INTRODUCCIÓN
Perú es uno de los 12 países con la mayor diversidad biológica, con aproximadamente 10% de flora mundial, estimada en 2500 especies, 30 de ellas son endémicas 1. El interés por los componentes activos de plantas nativas como alternativa al uso de compuestos químicos han incrementado las investigaciones 2. Los aceites esenciales son líquidos hidrofóbicos concentrados aromáticos y volátiles obtenidos de las plantas, están distribuidos por monoterpenoides, sesquiterpenodes, alcoholes, ácidos, esteres acíclicos aldehídos y lactonas 3. Los aceites esenciales reciben atención por su actividad antimicrobiana contra diferentes tipos de bacterias y hongos 4. Citostática e insecticida también se usan como flavores alimentarios 5, como aditivos naturales en alimentos 6. Los compuestos fenólicos presentes en los aceites esenciales les otorgan sus propiedades antioxidantes 7. El origen geográfico, nivel de precipitación y condiciones climáticas son los aspectos más importantes que influyen en la composición de los aceites esenciales 8,9,10. La creciente demanda por alternativas naturales a los aditivos sintéticos ha impulsado la búsqueda de nuevas fuentes principalmente vegetales 11, en alimentación, es muy importante su capacidad conservante 12, y para controlar la calidad de los aceites se evalúa generalmente la gravedad especifica (GE) e índice de refracción (IR) como indicadores 13,14. La evaluación de la seguridad de un AE involucra la especificación de su origen biológico, propiedades físicas y químicas y cualquier otra característica relevante 15. El género Lepechinia de la familia Lamiaceae está compuesta de 40 a 42 especies distribuidas desde el sur de Chile hasta California, USA. Lepechinia salviae (Lindl.) Epling, es una de las tres especies endémicas de Lepechinia presentes en Perú junto con Lepechinia subhastata (Benth) Epling. En algunos informes se identifica por el nombre sinónimo Sphacele salviae16,17.
Entre los componentes activos reportados en la especie Lepechinia salviae fueron; compuestos fenólicos como carnosol, rosmanol, ácido carnosico y 20 desoxocarnosol fueron los compuestos principales que le dieron a esta planta actividad antioxidante 16,18 y antimicrobiana 4. Esta especie se utiliza para tratamiento de afecciones del estómago, faringe, hígado, refriados 19. Nuestro interés en el género Lepechinia se debe a la abundancia de aceites esenciales y la variedad de metabolitos secundarios producidos 20. La Mentha peperita L. es un hibrido natural cultivado de Mentha aquatica L. y Mentha spicata L. aunque es originario de la región mediterránea, se cultiva en todo el mundo por su aceite esencial de menta se utiliza en sabor, fragancia, medicinal y aplicaciones farmacéuticas 21,22. Se han identificado más de 300 componentes en el aceite esencial donde los componentes son mentol, mentona, acetato de mentilo, 1,8 cineol, mentofurano, isomentona y limonerno 23,24 a pesar de que el potencial medicinal de las plantas en el Perú es considerable, el conocimiento de esta área y los estudios sobre las actividades biológicas de estas plantas siguieron siendo escasas. De acuerdo a antecedentes investigativos los componentes químicos y actividad antioxidantes de las plantas aromáticas peruanas Tanacetum vulgare L. y Mentha piperita L. no se han publicado previamente sin embargo habiendo muchos informes sobre aceites esenciales de estas especies en otros países. A pesar de su importancia como hierbas aromáticas altoandinas y especies medicinales, las investigaciones en especies Lepechinia y Mentha con respecto a su composición químicas diversidad genética y propiedades biológicas son limitadas. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio ha sido determinar la composición química de los aceites esenciales y las actividades antioxidantes de ambas hierbas aromáticas altoandinas que crecen a gran altura de la región andina del Perú.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materia Vegetal e identificación botánica
Se utilizaron las hojas de Lepechinia meyenii (Walp) Epling y Mentha piperita L. recolectadas de la zona alto ndel distrito de José María Arguedas (13º42 S.73º24 O a una altitud de 2935 msnm) perteneciente a la provincia de Andahuaylas, región Apurímac. Con clima Cwd de acuerdo a Koppens con precipitaciones media anual alrededor de 1000 mm/año, humedad relativa media de 50 % y temperatura de -5ºC a 21 ºC, con moderada incidencia de heladas. Las hojas de Lepechinia meyenii (Walp) Epling y Mentha piperita L. fueron cosechadas durante los meses de febrero a marzo del 2019. Las plantas fueron identificadas y autentificadas por la Dra. María del Carmen Delgado Laime y depositada en el laboratorio de botánica del pabellón de Ciencias Básicas de la Universidad Nacional José María Arguedas.
Extracción de aceites esenciales
Para la extracción de los aceites esenciales se seleccionaron las hojas frescas de Lepechinia meyenii (Walp) Epling y Mentha piperita L; se utilizaron 2,5 kilogramos de hojas frescas de cada especie y se sometieron a extracción por destilación por arrastre a vapor de agua a una presión de 10 psi. Una vez destilado los aceites esenciales se separaron por diferencia de densidades utilizando un decantador florentino graduado. Luego se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se almacenó a 4 ºC hasta el análisis, los rendimientos de extracción se evaluaron según la ecuación 1.
Determinación de densidad relativa
La densidad relativa fue determinada de acuerdo a la norma técnica peruana: NTP 3129.081:1974. Se calculó la densidad relativa de acuerdo a la ecuación 2.
Donde:
Picnómetro: peso del picnómetro
VAE: volumen del aceite esencial.
Determinación del Índice de refracción
Se utilizó el refractómetro ABBE, marca Ivymen System, Modelo RI-71, mediante la Norma Técnica Peruana: NTP 319, 075:1974.
Determinación de compuestos químicos mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)
Para el análisis de cada muestra se utilizó 20 µL de aceite esencial en 980 µL de diclometano, que fueron después de inyectar al cromatógrafo de gases acoplado a un detector selectivo de masas. Se separaron los compuestos en una mezcla mediante una columna capilar apolar DB-5MS (60 m x250 µm x 0,25 µm) (J y W Scientific de 5% fenil-polimetilsiloxano). La temperatura del inyector se mantuvo a 250 ºC con una inyección en modo Split (50:1), la programación de temperatura del horno fue: temperatura inicial 50ºC, mantenida por 5 minutos; posteriormente incrementándose a 10 ºC/min hasta alcanzar 100 ºC y finalmente a 10 ºC/min hasta 270 ºC, manteniéndose temperatura final por 1 min. El tiempo de corrida fue de 77,8 minutos, se utilizó helio como gas de arrase a un flujo constante de 1mL/min. Los compuestos de los aceites de Lepechinia meyenii (Walp) Epling y Mentha piperita L fueron identificados utilizando el software proporcionado por Agilent; MSD chemstation (versoon EO2.00.493), Por comparación de los espectros de masas de cada pico con los de la librería de espectros de masas de las bases de datos de flavor 2 y del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST, 08).
Determinación de la actividad antioxidante
Se prepararon diluciones en etanol acuoso de extractos hidroalcohólicos hasta obtener concentraciones de 0,0 a 150, 0 µg/mL. Se combinaron 1,0 mL de cada dilución con 0,5 mL de una solución de 0,3 mM de DPPH en etanol dejándose reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos, posteriormente se llevó a medir la absorbancia de las mezclas a 517 nm en el equipo de espectrofotometría. El porcentaje de actividad antioxidante de cada muestra se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación 3:
Donde:
AM: es la absorbancia de la muestra +DPPH
AB: es la absorbancia del blanco (muestra +etanol)
AC: es la absorbancia del blanco del reactivo (DPPH+etanol)
La concentración del extracto hidroalcohólico se neutralizó al 50 por ciento de los radicales de DPPH (EC50, concentración efectiva media) y se obtuvo directamente al graficar la recta entre el porcentaje de actividad antioxidante, frente a la concentración de la muestra de los aceites esenciales mg/mL.
Análisis estadístico
Los análisis muéstrales se realizaron por triplicado, para la evaluación estadística se utilizó un diseño completamente al azar (DCA); el análisis de varianza se trabajó con 0,05 de significancia; al encontrar diferencia significativa se procedió a realizar la prueba de comparaciones de medias de Fischer (LSD) a un nivel de α=0,05. Los datos fueron procesados con la ayuda de los programas estadísticos de Centurion XVII y la hoja de cálculo Microsoft Excel 2016.
RESULTADOS
Los aceites esenciales de Lepechinia meyenii (Walp) Epling y Mentha piperita L mostraron un rendimiento del 0,87 % y 0,56 % y la densidad relativa fue de 0,942 y 0,919 g/mL, para ambos resultados se encontró una diferencia significativa p≤0,05. El índice de refracción fue 1,4917 y 1,4676 con una diferencia significativa de p-value ≤0,05. Se detectaron y cuantificaron un total de 61 compuestos químicos para el aceite esencial de Lepechinia meyenii (Walp) Epling, siendo los hidrocarburos sesquiterpenicos la fracción principal de (55,73 %). Los compuestos principales (≥1,0%), según el orden de elución fueron α-Pineno (1,96%), D-Limoneno (6,48%), Copaeno (2,06%), α-Gurjuneno (1,34%), β- Cariofileno (1,39%), β- Cariofileno (2,19%), α-Farneseno (3,81%), β-Bisaboleno (2,42%), α-Amorfeno (2,30%), δ-Cadineno (3,63%), Guaiol (16,32%), α-Cadinol (1,30%), β-Eudesmol (2,36%), Bulsenol (4,15 %) y α-Bisabolol (6,49%). Con una desviación estándar de menos del 5% entre los porcentajes de cada analito en ambas columnas, en el total de los componentes detectados doce estaban indeterminados y se omiten de la Tabla 1.
Con respecto al aceite esencial de Mentha piperita L. se detectaron y cuantificaron 36 constituyentes, siendo los compuestos monoterpenoides principales (≥1,0%); β-Mirceno (3,15%), β-trans-ocimeno (4,58%), β-cis-ocimeno (1,96%), β-Linalol (30,25%), α-Terpineol (1,29%), o-aminobenzoato de linalilo (27,32%), trans-Geraniol (4,26%), Acetato de Nerol (2,92%) y Acetato de Geraniol (5,48%). Se obtuvo una desviación estándar por debajo del 5 % entre los porcentajes de cada analito en ambas columnas utilizadas. Siete componentes detectados están indeterminados y se omiten de la tabla 2.
Número | Nombre del compuesto (NIST08.L) | tR (min) | % en la muestra (áreas relativas) |
---|---|---|---|
1 | α-Pineno | 13.38 | 1.96 |
2 | β-Pineno | 14.87 | 1.63 |
3 | β-Mirceno | 15.01 | 0.14 |
4 | o-Cimeno | 16.30 | 0.43 |
5 | D-Limoneno | 16.48 | 6.48 |
6 | Eucaliptol | 16.62 | 2.72 |
7 | β-Linalol | 18.55 | 0.22 |
8 | Acetato de 1-Octen-3-ilo | 18.65 | 0.35 |
9 | Acetato de 2-Octil | 19.03 | 0.25 |
10 | Tujona | 19.33 | 0.62 |
11 | cis-Tagetona | 19.98 | 0.27 |
12 | 3-Pinanona | 21.24 | 0.24 |
13 | 4-terpineol | 21.29 | 0.20 |
14 | Mirtenol | 21.75 | 0.89 |
15 | Pulegona | 23.00 | 0.38 |
16 | Acetato de trans-Pinocarvilo | 24.56 | 2.44 |
17 | Acetato de Mirtenilo | 25.35 | 11.41 |
18 | α-Cubebeno | 26.06 | 0.68 |
19 | Copaeno | 26.94 | 2.06 |
20 | α-Gurjuneno | 27.83 | 1.34 |
21 | β- Cariofileno | 28.21 | 1.39 |
22 | α-Bergamoteno | 28.32 | 2.19 |
23 | β-Cubebeno | 28.43 | 0.49 |
24 | (Z)-β-Farneseno | 28.63 | 0.42 |
25 | Allo-Aromadendreno | 28.70 | 0.37 |
26 | α-Cariofileno | 29.17 | 0.39 |
27 | Germacreno D | 29.29 | 0.31 |
28 | γ-Muroleno | 29.61 | 0.66 |
29 | (Z,E)-Farneseno | 29.75 | 0.19 |
30 | (E)-β-Farneseno | 29.80 | 0.22 |
31 | α-Farneseno | 30.03 | 3.81 |
32 | Himachala-3(12),4-dieno | 30.08 | 0.25 |
33 | α-Muuroleno | 30.16 | 0.94 |
34 | β-Bisaboleno | 30.28 | 2.42 |
35 | α-Amorfeno | 30.63 | 2.30 |
36 | δ-Cadineno | 30.69 | 3.63 |
37 | Calameneno | 30.84 | 0.80 |
38 | cis-α-Bisaboleno | 31.13 | 0.59 |
39 | [1R-(1α,4aβ,8aα)]-1,2,4a,5,6,8a-hexahidro-4,7-dimetil- 1-(1-metiletil)-Naftaleno | 31.25 | 0.29 |
40 | trans-Nerolidol | 31.61 | 0.30 |
41 | Oxido de Cariofileno | 32.75 | 0.19 |
42 | Guaiol | 33.03 | 16.32 |
43 | Apiol | 33.44 | 5.41 |
44 | γ-Eudesmol | 34.09 | 0.88 |
45 | 2-isopropil-5-metil-9-metileno-Biciclo[4.4.0]dec-1-eno | 34.32 | 0.50 |
46 | tau-Murolol | 34.38 | 0.21 |
47 | α-Cadinol | 34.75 | 1.30 |
48 | β-Eudesmol | 34.87 | 2.36 |
49 | Bulnesol | 35.06 | 4.15 |
50 | α-Bisabolol | 35.49 | 6.49 |
Tr=Tiempo de retención, resultados en porcentaje de área relativa al pico
Número | Nombre del compuesto (NIST08.L) | tR (min) | % en la muestra (áreas relativas) |
---|---|---|---|
1 | β-Mirceno | 15.01 | 3.15 |
2 | p-Cimeno | 16.30 | 0.14 |
3 | β-trans-ocimeno | 16.49 | 4.58 |
4 | Eucaliptol | 16.61 | 0.50 |
5 | β-cis-ocimeno | 16.85 | 1.96 |
6 | 4-Careno | 18.25 | 0.37 |
7 | β-Linalol | 18.62 | 30.25 |
8 | cis-Tagetona | 19.98 | 0.14 |
9 | Mentona | 20.53 | 0.13 |
10 | 3-Pinanona | 21.24 | 0.20 |
11 | 4-Terpineol | 21.29 | 0.13 |
12 | α-Terpineol | 21.70 | 5.75 |
13 | cis-Geraniol | 22.38 | 1.29 |
14 | β-Citral | 22.82 | 0.12 |
15 | o-aminobenzoato de linalilo | 23.06 | 27.32 |
16 | trans-Geraniol | 23.11 | 4.26 |
17 | α-Citral | 23.64 | 0.22 |
18 | Acetato de Nerol | 26.05 | 2.92 |
19 | Acetato de Geraniol | 26.58 | 5.48 |
20 | β-Elemeno | 27.21 | 0.45 |
21 | β-Cariofileno | 28.21 | 1.87 |
22 | (Z)-β-Farneseno | 28.63 | 0.12 |
23 | Germacreno D | 29.82 | 1.28 |
24 | Elemol | 31.52 | 2.07 |
25 | Óxido de cariofileno | 32.75 | 0.18 |
26 | Ledol | 33.10 | 2.35 |
27 | Apiol | 33.41 | 0.49 |
28 | γ-Eudesmol | 34.07 | 0.44 |
29 | α-Eudesmol | 34.86 | 0.48 |
Tr=Tiempo de retención, resultados en porcentaje de área relativa al pico
Los componentes bioactivos identificados en los aceites esenciales de las especies investigadas son en total 11 compuestos, principalmente hidrocarburos sesquiterpenicos y monoterpenicos: β-Mirceno, Eucaliptol, β-Linalol, cis-Tagetona, 4-Terpineol, β-Cariofileno, (Z)-β-Farneseno, Germacreno D, Óxido de cariofileno, Apiol y γ-Eudesmol. La actividad antioxidante de los aceites esenciales presento un mayor contenido de 7,21 mg/mL en el aceite esencial Mentha piperita L. y 4,95 mg/mL en Lepechinia meyenii (Walp) Epling., como se presenta en la tabla 3
DISCUSIÓN
El análisis de los componentes químicos en los aceites esenciales de las especies Lepechinia meyenii (Walp) Epling y Mentha piperita L., mostraron mayormente la presencia de los siguientes compuestos: Acetato de Mirtenilo, Guaiol, β-Linalol y o-aminobenzoato de linalilo. El género Lepechinia, se caracteriza en general por los compuestos cariofeno, mirceno acetato de mirtenilo, guaiol y α-pineno como componentes principales, mientras que el género Mentha contiene principalmente al β-linalol, o-aminobenzoato de linalilo, β-trans-ocimeno y mentona. De acuerdo a los resultados se identificaron como fracción principal a los componentes sesquiterpenos en Lepechinia y monoterpenoides en Mentha. Se sabe que los componentes monoterpenos y sesquiterpenos son metabolitos secundarios característicos de los aceites esenciales 25. Los sesquiterpenos y monoterpenoides tienen propiedades antioxidantes, anticonvulsivas, antiulcerosas, antiinflamatorias, antibacterianas y antidiabéticas terapéuticas 26,27.
El mecanismo de acción general de los monoterpenos, como actividad antimicrobiana y antitusiva, se relaciona principalmente con su volatilidad, su hidrofobicidad, así como los aceites esenciales en su conjunto, determina su efecto sobre las estructuras de las células bacterianas con un efecto antimicrobiano posterior 28. Se ha demostrado que los monoterpenos ejercen actividades quimiopreventivas y quimioterapéuticas en modelos de tumores mamarios y por lo tanto pueden representar una nueva clase de agentes terapéuticos 27. En investigaciones anteriores compararon los principales componentes de los aceites esenciales obtenidos de especies Lepechinia spp. observándose monoterpenos y sesquiterpenos 25.
Se encontró una variación de componentes de las especies estudiadas en comparación al lugar de procedencia, donde se caracterizó un aceite esencial dominado por β-felandreno, canfeno, limoneno 29. Debido a la heterogenidad de los compuestos identificados en la especie Lepechinia no es posible establecer un patrón característico de compuestos para el género. El aceite esencial de Lepechinia conferta 30, y Lepechinia shiedeana31, de Venezuela exhibieron Ledol con 24,2 a 28,9% respectivamente como compuestos principales. Para el caso de Lepechinia floribuna de Argentina, Borneol 21,4%, β-Cariofileno 15,1% y acetato de ledilo 16,8% fueron los compuestos principales; sin embargo, para la misma especie recolectada en Bolivia, fue acetato de bornilo 12,3%, β-cariofileno 9,0% y canfeno 5,7% como compuestos principales 32.
En el aceite esencial de Lepechinia meyeni (Walp) Epling los monoterpenos constituían la fracción más importante con 61% seguidamente con 40% seguido de sesquiterpenos oxigenados 33. Otra especie endémica del género Lepechinia presente en Chile 35 36, reportó una composición particularmente rica en sesquiterpenos (50.6%), pero con porcentajes similares de componentes oxigenados e hidrocarburos (26,4%) y (24,2%) respectivamente. En general los sesquiterpenoides son la principal familia de componentes en los aceites esenciales de Lepechinia spp donde se reporta una gran variación entre los componentes principales, aunque se recolectan en el mismo lugar 34. De acuerdo a estudios de aceites esenciales de las hojas de menta que crecen en la Unicamp (Brasil) se caracterizan por la predomino del alcohol monoterpenico (linalol) con una tasa de (51%) seguido de carvona (23,42%) 37. En otras investigaciones los compuestos dominantes del género Mentha de Irán fueron α-Terpineol y oxido de pipertitinona 38. Varios artículos han informado de que la composición química de los aceites esenciales de Mentha difiere según los países o regiones en el mismo estado. Estas variaciones parecen depender de varias razones como cambios climáticos, externos medio ambiente y otros factores como el método y periodo de extracción, partes recolectadas de la planta, riego tectónicas y fenológicas. 39,40.
En cuanto a las bioactividades de estos compuestos el p-cimerno, según Cristiani y colaboradores han informado de la actividad antimicrobiana de cuatro monoterpenos entre ellos el (p-cimeno, y-tirpineno, carvacrol y timol) contra la bacteria Gram_positiva S. aureus y la bacteria Gram-negativa E.coli. concluyendo que el timol era considerablemente más toxico contra S. aureus que los otros tres terpenos, mientras que el carvacrol y el p-cimeno eran más activos contra E. coli. 41. El compuesto germadeno D compuesto que tiene tres dobles enlaces ricos en electrones, demostró una capacidad para eliminar aniones de radicales superixido 42. En los aceites esenciales que se encuentran en concentraciones más altas y relacionados con la actividad antimicrobiana son compuestos fenólicos como linalo, sabineno, mentol, mirceno y canfeno 43. Los sesquiterpenos tienen propiedades antiinflamatorias y antialérgicas. Las actividades antiinflamatias de algunas plantas medicinales se deben a la presencia de una o más lactonas sesquiterpenicas 44.
Con respecto a la actividad antioxidante de los aceites esenciales ambas especies presentan significativamente presencia de actividad antioxidante, de acuerdo investigaciones se sabe que los aceites esenciales con componentes dominantes como pulegona 44, mentona y epóxido de cis-piperitona 45,46, exhiben antioxidantes 47. Los compuestos timol, eucaliptol, mentol y carvacrol pertenecen a compuestos antioxidantes capaces de prevenir el estrés oxidativo 48. De acuerdo a los resultados obtenidos, observamos la coincidencia con los informes investigativos en los que el poder antioxidante in vintro de los aceites esenciales fue evaluado y vinculado a los principales monoterpenos oxigenados incluyendo mentol, mentona, acetato de mentilo y 1,8-cineol (49,50). En otros estudios sobre el aceite esencial de especies de Mentha pipireta L. de menor compuesto químico que contiene moléculas en el grupo metileno activo, tales como terpinoleno, α-y y- Terpineno, fueron también incluidos y reconocidos por su poderosa acción antioxidante que es equivalente al estándar positivo (vitamina E o α-tocoferol) (51).
CONCLUSIONES
En el estudio se logró determinar el perfil químico y actividad antioxidante de los aceites esenciales de las especies de Lepechinia meyeni (Walp) Epling y Mentha pipireta L. Las propiedades físicas de ambas especies presentaron rangos de calidad para aceites esenciales. Se detectaron y cuantificaron un total de 61 compuestos químicos para el aceite esencial de Lepechinia meyenii (Walp) Epling, siendo los hidrocarburos sesquiterpenicos la fracción principal de (55,73 %). Sin embargo en la especie Mentha piperita L. se detectaron y cuantificaron 36 constituyentes, siendo los compuestos monoterpenoides principales. Las propiedades físicas de ambas especies presentan ron rangos de calidad para aceites esenciales. La abundancia en monoterpenos conducen a actividades antioxidantes, encontrándose en el estudio mayor presencia de antioxidantes en la especie de Mentha piperita L. Además se concluye que los aceites esenciales de Lepechinia meyenii (Walp) Epling y Mentha piperita L. presentaron una buena actividad antioxidante siendo posibles candidatas por sus actividades antimicrobianas, antioxidantes, anticonvulsivas, antiulcerosas, antiinflamatorias, antibacterianas y antidiabéticas terapéuticas de mucho interés para las industrias con un enfoque farmacológico y alimentario especifico.