INTRODUCCIÓN
El interés en una alimentación saludable, en las características antioxidantes y en los beneficios potenciales para la salud de una dieta rica en compuestos fenólicos está aumentando con el tiempo (1), uno de los alimentos que ha levantado gran interés son las hierbas aromáticas y medicinales, estas han tenido una gran importancia culinaria y en la nutrición humana, desde la antigüedad se han utilizado de muchas maneras diferentes, en general se utiliza la hoja para cocinar (2-3), se han añadido a los alimentos para potenciar el sabor y mejorar sus propiedades organolépticas, también se han utilizado ampliamente como conservantes y en medicina natural (4), hierbas como el romero (Rosmarinus officinalis L.), salvia (Salvia officinalis L.), tomillo (Thymus vulgaris L.), melisa (Melissa officinalis L.), menta (Mentha spicata L.) y lavanda (Lavendula angustifolia Mill.), que son originarias de la región mediterránea y se cultivan en todo el mundo (5) y durante milenios, las plantas medicinales han sido una fuente valiosa de agentes terapéuticos, es más, muchos de los medicamentos actuales son productos naturales de plantas o sus derivados (6).
Uno de los mayoritarios compuestos que está presente en las hierbas y con reconocidas propiedades antioxidantes es el ácido rosmarinico (AR) (Figura 1) es un éster de ácido cafeico y ácido 3,4-dihidroxifenilláctico. Se encuentra comúnmente en especies de Boraginaceae y la subfamilia Nepetoideae de Lamiaceae. Sin embargo, también se encuentra en especies de otras familias de plantas superiores y en algunas especies de helechos y antocerotes, tiene una serie de actividades biológicas interesantes, por ejemplo, antiviral, antibacteriana, antiinflamatoria y antioxidante (7). Un gran número de preparaciones a base de hierbas y suplementos alimenticios que contienen AR se comercializan con claros efectos beneficiosos para la salud, además, debido a la inhibición de la peroxidación lipídica y el crecimiento bacteriano, el AR está aprobada para su uso como antioxidante y/o conservante natural en la industria alimentaria (8).
Otro de los compuestos presentes es el ácido cafeico (CA) (ácido 3,4-dihidroxicinámico) (Figura 1) es un derivado del ácido rosmarinico y es uno de los compuestos fenólicos naturales ampliamente distribuidos en materiales vegetales como verduras, frutas, café y té (9-10), Este ácido fenólico y sus derivados tienen propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y anticancerígenas (11) actúa como inhibidor cancerígeno y exhibe un alto efecto antioxidante y cierta actividad antimicrobiana. Además, este compuesto puede ser útil en la prevención de enfermedades cardíacas y aterosclerosis, entre otras (12).
Los compuestos fenólicos en las hierbas son los componentes principales responsables de la eliminación de radicales libres, mediante la donación de un átomo de hidrógeno o un electrón para formar compuestos estables (13). Las hierbas pueden actuar a través de varios mecanismos para brindar protección contra el cáncer, se ha demostrado que ciertos fitoquímicos de hierbas o extractos de hierbas inhiben una o más de las etapas del proceso del cáncer (es decir, iniciación, promoción, crecimiento y metástasis) (14). En particular, según las observaciones de muchas culturas durante muchos años, se ha informado que numerosos alimentos y hierbas, incluidos alimentos básicos, verduras, condimentos y tés de hierbas ejercen efectos protectores contra diversas enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo, como las enfermedades cardiovasculares, el cáncer y las enfermedades hepáticas (15).
Las plantas están produciendo numerosos metabolitos secundarios químicamente muy diversos que están optimizados para ejercer funciones biológicas y aún están lejos de ser investigados exhaustivamente (16). Ya en el año 1999 (17), se convocó a un panel científico, entre ellos epidemiólogos, toxicólogos, químicos y nutricionistas para tratar la temática de los fitonutrinetes presentes en las plantas, citando la actividad antioxidante demostrada en los flavonoides del té y desde ya se sugirió que esto debería ser una prioridad de los programas de investigación. Hasta la fecha, los tés de hierbas, así como los tés verdes, son una bebida popular en todo el mundo, particularmente en China, debido a su fragancia, propiedades antioxidantes, aplicaciones terapéuticas y otros efectos beneficiosos para la salud (18). Resulta urgente rescatar ese conocimiento para documentar la información sobre especies útiles para el desarrollo de nuevos medicamentos y al mismo tiempo evaluar el grado de amenaza de las especies útiles para diseñar estrategias para su conservación, contribuyendo a la protección de la biodiversidad (19). En este sentido, Chile ha dado un gran paso al certificar 103 plantas medicinales en el Reglamento del sistema nacional de productos farmacéuticos de uso humano (DS N°3/10) (20), que se enmarcan en la política nacional de medicamentos. En la resolución 548 del Ministerio de salud (21) considera en el listado de medicamentos de uso herbario tradicional a siete de las ocho hierbas analizadas en este estudio: menta, romero, lavanda, melisa, malvarrosa, tomillo y caléndula, excepto la hierba buena, pero esta al ser una especie del género Mentha y de la familia Lamiaceae, se le atribuyen potenciales propiedades medicinales (22-25)
Por otro lado, la Organización Mundial de la Salud (OMS) (26), considera a la medicina natural y tradicional, donde se incluye el tratamiento con plantas medicinales, como la medicina más natural, inocua, efectiva, además de tener un costo racional, ser asequible y aceptada por la población. De acuerdo a la OMS (27) una planta medicinal es definida como cualquier especie vegetal que contiene sustancias que pueden ser empleadas para propósitos terapéuticos o cuyos principios activos pueden servir de precursores para la síntesis de nuevos fármacos.
Dentro del potencial uso de las hierbas en la medicina alternativa, en una revisión realizada por Menyiy (28), destaca a la hierba buena (Mentha spicata) por los extractos y aceites esenciales de, estos demostraron diferentes propiedades farmacológicas tales como actividad antibacteriana, antiparasitaria, insecticida, antiinflamatoria, antidiabética, antioxidante, diurética, analgésica, antipirética, antihemolítica y protectora. Una revisión realizada por Mena (29) destaca la actividad antioxidante y antibacteriana de los aceites esenciales debido a la presencia compuestos fenólicos que trabajan sinérgicamente entre sí para producir mecanismos de defensa frente a radicales libre o microorganismos patógenos.
A pesar de que los materiales vegetales son la base para el descubrimiento de fármacos y la popularidad de las hierbas tés, el número de artículos que exploran la eficacia clínica y la seguridad es muy limitado (30). El objetivo del estudio fue evaluar el contenido de actividad antioxidante (AA), de compuestos activos (CA) y Análisis proximal (AP) de ocho hierbas aromáticas liofilizadas del sur de chile: hierbabuena (Mentha spicata), menta (Mentha piperita), romero (Rosmarinus officinalis L.), lavanda (Lavandula angustifolia Mill.), melisa (Melissa officinalis L.), malvarrosa (Malva sylvestris L.), tomillo (Thymus vulgaris L.) y caléndula (Calendula officinalis L.) como potencial uso en la medicina complementaria o alternativa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección y preparación de muestras
Las diferentes hierbas aromáticas frescas cultivadas naturalmente en invernaderos y regadas con agua de lluvia, fueron recolectadas entre marzo y septiembre del año 2021 en la localidad de Rio Negro, ubicada a 36 km al sur de Osorno y a 7 km de la Ruta 5 en la Provincia de Osorno, Región de Los Lagos, en la zona sur de Chile. Las partes frescas de estas plantas se llevaron al laboratorio para su congelación a -18°C (Mademsa, Santiago) y su posterior liofilización (liofilizador vertical Operon, Corea). Después del proceso de liofilizado se almacenaron en bolsas herméticas de polietileno hasta su uso en procesos analíticos.
Determinación Actividad antioxidante (AA)
Para medir la actividad antioxidante de las ocho hierbas se utilizó los ensayos mediante la determinación de la capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno-ORAC, el cual se basó en el procedimiento descrito por Cao y Prior (31) con algunas modificaciones. La reacción fue llevada a cabo en buffer fosfato 75 mM (pH 7,4), en una microplaca de 96 pocillos, de color negra, con fondo plano y transparente. Se depositaron 45 μl de muestra y 175 μl de fluoresceína a 108 nM, esta mezcla fue preincubada por 30 min a 37 °C, transcurrido el tiempo se añadieron 50 μl de la solución de AAPH a 108 mM. La microplaca se colocó inmediatamente en el espectrofluorímetro de microplacas de doble exploración Gemini XPS, Estados Unidos, durante 60 minutos con longitudes de onda de emisión 538 nm y de excitación 485 nm, las lecturas de fluorescencia fueron registradas cada 3 min. La microplaca se agitó automáticamente antes y después de cada lectura. El blanco utilizado fue de buffer fosfato en lugar de la solución antioxidante y para la curva de calibración se trabajó con Trolox a 6, 12, 18 y 24 μM. Todas las reacciones fueron llevadas a cabo en triplicado. La normalización de los datos del área bajo la curva de decaimiento de la fluorescencia de cada una de las muestras y patrones se realizó como lo describe la Ecuación
Donde f0, corresponde a la lectura de fluorescencia inicial al minuto 0 y fi es la lectura de fluorescencia en el tiempo i. Los resultados se expresaron como μmoles equivalente en Trolox por 100 gramos de masa seca (μmoles ET/100g m.s.).
Determinación de los compuestos activos
Para la preparación de los extractos acuosos la hierba seca (1g) se le adiciono 50ml de agua destilada a 100°C, se utilizó sonicador por 30 minutos y luego se filtró en papel filtro para la eliminación del agua, una vez obtenido el extracto seco se reconstituyo con 20 µL ácido fórmico + 380 µL de metanol y posteriormente se sometió a sonicación a 65°C durante 20 min, luego se filtró con filtro pirinola de PTFE y el Sobrenadante recuperado evaporar a sequedad para ser analizado por HPLC
Para el análisis cromatográfico se utilizó un Cromatógrafo líquido con arreglo de diodos marca LaChrom (VWR HITACHI), el cual cuenta con una bomba automática (L-2200), un horno para la columna (L-2300) y un detector con arreglo de diodos (L-2450). La separación de los principios activos se llevó a cabo utilizando una columna de fase reversa (RP-18) de longitud 250 mm y 4.6 mm de diámetro, tamaño de poro de 5μm (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Se mantuvo una temperatura controlada del horno a 20°C. Se utilizó metanol grado HPLC (A) y ácido acético al 2% (B), para programar el gradiente de separación de los flavonoides. La absorbancia se registra simultáneamente en las longitudes de onda 254, 280, 320 y 360 nm, y se eligió la longitud 290nm para efectos de desarrollo de la metodología. De igual forma se obtuvieron los espectros UV de cada uno de los patrones de referencia.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se evaluó la capacidad antioxidante en hojas de ocho especies de hierbas aromáticas (Tabla 1), donde los resultados obtenidos en ORAC fueron: hierba buena 40.505,50 (μmoles ET /100g); menta 71.542,90 (μmoles ET/100g); romero 54.356,60 (μmoles ET /100g); lavanda 44.044,80 (μmoles ET /100g); melisa 49.247,41 (μmoles ET /100g); malvarrosa 63.135,55 (μmoles ET /100g); tomillo 61.012,20 (μmoles ET /100g) y caléndula 14.617,75 (μmoles ET /100g).
Según los resultados obtenidos, el ácido cafeico se cuantificó en las muestras de hojas de las ocho hierbas y los resultados fueron: hierba buena 8 mg/g p.s.; menta 0,2 mg/g p.s.; lavanda 2,5 mg/g p.s.; malvarrosa 0,5 mg/g p.s.; tomillo 2 mg/g p.s. y caléndula 0,5 mg/g p.s. en las muestras de romero y melisa no fue detectado.
El ácido rosmarinico fue cuantificado y estuvo presente en 6 de las 8 muestras analizadas: hierba buena 33 mg/g p.s.; menta 3 mg/g p.s.; romero 1,5 mg/g p.s.; lavanda 5 mg/g p.s.; melisa 20 mg/g p.s. y tomillo 24 mg/g p.s.; en las muestras de malvarrosa y calendula no fue detectado. Estos resultados reflejan que la hierba buena (un tipo de menta), melisa y tomillo contiene una alta cantidad de ácido rosmarinico
Discusión
Para la mayoría de las hierbas, se obtuvieron una gran capacidad antioxidante, superando a aquellos frutos considerados los mejores en esta características, es el caso del maqui (Aristotelia chilensis), el cual presenta 19.850 µmol ET/100g fruto fresco (32), coincidente con lo expresado por Zheng (33), donde expresa en su estudio que los valores ORAC en muchas hierbas fueron más altos que los informados para bayas, frutas y verduras, actividades antioxidantes en las hierbas que pueden atribuirse a otras sustancias no identificadas o a interacciones sinérgicas. De las hierbas secas analizadas, la menta, malvarrosa, y tomillo contienen niveles muy altos de antioxidantes (Tabla 1) (71.542,90, 63.135,55 y 61.012,20 µmol ET/100 g. respectivamente).
En una revisión realizada por Dragland (34) demuestro que existe una diferencia de más de 1000 veces entre las concentraciones de antioxidantes de varias hierbas secas, por lo tanto, en una dieta normal, la ingesta de hierbas puede contribuir significativamente a la ingesta total de antioxidantes vegetales y ser una fuente incluso mejor de antioxidantes dietéticos que muchos otros grupos de alimentos, como frutas, bayas, cereales y verduras. Por otro lado, De acuerdo con los resultados del estudio de Spagnol (12) donde realizo métodos in vitro para determinar la actividad antioxidante del ácido cafeico, concluyó que este compuesto exhibió una actividad antioxidante significativa. Los resultados demostraron la eficiencia relativa de la capacidad antioxidante en la captura de especies reactivas, en particular O 2 •− y HOCl/OCl −, que son relevantes en los procesos de señalización y defensa de los organismos. La captura de HOCl/OCl − es importante ya que los mamíferos no pueden detoxificar este compuesto cuando se produce en exceso durante los procesos infecciosos. Un estudio realizado por Zheng (33), se evaluó la actividad antioxidante en medio acuoso de 39 especies de hierbas medicinales y culinarias, indicó que las hierbas, entre ellas: tomillo, menta, romero, hierbabuena presentaron un contenido de actividad antioxidante de 19,49 ± 0,21, 15,84 ± 0,42, 19,15 ± 0,63, 8,10 ± 0,26 μmol de TE/ g de peso fresco respectivamente. Un estudio realizado por Galovicová (35), califica al tomillo con una alta actividad antioxidante.
Los resultados obtenidos de principios activos reflejan que la hierba buena (un tipo de menta) contiene una alta cantidad de ácido cafeico (8 mg/g p.s.) tal como lo demostrado por Junli (36) reportando que el ácido cafeico detectado en menta (2,2211 y 3,4521 mg/g p.s.) tiene una alta actividad antioxidante comparable a la del flavonoide quercetina (37). Otro estudio de Wang (5), que determinó el contenido de ácido cafeico, para las hierbas de romero, salvia, tomillo, menta, melisa y lavanda, los valores de su contenido oscilan entre 0 a 0,4 mg/g p.s. Según un estudio realizado por Espíndola (11) el ácido cafeico demostro tener una actividad contra el hepatocarcinoma o carcinoma hepatocelular (HCC) es una forma dominante de cáncer de hígado, previniendo la formación exagerada de especies reactivas al oxigeno (ROS) y ayudando en la eliminación de células tumorales a través de la oxidación del ADN. La actividad anticancerígena del ácido cafeico parece estar asociada a su potente actividad antioxidante y prooxidante atribuida a su estructura química con hidroxilos fenólicos libres, el número y posición de OH en el grupo catecol y el doble enlace en la cadena carbónica.
En el caso de ácido rosmarinico, la hierba buena, tomillo y melisa fueron las que presentaron mayor contenido de ácido rosmarinico (33, 24 y 20 mg/g p.s.), coincidente con lo reportado por Wang (5) que determinó el contenido de ácidos rosmarinico en hierbas aromáticas de romero, salvia, tomillo, menta, melisa y lavanda, las cuales se cuantificaron y tuvieron contenidos de entre 2,0 a un 27,4 mg/g p.s. Pereira (38) señala que el tomillo es una rica fuente de compuestos bioactivos como el ácido rosmarínico y sus derivados, siendo el ácido rosmarínico reportado como componente principal.
Las plantas aromáticas y medicinales están recibiendo una atención considerable en todo el mundo debido a su enorme potencial económico sin explotar, especialmente en el uso de medicamentos a base de hierbas (tabla 2), estas ocupan un lugar importante en los aspectos socioculturales, espirituales y de atención de la salud (39).
CONCLUSIONES
Dentro de las 8 hierbas analizadas se corrobora que la menta es la hierba que presenta mayor capacidad antioxidante, seguida por la malvarrosa y tomillo. En cuanto a principios activos, la hierbabuena fue la que presento mayor cantidad de ambos compuestos (ácido cafeico y ácido rosmarinico), seguido por lavanda para ácido cafeico y por tomillo para ácido rosmarinico. Con los antecedentes recopilados se puede concluir estas hierbas aromáticas del sur de Chile presentan alto nivel de capacidad antioxidante y principios activos, lo que posiciona a estar hierbas como potenciales aliados para la salud humana en la prevención de diversas enfermedades, entre ellas cardiovasculares, neurológicas y cancerígenas. Por otro lado, se sugieren más datos y estudios sobre la biodisponibilidad y la bioactividad de los antioxidantes de las hierbas. Sin embargo, estos datos representan un primer paso crucial que será objeto de seguimiento en futuros estudios.