Revisión de la Caracterización de Aeromonas spp.
Y su Importancia clínica

ABSTRACT

Advances in Microbiology and applications of Molecular Biology, has been achieved an improvement, complementary to the classical techniques of bacterial identification, this also allowed the discovery or regrouping of bacterial genera and species, which had failed to be identified correctly, by biochemical and phenotypic methods, since these have some limitations such as false positives or low specificity. Among the molecular tools used to identify the Aeromonas genus, we have used sequencing from 16S rRNA gene, maintenance genes such as rpoD or gyrB, which have a greater discrimination power than the 16S rRNA gene, the technique of RFLP-PCR and more recently the technique of Mass Spectrometry has been increased by Laser Assisted Matrix Desorption-Ionization of Flight Time (MALDI-TOF MS) which is able to identify species of Aeromonas quickly and accurately. This is important because of the increasing evidence that these species are widely distributed in the environment and can cause a variety of infections in animals and humans.

Keywords: Aeromonas, Methods, Molecular, Gene, Specificity.

RESUMEN

Los recientes avances en Microbiología y la aplicación de la Biología Molecular, han logrado un mejoramiento, complementario para las técnicas clásicas de identificación bacteriana, también esto, ha permitido el descubrimiento o reagrupamiento de géneros y especies bacterianas, las cuales no habían logrado ser identificadas correctamente, por métodos bioquímicos y fenotípicos, ya que estos, presentan algunas limitaciones como falsos positivos o baja especificidad. Dentro de las herramientas moleculares empleadas para la identificación del género Aeromonas, se han empleado la secuenciación a partir de gen 16S de rRNA, genes de mantenimiento como rpoD o gyrB, los cuales poseen mayor poder de discriminación que el gen 16S de rRNA, la técnica de RFLP-PCR y más recientemente se ha incorporado el uso de la técnica de Espectrofotometría de Masas por Matriz Asistida por laser Desorción-Ionización de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF MS), la cual es capaz de identificar especies de Aeromonas de forma precisa y rápidamente. Lo cual es de gran importancia, debido al incremento de evidencias que indican que estas especies se encuentran ampliamente distribuidas en el ambiente y que pueden causar una variedad de infecciones en animales y en el humano.

INTRODUCCIÓN

Aeromonas es una bacteria ubicua principalmente en ambientes acuáticos y está considerado dentro de los patógenos emergentes a nivel mundial, asociándose a cuadros infecciosos, existen reportes de aislados provenientes de pacientes con  infecciones gastrointestinales y de infecciones de la piel [1]. La transmisión de la bacteria ocurre por consumo de pescado, mariscos y agua [4]. En algunos estudios señalan que las especies más involucradas en procesos infecciosos son: Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae y Aeromonas veronii bv. Sobria [18]. El género Aeromonas, fue observado por primera vez en 1890 y propuesta en la década de 1980 como un agente enteropatógeno. En el Manual de Bacteriología Determinativa de Bergey Aeromonas spp está clasificado como miembro de la familia Vibrionaceae, hasta el 2008 el género incluía 20 especies [9,30-32]. Debido al desarrollo de técnicas de mayor sensibilidad y más eficaces, como las moleculares, se ha logrado el aislamiento e identificación de diversos microorganismos que por métodos microbiológicos y bioquímicos no podían ser identificados [9]. Las técnicas moleculares han permitido una correcta caracterización del genero de Aeromonas, la amplificación del gen 16S rRNA presenta baja discriminación inter-específica, por lo que se ha recurrido a genes de mantenimiento como gyrB o rpoD que presentan una tasa de sustituciones sinónimas mayor que el 16S rRNA [15,36]. Los genes de mantenimiento antes mencionados, han presentado una alta capacidad para diferenciar a nivel de especie, otros genes que codifican resistencia al uso de antibióticos, genes de virulencia que codifican para aerolisinas, hemolisinas, serín proteasas, GCAT, lipasas y DNasas, PCR-RFLPs utilizada para la tipificación de especies del género y más recientemente se ha incrementado la técnica de Espectrofotometría de Masas por Matriz Asistida por laser Desorción-Ionización de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF MS) la cual es capaz de identificar especies de Aeromonas rápidamente y precisa [2,3,13,15,33-36]. Esta revisión se basó en la caracterización de Aeromonas spp. y su importancia clínica.

RESULTADOS (REVIEW)

Los métodos bioquímicos y microbiológicos clásicos de identificación son indispensables en la caracterización del género Aeromonas, sin embargo, por sí mismo resultan poco concluyentes, por lo que se ha recurrido a las técnicas moleculares para complementar y reforzar la caracterización e identificación de miembros del género [13,17]. Estudios realizados han demostrado, en base al análisis de las secuencias de los genes 16S rRNA y 5S rRNA y a los resultados de la hibridación DNA-RNA, que el género Aeromonas presenta una evolución filogenética distinta al de las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae, por lo que han propuesto elevar al género Aeromonas a la categoría de familia Aeromonadaceae [15,20,21,27]. Figura 1.

Dentro de los genes empleados para la identificación de Aeromonas se encuentran secuencias del 16S del rRNA, genes de mantenimiento los cuales poseen mayor poder de discriminación como el rpoD y el gyrB. En distintos estudios, las secuencias del gen gyrB mostraron ser un excelente marcador molecular para la inferencia filogenética en el género Aeromonas. Este marcador filogenético ha revelado grupos consistentes con las taxonomías propuestas previamente, en la mayoría de los estudios genéticos y filogenéticos particularmente de acuerdo con el análisis de secuencias del gen 16S del rRNA, así como estudios de discrepancias entre diferentes hibridaciones de DNA-DNA, la diversidad de secuencias observadas a nivel intraespecificas, permite proponer el uso del marcador gyrB, con un doble propósito, como útil para la diferenciación de cepas, y al mismo tiempo para identificación de especies [34].

En otro estudio basado en RFLPs del 16S del rRNA utilizando enzimas de restricción tales como AluI, CfOI y MnlI encontraron resultados controversiales en distintos aislamientos de Aeromonas popoffi, tal vez debido a que probablemente se tratara de nuevas especies de Aeromonas o si los sitios de restricción en especies conocidas se ven afectados por diversidad inter-específica de nucleótidos, es decir diferencias entre cepas de la misma especie. Este estudio representa un método confiable para identificar especies conocidas de Aeromonas, así como muy útil para determinar la incidencia real de especies del género [27]. En otro estudio se realizó la detección de genes de virulencia y se exploró la distribución los genes probables entre aislamientos de Aeromonas hydrophila, estos fueron gcat (n= 30, 96.7%), aer/hem (n=25, 80.64%), ast (n= 30, 96.7%) y lafA (n= 26, 83.87%) [7]. Lo cual muestra la variabilidad de genes de virulencia probable dentro de cada aislado de Aeromonas spp. y su asociación a patogenicidad de esta cepa hacia el humano.

DISCUSIÓN (REVIEW)

Dentro de las características fisicoquímicas y biológicas propias del genero Aeromonas, se encuentran la presencia de una pared celular de peptidoglicano entre dos membranas lipídicas; son anaerobias facultativas; presentan una enzima degradadora de peróxido de hidrogeno, una catalasa, así como también una oxidasa que participa en la transferencia de electrones a una molécula de oxígeno, permitiendo la formación de agua; reducen nitrato a nitrito y fermentan la D-glucosa como fuente principal de carbono y energía; además estas pueden crecer en medios que contienen 3% de NaCl, pero no en concentraciones salinas de 6% [13,14].

Los miembros del género Aeromonas pueden crecer tanto en medios de cultivos diferenciales o selectivos, como los utilizados para el crecimiento de bacterias enteropatógenas. En cuanto a su cultivo, para el aislamiento en heces, se recomiendan: Agar Cefsulodina Irgasan Novobiocina (CIN), agar sangre ampicilina (ABA) y también Agar Aeromonas (AA), este contiene los agentes selectivos verde brillante e Irgasan, ideales para el crecimiento de Aeromonas susceptibles a la ampicilina, el uso de AA ha duplicado la frecuencia de aislamiento de Aeromonas y por lo tanto se considera el medio selectivo más eficiente [25,26]. La habilidad de crecer en medios específicos, así como sus capacidades metabólicas, son consideradas para su identificación bioquímica, pero como ya se ha observado en diversos estudios estos métodos muestran algunas limitaciones como falsos positivos, ya que algunas características son compartidas con bacterias de otros géneros como vibrio y también muestran baja especificidad [13,17].

Actualmente se recurre al uso de las técnicas moleculares con lo cual, se ha logrado aumentar el número de especies del género que pueden ser identificados y validados, las cuales ascienden a más de 25 especies.

En la identificacion molecular de Aeromonas se han empleado distintos marcadores principalmente el 16S del rRNA, RFLPs, otros más específicos tales como rpoD o gyrB, y más recientemente MALDI-TOF MS permitiendo en algunos casos la identificación de especies de Aeromonas de forma eficiente [15,33,35].

Lo cual es importante debido al incremento de evidencias que indican que estas especies se encuentran ampliamente distribuidas en el ambiente y que pueden causar una variedad de infecciones en animales y en el humano. Dada la creciente importancia de Aeromonas en infecciones clínicas y las limitaciones de los métodos existentes, hay una necesidad de diseñar sistemas precisos que puedan identificar de forma inequívoca estos microorganismos [17].   

El papel de Aeromonas spp, como agente causal de gastroenteritis es debatible, debido a la baja incidencia de grandes brotes epidémicos reportados y a la carencia de un modelo animal adecuado. Como se ha mencionado anteriormente son tres las especies de importancia clínica A. hydrophila, A. caviae y A. veronii biovar sobria. Las fuentes de infección gastrointestinal y cutánea por Aeromonas son principalmente agua o alimentos contaminados, así como el contacto directo del agua con heridas [29].  Los miembros de este género producen varias exoenzimas, algunas de ellas considerados factores de virulencia, que al parecer tienen un papel importante en la patogenicidad de las infecciones intestinales y sistémicas. Diversos son los factores de virulencia asociados a la patogenicidad de Aeromonas, estas producen una serie de factores de virulencia y la patogénesis de la infección por Aeromonas es compleja y por lo tanto multifactorial [11]. Dentro de los factores de virulencia correspondiente a Aeromonas encontramos algunos lipopolisacáridos, su cápsula, la capa S, pilis, hemolisinas, enterotoxinas citotónicas, citotoxinas, fosfolipasas, proteínas de membrana externa, adhesinas, proteasas, lipasas y sideróforos, de los cuales las hemolisinas y enterotoxinas están estrechamente relacionadas con la patogenicidad de este microorganismo [8]. Existen algunas metodologías empleando distintos primers, descritas previamente por algunos autores, basados en la amplificación por PCR de genes de virulencia que codifican para aerolisinas, hemolisinas, serín proteasas, GCAT, lipasas y DNasas donde muestran la diversidad y distribución de estos genes en las especies de Aeromonas aisladas de muestras ambientales y clínicas [2,3,6,7,19].

En un estudio se encontro que algunos aislados de Aeromonas provenientes de humanos poseen genes stx1 y stx2 muy similares a genes de virulencia encontrados a E. coli [10]. Estas bacterias se han relacionado con varios procesos infecciosos intestinales e extraintestinales. A nivel intestinal, el padecimiento más frecuentemente relacionado es la diarrea, mientras que, en las extraintestinales, las infecciones de heridas son las de mayor incidencia [5]. Especies como A. caviae y A. veronii biovar sobria, son las más comúnmente asociadas con diarrea del viajero; algunos estudios también han relacionado a estas dos especies con enteritis presentando como principal síntoma la diarrea acuosa, mientras que enteritis causada por A. hydrophila y A. jandae se ha caracterizado por presentar heces blandas, por su parte A. caviae es particularmente frecuente en los casos de diarrea pediatríca; individuos inmunocompetentes también han sido afectados por gastroenteritis vinculado a infección por Aeromonas [22,23,24]. Otro tipo de infecciones muy comunes a la que se relaciona Aeromonas son las de herida, reportadas en individuos sanos después de una lesión en un medio acuático o suelo; las infecciones de herida incluyen celulitis, mionecrosis, y ectima gangrenosa, además han sido reportados casos de gangrena. Estas infecciones pueden manifestarse como pústulas, úlceras o abscesos; este tipo de infecciones puede conducir a septicemias o bacteriemias en pacientes inmunocomprometidos [29]. La septicemia se asocia principalmente con los pacientes inmunocomprometidos con predisponentes condiciones médicas, como la función hepatobiliar deteriorada y los tumores malignos, aunque también se ha reportado en individuos sanos tras infecciones de herida, en pacientes con infección severa la tasa de mortalidad se ve incrementada drásticamente [34].

EXPERIMENTAL (REVIEW)

En la identificación de microorganismos, la microbiología ha jugado un papel fundamental empleando técnicas como observaciones de la morfología macroscópica y microscópica, desarrollo, y características bioquímicas o metabólicas.

Los miembros del género Aeromonas pueden crecer tanto en medios de cultivos diferenciales como selectivos. Para el aislamiento a partir de heces, se recomiendan: Agar Cefsulodina Irgasan Novobiocina (CIN), agar sangre ampicilina (ABA) y también Agar Aeromonas (AA), este contiene los agentes selectivos verde brillante e Irgasan, que también permiten el crecimiento de Aeromonas susceptibles a la ampicilina, AA ha duplicado la frecuencia de aislamiento de Aeromonas y por lo tanto se considera el medio selectivo más eficiente [25,26]. En cuanto a pruebas bioquímicas existen medios de identificación manuales multipruebas o sistemas automatizados, los cuales son procedimientos largos y complejos, así como la obtención de falsos positivos, limitada precisión y baja especificidad [13]. Sin embargo, en la identificación del género Aeromonas, con la aplicación de las herramientas moleculares se ha logrado aumentar el número de especies del género que pueden ser identificados y validados, las cuales ascienden a más de 25 especies. Dentro de los genes empleados para la identificación de Aeromonas se encuentran el 16S del rRNA, genes de mantenimiento los cuales poseen mayor poder de discriminación como son rpoD o gyrB, genes de resistencia a antibióticos, genes de virulencia, PCR-RFLPs utilizada para la tipificación de especies del genero y más recientemente se ha incrementado la técnica de Espectrofotometría de Masas por Matriz Asistida por laser Desorción-Ionización de Tiempo de Vuelo (MALDI-TOF MS) la cual es capaz de identificar especies de Aeromonas de una forma rápida y precisa [2,3,13,15,33,35].

CONCLUSIÓN

Los laboratorios de diagnóstico deben ofrecer métodos sensibles y específicos apoyándose en métodos microbiológicos clásicos. Sin embargo, se han realizado diversos estudios los cuales, han demostrado que los métodos fenotípicos a los cuales se recurre habitualmente presentan diversas inconsistencias al momento de identificar, a nivel de género, y de especie, tal como ocurre con Aeromonas y Vibrio, las cuales anteriormente estaban clasificadas en la misma familia, incluso también ha ocurrido con familias distintas como la Enterobacteriaceae. El empleo de métodos más precisos y específicos como son los moleculares tales como 16S del rRNA ha servido para ahora colocar a Aeromonas en la familia Aeromonadaceae, así como diferenciar a especies dentro del mismo género, sin embargo no ha funcionado para todas las especies del genero, para lo cual, se ha recurrido a otros marcadores mucho más específicos como son el rpoD y el gyrB, así como detección de genes de virulencia, y resistencia a multidrogas, entre otras aplicaciones moleculares como MALDI-TOF MS, que han venido a complementar el diagnostico clínico, con lo cual muy probablemente se pueda proporcionar un tratamiento más adecuado a los pacientes al contribuir con información sobre patogenicidad y resistencia a multidrogas de los aislados de Aeromonas.

RECONOCIMIENTOS

Al Instituto Politécnico Nacional, a la Secretaria de Investigación y Posgrado del Instituto Politécnico Nacional y a la Comisión de Operación y Fomento de Actividades Académicas.

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