Actividad antifúngica in vitro del extracto crudo diluido del veneno de escorpión
Hadruroides charcasus (Karsch 1879) frente a Candida albicans
In vitro antifungal activity of the diluted crude extract of the scorpion venom
Hadruroides charcasus (Karsch 1879) against Candida albicans
Rivera-Coronado Nileth Daysy1, Pérez-Delgado Orlando2*
]]> Universidad Señor de Sipán. Facultad de Ciencias de la Salud. Escuela de Estomatología.rcoronadodaysy@crece.uss.edu.pe
2Universidad Católica Santo Toribio de Mogrovejo. Facultad de Medicina. Laboratorio de Microbiología.
Av. San Josemaría Escrivá de Balaguer 855. Chiclayo-Perú. Dirección postal: 14001. Cel.+51985718100
*Dirección de contacto: Orlando Pérez-Delgado
Universidad Católica Santo Toribio de Mogrovejo. Facultad de Medicina. Laboratorio de Microbiología.
Av. San Josemaría Escrivá de Balaguer 855. Chiclayo-Perú. Dirección postal: 14001. Cel.+51985718100
E-mail address: operezd@gmail.com
Historial del artículo.
]]> Recibido febrero 2019.
Resumen
El objetivo fue evaluar la actividad antifúngica in vitro del extracto crudo diluido del veneno de escorpión Hadruroides charcasus (Karsch 1879) frente a Candida albicans. Fue un estudio experimental, se emplearon 54 unidades experimentales (9 concentraciones de veneno, 2 cepas y tres repeticiones). Por estimulación eléctrica se obtuvo el veneno del escorpión. El método de dilución doble seriada se determinaron las diferentes concentraciones de 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.56%, 0.78%, 0.39%. Para evaluar la actividad antifúngica se empleó el método de microdilución para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). Los resultados demostraron que mediante el método de microdilución que para la cepa n°1 presentó una concentración mínima inhibitoria (CMI) al 25 % del veneno crudo diluido, muy distinto fue para la cepa n° 2 no presentó CMI. Se llegó a la conclusión que los hallazgos del estudio actual demuestran que el extracto crudo diluido del veneno del escorpión H charcasus posee actividad antifúngica sobre cepas de C. albicans, siendo posible utilizar como plantilla para el diseño y desarrollo de nuevos fármacos antifúngicos.
Palabras clave: Hadruroides charcasus, Candida albicans, antifúngico, veneno de escorpión.
Abstract
]]> The objective was to evalúate the in vitro antifungal activity of the diluted crude extract of the scorpion venom Hadruroides charcasus (Karsch 1879) against Candida albicans. It was an experimental study, 54 experimental units were used (9 poison concentrations, 2 strains and three repetitions). The venom of the scorpion was obtained by electrical stimulation. The double serial dilution method was determined at different concentrations of 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.56%, 0.78%, 0.39%. To evalúate the antifungal activity, the microdilution method was used to determine the Mínimum Inhibitory Concentration (MIC). The results showed that by means of the microdilution method that for the strain n ° 1 presented a mínimum inhibitory concentration (MIC) to 25% of the diluted raw venom, very different was for the strain n ° 2 did not present CMI. It was concluded that the fmdings of the current study show that the diluted crude extract of the scorpion venom H. charcasus possesses antifungal activity on strains of C. albicans, being possible to use it as a témplate for the design and development of new antifungal drugs.Key words: Hadruroides charcasus, Candida albicans, antifungal, scorpion venom.
Introducción
En los últimos años hay mayor reconocimiento del importante rol que desempeñan las interacciones entre los reinos, particularmente, entre hongos y bacterias, en la cavidad oral, particularmente Candida albicans, se encuentran entre los hongos más importantes que colonizan la cavidad oral de los seres humanos, habiéndose reportado su participación en estos complejos biofilms orales microbianos.1
Según reportes, existe una capacidad de colonización oral por C. albicans (COCA) en pacientes con prótesis, que en los que no lo usan, también se ha señalado un mayor riesgo de COCA personas de edades mayores y uso de prótesis completas.2 Por lo tanto, los usuarios de prótesis requieren cuidado permanente en términos de higiene, adaptación, sustitución, estas actitudes promueven la salud oral y la calidad de vida de los usuarios, reduciendo la incidencia de infecciones por Candida3
Además se ha determinado una asociación estadísticamente significativa entre aislamientos de levaduras de C. albicans y el uso de prótesis dental (p<0.05, OR=4.3), teniendo como manifestaciones clínicas la candidiasis oral4, inclusive asociado a la mala higiene de las dentaduras postizas, teniendo como consecuencia una estomatitis protésica5, consecuencia debida a la levadura, que tiene capacidad de adherirse a la mucosa oral, base de la prótesis, así como la formación de biofilms, su virulencia es apoyada especialmente por el estado de resistencia de este micoorganismo.6 De ahí, C. albicans sigue siendo una de las causas principales de candidiasis invasiva en la mayoría de los entornos clínicos, sobre todo el impacto de resistencia a medicamentos antifúngicos, esencialmente el tratamiento eficaz de pacientes infectados con Candida.7
Por otro lado, diversos experimentos han demostrado que el veneno del escorpión posee una amplia actividad antimicrobiana in vitro frente a diferentes cepas de importancia clínica, como lo reportado del escorpión africano dorado Scorpio maurus palmatus, posee actividad frente a bacterias Gram positivas, Gram negativas, incluso C. albicnas8, asimismo, se han aislado péptidos tales como AamPl y AamP2 del escorpión Androctonus amoreuxf y los péptidos TsAP-1 y TsAP-2 del veneno Tityus serrulatus10 con actividad antifúngica frente a C. albicans al igual el veneno del escorpión brazilero Tityus stigmurus11 y de los escorpiones mexicanos Vaejovis punctatus y Vaejovis mexicanus smithil12,13 presentan una amplia actividad antimicrobiana a bajas concentraciones, inclusive péptidos como la Parabu-toporina del escorpión Parabuthus schlechteri y el péptido Opistoporina 1 de Opistophtalmus carinatus con capacidad de inhibir el crecimiento de Neurospora crassa, Botrytis cinérea y Fusarium culmorum, y la levadura Saccharomyces cerevisiae.14
Las glándulas venenosas de los escorpiones contienen una amplia gama de moléculas biológicas activas como enzimas, lípidos, nucleótidos, aminas biogénicas, como otras moléculas desconocidas, además contienen una gran variedad de diversos péptidos con actividades biológicas, clasificándose en dos grupos principales: los péptidos de puente disulfuro (DBP) que bloquean los canales iónicos, como los canales de K+, Cl-, Ca+2 y Na+ y los péptidos unidos por puente sobre el disulfuro (NDBP), un grupo menos abundante que los primeros, han ganado interés reciente, representan una amplia gama de actividades biológicas como el anticancerígeno potenciador de bradiquinina, actividades antiinflamatorias, inmunomoduladoras y antimicrobianas.15
]]> Por tal motivo el presente estudio tuvo como objetivo evaluar la actividad antifúngica in vitro del extracto crudo diluido del veneno de escorpión Hadruroides charcasus (Karsch 1879) frente a C. albicans.
Materiales y métodos
Obtención del veneno. Escorpiones de la especie H. charcasus (Fig. 1 A,B) de ambos sexos (23 hembras, 17 machos), fueron colectados en cerros aledaños del distrito de Chongoyape, provincia de Chiclayo, Departamento de Lambayeque, las especies fueron mantenidos en el laboratorio en frascos de plástico y alimentados con Acheta domesticus (grillos). Para su identificación se empleó la clave para géneros de escorpiones peruanos16, con orientación para la identificación de la especie y el sexo fue realizado por el Dr. José Ochoa Cámara, taxónomo y docente de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco.
El veneno se obtuvo por estimulación eléctrica de cada uno de los escorpiones (10 a 15 µL por espécimen), sobre la parte dorsal y en la glándula productora de veneno17, utilizando un impulso de 23 voltios (Fig. 1 C,D). Se obtuvo un pool de veneno (400 µL) y posteriormente diluida con agua desionizada estéril en proporción 1:1, se centrifugó a 6000 rpm durante 5 min, el pellet fue resolubilizado con agua desionizada, las fracciones solubles fueron almacenas en un pool a -20 °C.
Preparación del agente antifúngico a partir del veneno crudo. La preparación del agente antifúngico, el pool de veneno crudo soluble fue filtrado a través de una membrana Millipore de 0.22 µm, luego se realizaron ocho diluciones doble seriadas18 totalizando nueve concentraciones diferentes de 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.56%, 0.78%, 0.39%.
Preparación del inoculo de Candida albicans. Se emplearon dos cepas proporcionadas del Laboratorio de Micología de un Hospital la región Lambayeque, Chiclayo, Perú, se preparó una suspensión de C. albicans, se tomaron 5 Unidades Formadores de Colonia (UFC) 
1 mm de diámetro procedente de cultivo agar dextrosa Sabouraud (ADS), de 24 h, CLSI18. Se suspendieron en 5 mL de caldo Sabouraud y con ayuda del espectrofotómetro (Spectrop-hotometer UNICO™ UV/VIS λ 625 nm) se ajustó a una densidad óptica de 0.12 equivalente a la turbidez del tubo N° 0.5 de la escala de Me Farland equivalente a una concentración aproximadamente de 1-5x106 UFC/mL, Posteriormente se realizó una dilución 1:1000 con caldo Sabouraud glucosado, obteniéndose una concentración de 1-5x103. Esta última, es la que se empleó para sembrar en las mi-croplacas de 96 pocillos.19
Actividad antiíúngica del veneno frente a Candida albicans. Para la determinación de la actividad antifúngica se empleó el método de microdilución para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI)18, se realizaron ensayos por triplicado sembrando 50µL del inoculo en cada pocilio, luego se repartieron 50 µL de cada dilución del veneno en cada pocilio de la microplaca, después se incubaron las microplacas a 35 °C durante 24 h. De acuerdo a orientaciones del CLSI18, los controles positivos se hicieron con el caldo más inoculo, y los controles negativos con sólo caldo. El crecimiento del control positivo se determinó por un botón de crecimiento de 2 mm o una turbidez definida.
Para la visualización de los botones de crecimiento se empleó del microscopio LEICA DM500 y luego se realizó la medición a través del software LAS EZLEICA 3.0.0.
]]> Para determinar la relación de la actividad antifúngica del veneno de escorpión H. charcasus en el crecimiento de fúngico de C. albicans, se realizó un análisis de varianza20 (ANOVA) con un nivel de significación de P < 0.05.
Resultados
De las 9 concentraciones evaluadas se observa que la de 100 %, 50 % y 25 % no presentaron botones de crecimiento para la cepa n° 1 y para la cepa n° 2, la actividad fue diferente, las concentraciones evaluadas no presentaron inhibición total del crecimiento de C. albicans.
En la figura 2 y 3, mediante el método de microdilución se observa que para la cepa n°1 presentó una CMI al 25 % del veneno crudo diluido, muy distinto fue para la cepa n° 2 no presentó CMI, pero tomando como referencia el botón de crecimiento del control positivo, se observa que disminuye su actividad antifúngico conforme disminuye las concentraciones del veneno.
Discusión
C. albicans, un organismo fúngico oportunista detectado con frecuencia en cavidad oral de niños con caries severas en primera infancia, puede presentar evolución aguda o crónica dependiendo de factores predisponentes, como estomatitis protética, queilitis angular, glositis romboidal y lengua vellosa.21,22 Aunque las opciones de tratamiento son un problema importante sobre todo por la toxicidad de los antifúngicos al hospedero y la resistencia que pueden ofrecer los microorganismos, frente a ello ha surgido el interés por la búsqueda de principios bioactivos a partir del veneno de arácnidos que ofrezcan mayor capacidad antimicrobiana, en la actualidad se tiene resultados que el veneno de escorpión contiene péptidos que exhiben propiedades antimicrobianas y que además puede retardar la propagación de células cancerosas.23,24 El veneno de escorpión H. charcasus perteneciente a la familia Caraboctonidae16, una de las especies de escorpiones que habitan en el norte del Perú.
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Nuestros resultados revelan que el veneno de escorpión de la especie H. charcasus presentó actividad antifúngica in vitro independientemente de las dos cepas evaluadas, (cepas clínicas proporcionadas de un Hospital de la región Lambayeque) que en concordancia con otras especies de escorpiones árabes como A. amoreuxf, Leiurus quinquestriatus25 e incluso con actividad frente a C. tropicalis para el caso del escorpión Pandinus imperator26
Estudios sobre la composición química del veneno de H. charcasus han señalado una mezcla de proteínas de diferente peso molecular, entre ellas péptidos en un rango de peso de 7-9.1 kDa.26-28
Existen escasos estudios que manifiesten sobre la actividad antifúngica de los péptidos contra las especies de Candida, pero se cree que el mecanismo de acción es similar a los péptidos antibacterianos, de poseer aminoácidos básicos y tener carga positiva favorecerían la interacción péptido membrana, es esencial en la actividad antifúngica de estos péptidos.29
Por tal motivo buscando corroborar la actividad antifúngica del veneno crudo diluido del escorpión H. charcasus, en el presente estudio mediante el método de microdilución, mostró una CMI del veneno crudo diluido y para la otra cepa no presentó una inhibición total del crecimiento, la posible razón detrás de esto, podría deberse a la inestabilidad de los péptidos presentes el veneno crudo diluido después de su obtención, tal como sucede con el péptido antimicrobiano Vejovina del veneno de Vaejovis mexicanus después del ordeño origina un péptido más corto y así disminuyendo su actividad antimicrobiana30 o por otro lado el caso del péptido Estigmurina del veneno del escorpión Tityus stigmurus, considerando que la hidrofobicidad del péptido, junto con una carga neta positiva en una disposición anfipática, se considera un requisito importante para su actividad antimicrobiana31, con esto se pone de evidencia su capacidad inhibitoria, que es coincidente con venenos de escorpión de otras especies y que sin embargo trabajaron con los componentes purificados, que también reportan tener actividad antifúngica como el caso de veneno del escorpión Chaerilus tricostatus con el péptido Ctriporina con actividad frente a C. albicans32
El veneno de los escorpiones posee componentes bioactivos frente a diferentes microorganismos (protozoarios, bacterias, hongos), además en estudios recientes han reportado su composición química como péptidos, la mayoría no presentan puentes disulfuro, son catiónicos y exhiben una gran actividad antimicrobiana de amplio espectro contra diferentes bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, además están compuestos por aminoácidos hidrofóbicos y adicionalmente, presentan residuos catiónicos que incrementan la permeabilidad de la membranas de microorganismos gram-positivos33, así como también se manifiesta su acción frente a los hongos, algunos de estos péptidos muestran un gran alternativa para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos (antibióticos o antifúngicos) contra las infecciones de superbacterias u hongos resistentes a antimicrobianos convencionales.12,26,34,35
Conflictos de intereses
Los autores declaramos no presentar conflictos de interés potenciales con respecto a la investigación, autoría y/o publicación de este artículo.
]]> Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad Señor de Sipán, Facultad de Ciencias de la Salud, por el apoyo técnico, científico y logístico realizado a la presente investigación.
Aspectos éticos
La aprobación de la investigación por el Comité de Ética, Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Señor de Sipán, (Chiclayo, Perú) y siguió las pautas establecidas para este comité.
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