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INTRODUCCIÓN
Staphylococcus aureus (S. aureus) es un microorganismo causante de infecciones hospitalarias y comunitarias, que posee características particulares de virulencia y resistencia a los antibióticos. Las infecciones que produce, ocurren regularmente en pacientes hospitalizados y en personas sanas que podrían presentar severas consecuencias, a pesar de la terapia antimicrobiana en especial S. aureus resistente a la meticilina (SARM) (1,2). S. aureus es uno de los patógenos ubicuos más importantes y adaptables, pues es muy resistente a los ambientes desfavorables como las superficies nosocomiales (3).
Un alto porcentaje de S. aureus es multirresistente a fármacos inhibidores de la pared celular, como los betalactámicos y glucopéptidos. in embargo, se ha observado que la acumulación y la diseminación de su resistencia es producto del intercambio de determinantes de resistencia preexistentes portados por elementos genéticos móviles como plásmidos, transposones (Tn) y cassette cromosómico estafilocócico (SCCmec)(4,5).
La resistencia a la penicilina, meticilina y vancomicina están codificadas por los genes blaZ (betalactamasa), mecA (PBP2a) y vanA (dipéptido D-alanina- D-alanina) respectivamente (6-10) .Según la OMS la resistencia a los antimicrobianos ha sido declarada como una amenaza en salud pública que enfrenta la humanidad (11).
El Stahpylococcus aureus forma parte de nuestro microbiota, y es causa de infecciones tanto comunitarias como hospitalarias. Los pacientes con infecciones por SARM tienen una probabilidad de 64% mayor de morir que los pacientes tratados con fármacos sensibles (12).
En el 2019, la ODS (Objetivos de Desarrollo Sostenible de las Naciones Unidas) realizó el seguimiento de la frecuencia de septicemias en 25 países, en la cual uno de los patógenos farmacorresistentes más reportado fue Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) representado el 12.11% (12).
Las cepas de S Staphylococcus aureus vancomicina-intermedio (VISA) tienen una susceptibilidad a la vancomicina de (CIMs >16 µg/mL), El mecanismo de resistencia se debe en la mayoría de los casos al engrosamiento de la pared celular que contiene los precursores. La mayoría de cepas VISA son SARM, contienen el gen mecA. S. aureus con resistencia completa a la vancomicina (VRSA) con una (CIMs ≥32 µg/mL), son muy raras y solo se ha descrito esta resistencia hasta a mediados del 2004 (13).
Dentro de las bacterias del grupo ESKAPE se encuentran los siguientes patógenos: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter species. Estos patógenos son de gran importancia clínica, puesto que causan la mayor parte de infecciones en el ámbito hospitalario, debido a que son organismos multidrogorresistentes (14).
En un estudio realizado en el Hospital de la ciudad de Cali - Colombia por Chávez, Martínez, y Mantilla (2017), en el personal de la salud y superficies hospitalarias, el microorganismo que se aisló en mayor porcentaje fue el Staphylococcus aureus con 21. 3%, en el personal de salud se detectó el 9.1 % y en el ambiente hospitalario en un 12.2% (15).
A nivel nacional en un estudio realizado por Cimera, Pérez año (2010) en el Hospital General de las Fuerzas Armadas, encontraron que la prevalencia de Staphylococcus aureus a nivel del personal de salud fue del 12% y SARM 1%. Además se identificaron factores de riesgo como: edad mayor a 60 años, diabetes mellitus, cambiarse de mandil una vez por semana e inadecuado lavado de manos (16).
El entorno hospitalario contribuye a la diseminación de patógenos, especialmente en el ambiente ocupado por pacientes previamente colonizados. La presencia de bacterias se puede encontrar en equipos médicos y colonizando superficies en un mayor porcentaje. Esta diseminación se debe en gran medida a la contaminación cruzada a través de las manos del personal de salud y los pacientes (17).
A nivel local en el Hospital José Carrasco Arteaga - Cuenca, realizado por Argudo, Piña, y Neira (2018) en el servicio de pediatría encontraron que el 16,67 % de las infecciones nosocomiales registradas corresponden a Staphylococcus aureus (18).
La resistencia a los antibióticos es considerada un desafío mundial para los sistemas de salud, por dos motivos: a) la capacidad de las bacterias de transmitir información genética mediante mecanismos de transferencia horizontal y b) la globalización que facilita enormemente la posibilidad de difundir esa resistencia en cortos períodos (19).
La diseminación de la resistencia antimicrobiana entre cepas de S. aureus es de gran importancia en salud pública, puesto que este microorganismo ha desarrollado rápidamente resistencia a todos los antibióticos introducidos para uso clínico, esto lo convierte en uno de los patógenos más importantes, causantes de infecciones a nivel comunitario y nosocomial (4,5).
El objetivo de esta investigación fue determinar la resistencia de Staphylococcus aureus aislado en ambientes nosocomiales mediante la evaluación de la resistencia a penicilina, meticilina y vancomicina, a partir de métodos convencionales y moleculares.
MATERIALES Y MÉTODOS
El estudio se llevó a cabo mediante el enfoque cuantitativo, bajo la modalidad de una investigación de campo, observacional, de corte transversal. Con relación a la muestra se aisló cepas de Staphylococcus aureus de 200 muestras de ambientes nosocomiales, entre ellos equipos médicos y superficies hospitalarias. En la segunda fase se buscó identificar los genes blaZ, mecA y vanA. El muestreo empleado fue de tipo no probabilístico por cobertura total, el cual se realizó con todas las normas de bioseguridad en una institución de salud de la provincia del Azuay-Ecuador.
Criterios de Inclusión: aislados que producen viraje de manitol y fueron verificados como Staphylococcus aureus por amplificación de los genes nucA y femB.
Criterios de Exclusión: Aislados que no viran el manitol y no amplifican los genes nucA y femB. Medios de cultivo sin crecimiento bacteriano o contaminado.
Recolección de las muestras
Las muestras se tomaron mediante la técnica de hisopado de equipos médicos y superficies hospitalarias, las cuales fueron transportadas en caldo triptona soja. Posteriormente las muestras fueron incubadas a 37°C por 24 horas en ambiente de aerobiosis para su crecimiento y proliferación.
Aislamiento e identificación de S. aureus
El procesamiento de las muestras, se llevó a cabo en el Laboratorio de Genética y Biología Molecular del Centro de Investigación, Innovación y Transferencia de Tecnología (CIITT), donde se realizó el aislamiento en agar manitol salado y se confirmó mediante la identificación de los genes nucA y femB.
Determinación fenotípica de susceptibilidad antibiótica para penicilina, meticilina y vancomicina
Se empleó el inoculo ajustando a la escala 0.5 Mcfarland para llevar a cabo el método de Kirby Bauer, con la utilización de sensidicos de Oxacilina (5ug), penicilina G (10 unidades) y vancomicina (30 μg), cumpliendo a cabalidad los lineamientos establecidos por el Clinical and Laboratory Standard Institute(CLSI, 2021) (20).
Extracción de ADN bacteriano
Para la extracción de ADN de las cepas de S. aureus se utilizó el método de lisis alcalina descrito por los autores Andrade Carlos y Orellana Paola (2019) (21).
Identificación genotípica para la determinación de los genes de resistencia de S. aureus.
Se empleó la técnica de PCR punto final para la detección molecular de los genes blaZ, mecA y vanA que codifican para resistencia penicilina, meticilina y vancomicina respectivamente (22-24). La amplificación de los genes se realizó de acuerdo a los protocolos indicados en la Tabla 1.
El volumen final de amplificación fue de 20 μL obtenidos de la siguiente manera: 10 μL de master mix Green GoTaq 2x (Promega), 5,5 μL de agua libre de nucleasas, 1.5 μL de ADN muestra y 1.5 μL de cada cebador. Los tubos de reacción se llevaron a un termociclador Bioneer (21).
La separación de los amplicones se realizó mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1,5% p/v, con 2µl Sybr safe en 50 ml de gel, en una cámara horizontal Thermo Electron Corporation Midicell® PrimoTM, Modelo EC330, USA a 70V, 32A y 50 W con fuente de poder programable Bio-Rad, Modelo Power-Pac Basic, USA durante 50 minutos. El resultado se revelo, en un transiluminador UV y se documentó con una cámara digital.
Para el análisis estadístico se generó una base de datos en el programa SPSS 21.0, se llevó a cabo mediante estadística descriptiva, análisis de frecuencia y medidas de asociación. Además, utilizamos el programa de Excel para la presentación de los resultados.
RESULTADOS
De las 200 muestras iniciales se aislaron 6 cepas que resultaron positivas para S. aureus, correspondiente al 3%. La identificación de las cepas se realizó mediante la amplificación de los genes nucA y femB.
Los resultados de las pruebas de susceptibilidad antibiótica mostraron que el 100% de las cepas de S. aureus aisladas, fueron resistentes a oxacilina y penicilina g; y sensibles a vancomicina, lo cual coincide con los resultados de PCR punto final, de la identificación de los genes blaZ, (Figura 1) mecA (Figura 2) y vanA (Figura 3) que codifican la resistencia a penicilina, meticilina y vancomicina respectivamente, como se aprecia en la Tabla 3. La distribución de las frecuencias de resistencias según el lugar de procedencia de la muestra, se puede apreciar en la Tabla 4.
Tabla 4 Stahylococcus aureus resistente a penicilina, oxacilina, vancomicina según lugar de procedencia.
Figura 1 Productos de PCR del gen blaZ con un amplicón de 674 pb. Carriles: 1 escalera alélica, 2 control positivo, 3 control negativo 4, 5, 6, 7,8 y 9 cepas positiva
Figura 2 Productos de PCR del gen mecA con un amplicón de 310 pb. Carriles: 1 escalera alélica, 2 control positivo, 3 control negativo 4, 5, 6, 7,8 y 9 cepas positivas
DISCUSION
S. aureus es un patógeno oportunista que ocasiona enfermedades en individuos con el sistema inmunológico deprimido, y se asocia a elevadas tasas de morbilidad y mortalidad dentro de las áreas hospitalarias, comprometiendo así la vida de pacientes y personal sanitario. La aparición y diseminación de cepas SARM es uno de los problemas más importantes en salud pública, debido a que éstas son causantes de un alto porcentaje de infecciones nosocomiales difíciles de tratar, pues a menudo son multirresistentes (27,28).
En el presente estudio los resultados de fenotipificación y genotipificación mostraron que el 100%(6) de los aislamientos identificados como S aureus, fueron resistentes a la penicilina g y oxacilina, en comparación con la investigación realizada por A. Navascués (2004) en el hospital de Navarra, donde se determinó que los aislamientos de S aureus tenían un resistencia a la penicilina del 72.3% y oxacilina del 45.5% (29). De igual manera, la investigación desarrollada por Andrade, y Orellana P (2019) en superficies de un hospital de Cuenca, reportaron una resistencia a la penicilina y meticilina correspondiente al 66.6% (21).
Velázquez-Meza (2005) observó en los hospitales de tercer nivel un incremento muy importante de la prevalencia de SARM, desde1980 donde se reportó un 4%, hasta el 2001 en el que se identificó un 55%. Algunas de las cepas SARM no solo son resistentes a betalactámicos sino también a glucopéptidos como la vancomicina (30).
En otro estudio realizado por Sserwadda Lukenge (2018) sobre las superficies de trabajo de un hospital de Uganda, encontraron una frecuencia del 75.4% de S. aureus constituyéndose en el microorganismo de mayor prevalencia; además, se identificó un 52% de SARM (31). Esto podría atribuirse a la capacidad de adaptación de este patógeno a las superficies inertes por largos periodos.
En un estudio realizado por Armas Fernández (2015), en las superficies de un hospital de Cuba, la prevalencia de SARM fue del 50.6%. En otro estudio Lliya, y Mwangi (2020) reportaron una prevalencia de SARM de 47.0% en los centros de salud de Kenia (32). Estos porcentajes podrían deberse a la colonización previa de este patógeno, las medidas de asepsia y antisepsia del personal sanitario, y las condiciones higiénico- sanitarias de esos ambientes hospitalarios (33).
En este sentido, en muchas instituciones hospitalarias se puede encontrar SARM, el cual es causante de alrededor del 50% de infecciones nosocomiales, y de enfermedades como neumonía, bacteriemias etc., que requieren de elevados costos de tratamiento e incrementan los índices de mortalidad (33).
Según la guía de enfermedades infecciosas y clínicas de Stanford del año 2000, entre los factores de riesgo de infecciones nosocomiales causadas por cepas SARM, se pueden mencionar: la estancia prolongada del paciente en la casa de salud, el uso indiscriminado de antibióticos en pacientes previamente colonizados por este patógeno, además de infecciones por intervenciones quirúrgicas. Debido a su alto impacto y prevalencia es importante establecer programas de vigilancia y control en los centros hospitalarios (34).
El Ministerio de salud pública (MSP) en el 2014 reportó que en los aislados hospitalarios provenientes de UCI, se encontró una resistencia de S. aureus a la penicilina del 87%, un 46% de resistencia a la meticilina, y 12% de resistencia a la vancomicina. Para el año 2017 el porcentaje de resistencia de la penicilina disminuyó al 80%, así como también de la meticilina al 35% y la vancomicina al 2% (35). Es posible que el conocimiento del perfil de susceptibilidad, apoye el uso racional de los antimicrobianos y dé como resultado la disminución de las resistencias.
Bajo este contexto, los glucopéptidos como la vancomicina y teicoplanina constituían la única opción de tratamiento para pacientes con infecciones por cepas SARM, pero en 1990 se presentaron los primeros reportes de cepas con sensibilidad disminuida a vancomicina, y el uso inadecuado ha generado cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la vancomicina (VRSA) y cepas de Staphylococcus aureus de resistencia intermedia (VISA) (33).
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio evidenciaron la presencia de SARM en las diferentes áreas hospitalarias, constituyéndose en un factor de riesgo de transmisión horizontal entre el personal sanitario y los pacientes, por lo cual es de gran importancia evaluar y establecer medidas rigurosas de prevención, control y diseminación de SARM para disminuir el riesgo de infecciones futuras. Además, sería importante realizar estudios epidemiológicos que permitan conocer más acerca del comportamiento de las cepas SARM.
Importancia y Limitaciones: De 200 muestras tomadas en superficies hospitalarias se aislaron 6 cepas de S. aureus, de las cuales el 100% fueron resistentes a la meticilina. Si bien la prevalencia de S. aureus en este estudio es muy baja (3%), posiblemente debido a que el trabajo se realizó durante la pandemia de Covid-19, cuando se extremaban las medidas de prevención, es importante resaltar el elevado porcentaje de cepas SARM
