, Thermo FisherScientific, USA); Estufa (Midi 40 CO₂ Incubator, Thermo Fisher Scientific, USA); Frascos de Cultivo Tisular de 50mL (25cm², Fisher Scientific, USA); Lector de Microplacas (BioTek Synergy HT: Multi-Mode Microplate Reader, USA. software Gen 5 versión 2.09); Microscopio de Fluorescencia (EVOS FL Cell Imaging System, Life Technologies, USA); Microscopio Óptico (Leitz Aristoplan, Alemania); Microscopio Óptico Invertido (Axiovert 25, Zeiss, Alemania) y Placas de 96 Pozos, Fondo Plano (Thermo Scientific, USA).

Reactivos

Drogas control y extractos vegetales (concentraciones de evaluación)

Alcaloides totales de la corteza de Galipea longiflora Krause (CAT, 50.0-6.3μg/mL) y 2-fenilquinolina (2FQ, 100.0-12.6μg/mL) (Giménez et al., 2005); Anfotericina-B (Cipla Ltd, Goa, India, AmB, 50.0-6.2μg/mL); Benznidazol (La-fepe, Brasil, Benz, 400.0-50.0μg/mL); Doxorrubicina Clorhidrato (Doxocris ®, LKM Bolivia S.A, donada por Ricardo Amaru-Unidad de Biología Celular-Fa-cultad Medicina-UMSA, Dox, 1.5-0.2μg/mL); Miltefosina (Impavido®, Paladin, Canadá, 50.0-6.2μvg/mL); Nifurtimox (Lampit ® Bayer, Alemania, 50.0-6.2μg/ mL). Extractos de platas medicinales en DMSO (100-0.8μg/mL).

Material biológico

Células RAW 264.7 (Donadas por el Instituto Sahlgrenska, Universidad de Gotemburgo, Suecia) fueron cultivadas en frascos de cultivo (50mL), a 37°C, 5% de CO₂ y 100% de humedad en 3mL de Medio DMEM completo (17.3g/L de DMEM, 110.0mg/L de Piruvato de Sodio, 1.5g/L de NaHCO₃, 1%v/v de Penicilina-Estreptomicina, pH 7.4, 10%v/v de SBF desactivado por calor) (ATCC, 2017); Medio DMEM sin piruvato (17.3g/L de DMEM, 1.5g/L de NaH-CO₃, 1%v/v de Penicilina-Estreptomicina, pH 7.4, 10%v/v de SBF desactivado por calor) y Medio RPMI (60.0mg/L de Gentamicina, 2.13g/L de NaHCO₃, 15.89g/L de RPMI 1640-HEPES, pH 7.4, 10%v/v de SBF desactivado por calor). El cambio de medio se realizó cada 72hrs previo desprendimiento mecánico.

Curva de crecimiento

El pellet de células, RAW 264.7, obtenido de la suspensión celular centrifugada (2000rpm, 10min), fue resuspendido en el medio de cultivo correspondiente (2mL): DMEM completo, DMEM sin piruvato y RPMI. Se realizó el recuento en cámara de Neubauer, para ajustar la población a 2x10⁴ células/mL (con los medios correspondientes) y 10%v/v de SBF. Se incubó como indicado y se realizaron lecturas diarias por 5 días, para el trazo de las curvas. El procedimiento se realizó por triplicado en tres repeticiones y la media se graficó.

Elección de población óptima de trabajo y tiempo de revelado

Poblaciones ajustadas a: 1.25x10⁴; 2.5x10⁴; 5.0x10⁴; 1.0x10⁵ y 2.0x10⁵ célu-las/mL, fueron incubadas por 96hrs a 37°C, con 5% de CO₂ y 100% de humedad. Luego de la adición del reactivo revelador (resazurina) se realizó la lectura del incremento de población (540nm excitación y 590nm emisión) cada hora durante 5 horas. El procedimiento se realizó por triplicado en tres repeticiones y la media se graficó.

Material vegetal y obtención de extractos crudos

Evaluación de citotoxicidad sobre RAW 264.7

En una placa de cultivo de 96 pozos, los pozos de la periferie fueron llenados con 200µL de agua destilada autoclavada. En cada uno de los pozos restantes se dispensaron 100µL de células (5x10⁴ celulas/mL). A las 24hrs de incubación se añadieron 100µL por pozo de las diferentes concentraciones de drogas control, controles naturales y muestras. Los pozos "Blanco"y el "Control Positivo de Crecimiento" contenían 200µL de medio de cultivo y 200µL de células respectivamente. Se incubó como indicado por 72hrs. Cada muestra fue evaluada por triplicado, obteniendo un valor promedio y desviación estándar.

Obtención de DL₅₀

Para el revelado, se empleó resazurina (2mM) disuelta en PBS (2.86g/L de Na₂HPO₄, 0.31g/L de NaH₂PO₄, pH 7.4) y depositada en la placa (10µL/pozo). Tras 3hrs de incubación se realizó la lectura de fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 540nm y una longitud de onda de emisión de 590nm en el programa Gen5 (Promega, 2016). Los valores de fluorescencia fueron transformados en porcentaje de inhibición, donde el 100% correspondía a la absorbancia del "Blanco". La conversión del porcentaje de inhibición a su correspondiente valor de CI₅₀ se realizó en Microsoft Excel por función de tendencia lineal (y=porcentaje de inhibición; x=concentración en µg/mL).

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Curva de crecimiento

El medio DMEM completo resultó ser el mejor para el cultivo de células RAW 264.7, ya que su coeficiente de correlación lineal R² (0.9074) resultó ser el más elevado de los tres medios evaluados (Gráfico N°1). En este medio de cultivo, la fluorescencia fue aumentando día a día, demostrando la actividad metabólica de las células. El día 4 la población celular se duplicó, lo que indica que es el momento ideal para realizar la medida de DL₅₀. El medio RPMI permitió el crecimiento de las células RAW 264.7, pero podría considerarse que la fase de adaptación (lag) dura un día más que con el DMEM completo. Finalmente, el medio DMEM sin piruvato no dio lugar a un crecimiento exponencial, a lo largo del experimento.

En condiciones aeróbicas, el piruvato formado en el último paso de la glicólisis se oxida a acetil-CoA, por la PDH (piruvato deshidrogenasa) que en el ciclo del ácido cítrico, se oxida a CO₂ y H₂O y el equilibrio redox se reestablece tras la transferencia de electrones del NADH+ al O₂ durante la respiración mitocondrial. La acetil-CoA puede modular negativamente la PDH, inhibiendo el ciclo del ácido cítrico y promoviendo la gluconeogénesis por modulación positiva de la piruvato carboxilasa. El piruvato participa en reacciones anapleróticas que reponen intermediarios del ciclo del ácido cítrico (malato y oxalacetato), lo cual sostiene la actividad de este ciclo (Heart et al., 2009). Por estas razones metabólicas es que el piruvato es necesario para el crecimiento de las células en estudio.

Elección de población óptima de trabajo y tiempo de revelado

Los valores de coeficiente de correlación lineal demuestran que las poblaciones 1x10⁵ y 5x10⁴ tuvieron el comportamiento más lineal en medio DMEM completo (Tabla N°1 y Gráfico N°2). Con 5x10⁴ de población se obtuvieron valores de fluorescencia equivalentes a más del doble del blanco, a las 3 horas de incubación con resazurina, lo cual se considera suficiente para ser detec-table respecto al blanco. Se recomienda no realizar la lectura más allá de las 3 horas, ya que la fluorescencia del blanco va disminuyendo pasadas las 4 horas.

Los resultados de la puesta a punto del método fluorométrico de la resazurina para RAW 264.7, nos muestran que lo ideal es trabajar dentro de los primeros 5 días, tiempo en el cual las células mantienen el crecimiento logarítmico, sembrando una población inicial de 5x10⁴ células (día 0) e incubar por 24 horas antes de añadir las muestras a evaluar (día 1), continuar con la incubación por 72 horas y revelar con resazurina (día 4) incubando por 3 horas adicionales

Evaluación de la citotoxicidad

Un total de 15 extractos de plantas medicinales utilizadas por la etnia Tacana fueron seleccionados y sometidos a evaluaciones de citotoxicidad por el método fluorométrico. Entre éstas, 11 presentaron actividad anti-kineto-plastidos (T. cruzi y L. amazonensis), 1 extracto activo sobre T. cruzi, 1 extracto con actividad leishmanicida, y 2 extractos sin actividad antiparasitaria (Programa UMSA-ASDI, 2019). De los 15 extractos evaluados, un total de 3 (Ejije bid'u, Id'ene eidhue y Kuabadhu) presentaron actividad selectiva, mientras que los 12 restantes fueron no selectivos y/o citotóxicos, siendo el más cito-tóxico el extracto de Cosumailo.

Ejije bid'u (DL₅₀ = 65.5±25.3, CI₅₀ T.cruzi = 9.1±1.5, CI₅₀ Lma = 16.9±2.4ug/ mL, TIS=7.6 y LIS=4.3) e Id'ene eidhue (DL₅₀ = 14.7±5.3, CI₅₀ T. cruzi = 10.8±1.1, CI₅₀ Lma = 10.4±0.2ug/mL, TIS=1.4 y LIS=1.4), fueron activos frente a los dos parásitos con valores de IS iguales o superiores a la droga control 2FQ. Sin embrago el último extracto (Id'ene eidhue) presentó un valor de TIS inferior al control natural 2FQ (TIS = 2.9), por lo que solo pudo ser considerado como leishmanicida selectivo con un valor de LIS igual al de la 2FQ (LIS = 1.4). El extracto de Ejije bid'u fue el único considerado como anti-kineto-plástido selectivo, aunque nueve veces menos activo que el Nifurtimox (CI₅₀ T. cruzi = 1.2±0.7ug/mL), presentó un TIS similar a este (TIS=7.7), fue casi dos veces más leishmanicida que CAT (Lma = 29.1±9.0ug/mL) y presentó un valor de LIS casi el doble que el de la Miltefosina (LIS=2.5).

El método fluorométrico de la resazurina nos permitió identificar productos naturales con actividad trypanocida y leishmanicida selectiva y disminuyó drásticamente, el número inicial de extractos con actividad antiparasitaria, demostrando las dificultades de encontrar, en el laboratorio, productos naturales eficaces y seguros, que permitan la obtención y desarrollo de nuevos agentes antiparasitarios. Al mismo tiempo, este nuevo protocolo nos permite ampliar el conocimiento sobre los metabolitos secundarios que hacen a nuestra biodiversidad facilitando la selección de especies con actividad citotóxica.

AGRADECIMIENTOS

A los proyectos UMSA-ASDI: Bioprospección Tacana y Biomoléculas de Interés Medicinal e Industrial (75000553), por el apoyo financiero. Al CIPTA y CIMTA, por la planificación de los trabajos de campo en las comunidades Tacana. Al Instituto Sahlgrenska-Universidad de Gotemburgo-Suecia, por la donación de las células RAW 264.7. Uno de los co-autores (PTCI), fue becaria de Maestría del programa de fortalecimiento institucional UMSA-ASDI.

REFERENCIAS

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