Ubicación de la zona de estudio

El presente trabajo de investigación se realizó en el laboratorio de Biología Molecular, Investigación y Vinculación de la carrera de Ingeniería Agrícola de la ESPAM MFL, ubicado en sitio “El Limón” del Cantón Bolívar situado geográficamente entre las coordenadas 00º 49' 23'' Latitud Sur, 80º 11' 01'' Longitud Oeste a 15 m s.n.m. (Estación meteorológica de la Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabi “Manuel Felix López”.), Manabí, Ecuador. Tuvo una duración de seis meses.

Metodología

Obtención de aislamientos

Tallos de plantas de fréjol que presentaban síntomas y signos (esclerocios y micelio) de S. rolfsii, fueron visualizadas en campo, posteriormente, se cortaron con un cuchillo estéril (alcohol 70%) y fueron colocados dentro de una funda de papel para su respectivo traslado al laboratorio, donde se adicionó agua en cantidad suficiente con la finalidad de limpiar los tallos y separar cualquier residuo no deseado; los tejidos fueron colocados en cámaras húmedas para inducir a la formación de esclerocios, que fueron extraídos y colocados en solución de hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto, una vez realizada la desinfección se colocaron en cajas de Petri (90 mm Ø) con medio PDA enriquecido con antibiótico ampicilina y fueron sellados con cinta plástica, hasta su posterior uso.

Fungicidas

Los fungicidas empleados perteneciente al grupo químico benzimidazoles fueron BENOCOR^® WP benomil 500 g kg^-1; RODAZIM^® 500SC carbendazim 500 g L^-1; NOVAK^® 500 thiofanato metil 500 g L^-1; MERTECT^® 500 tiabendazol 500 g L^-1 (ingrediente activo procedentes de diferentes casas comerciales reconocidas y vigentes en Ecuador). Las concetraciones evaluadas se establecieron a partir de la dosis de producto commercial en adjunto de etiqueta expresadas en partes por millon (ppm). Es importante contar con ensayos que puedan validar las concentraciones subletales indicadas por el fabricante y las concentraciones inhibitorias mínimas, para evitar que especies fitopatógenas generen resistencia (^{Ashby et al., 2023}).

Test in vitro de fungicidas

Se utilizó la técnica de medio de cultivo contaminado con fungicidas. El ensayo estuvo conformado por 16 tratamientos, resultantes de la combinación de 4 dosis (1 000,100,10 y 1 ppm) y 4 fungicidas inhibidores de la formación de la beta-tubulina (benomyl, carbendazim, tiabendazol, y metil tiofanato), las dosis se incorporaron asépticamente por separado en cada frasco con PDA autoclavado (120 °C/15minutos). En cada caja de Petri se añadió los discos con crecimiento miceliar de S. rolfsii de 5 días de crecimiento, en el centro de la caja, finalmente se las embaló y rotuló en la parte superior, se almacenaron a temperatura de 27±30 °C.

Se utilizó un diseño al azar (DCA), conformado de 16 tratamientos y 4 repeticiones, teniendo como resultado 64 unidades experimentales. No existe tratamiento testigo, porque el mismo fue usado para realizar la prueba de eficacia, detallada de forma explícita más adelante.

Variables respuestas

Porcentaje de inhibición: se evaluó una vez obtenido el crecimiento radial. Se calculó los valores medios de Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR) con la siguiente fórmula de eficacia de ^{Abbott (1925}).

Dónde: E = eficacia; R1 = diámetro del testigo; R2 = diámetro del tratamiento.

Número de esclerocios: se evaluó a los 40 días después de la siembra, una vez emitidos los esclerocios, se contabilizaron con la ayuda de una pinza metálica en su respectiva unidad experimental.

Viabilidad de esclerocios: en los esclerocios producidos a los 40 días después de la siembra, se clasificaron con tamaño y forma unformes, se procedió a cultivar 10 esclerotes por caja en 10 mL de medio de cultivo PDA para determinar su viabilidad. Se usaron 4 réplicas por cada tratamiento. Se evaluó el desarrollo del micelio (viabilidad) en los esclerocios germinados (esclerocios que produjeron al menos tejido hifal) registrándose cada 24 horas expresado en porcentaje.

Análisis estadístico

Los datos fueron sometidos a análisis de varianza y para realizar las comparaciones múltiples entre las medias se utilizó la prueba de Tukey al 5% de probabilidades de error. Para el análisis de datos se utilizó el software Infostat.

Porcentaje de inhibición

El análisis de varianza de porcentaje de inhibición, a las 24, 48, 72 horas mostró que existen diferencias estadísticas significativas (p = 0.0001) para las fuentes de variación estudiadas; factor fungicidas, dosis y la interacción (Tabla 1). De forma más detallada se puede describir que a las 24 horas, el fungicida benomil y la dosis más alta (1 000 ppm), analizados de forma separada y como interacción presentaron el mayor porcentaje de inhibición de S. rolfsii (62.50%).

Para la evaluación efectuada a las 48 horas, de forma similar a la medición anterior, se destacó benomil para el factor fungicidas y 1 000 ppm en el factor dosis, conjuntamente la interacción dada por estos dos niveles consiguió el mayor porcentaje de inhibición del hongo con 48.14%. Continuando con el último análisis (72 horas), los fungicidas benomil y metil-tiofanato obtuvieron los valores más altos de control con 13.97 y 13.57, respectivamente, al igual que en las descripciones anteriores, la dosis más alta fue más eficaz en la disminución del crecimiento fúngico, a su vez la interacción benomil/1 000 ppm ejerció mayor sensibilidad in vitro en esta evaluación.

Sin embargo, a partir de las 96 horas los fungicidas, dosis y su interacción evaluados son estadísticamente similares para la variable porcentaje de inhibición (Tabla 1). Esto demuestra que los productos fitosanitarios empleados no ejercieron un efecto de control sobre el crecimiento y producción de S. rolfsii en relación al tiempo (Figura 1 y 2). En lo que respecta a el número de esclerocios producidos durante los 40 días después de la siembra, no presentan diferencias significativas. Además, se probó que todos los tratamientos presentan esclerocios viables (100%) (Figura 3).

Tabla 1 Análisis de varianza del PICR y número de esclerocios producidos, a partir de aislados S. rolfsii tratados con fungicidas inhibidores de la formación de la beta-tubulina, a diferentes dosis bajo condiciones in vitro. 

NS = no hay significancia (probabilidad > 0.05); ** alta significancia (probabilidad < 0.05).

Los resultados obtenidos en esta investigación son equivalentes a los ^{De Marcano et al. (2005}), donde el número de esclerocios formados disminuyó en los tratamientos que se utilizó 2 500 ppm de benomyl in vitro. La Tabla 2, muestra la comparación estadística de la actividad inhibitoria de fungicidas sobre S. rolfsii a diferentes concentraciones.

Tabla 2 Comparación estadística de la actividad inhibitoria de fungicidas sobre S. rolfsii a diferentes concentraciones. 

Valores con letras distintas muestran diferencias significativas (p ≤ 0.05).

^{Soto et al. (2011}) y ^{Zhou et al. (2016}), reportan que benomyl es un fungicida sistémico ampliamente utilizado en la agricultura, su acción es interferir en la síntesis de ADN y la mitosis impidiendo así la penetración del micelio y la germinación de esporas. La descripción expuesta demuestra la evidente resistencia de S. rolfsii a benomyl que a pesar de haber inhibido hasta un 62.75% durante las primeras 24 horas; su efectividad disminuyó al pasar los días de evaluación, datos que coinciden con los publicados por ^{Manzo et al. (2012}), que al utilizar el fungicida benomyl en Mycosphaerella fijiensis presenta la capacidad de crecer a una dosis de 10 ppm. Resultados opuestos describen ^{Pérez et al. (2015}) y ^{Tenesaca (2010}), donde reportan que Sclerotium cepivorum muestra sensibilidad a benomyl; y describe a benomyl y metil tiofanato como productos controladores de primer nivel a Sclerotinia sclerotiorum con dosis inferiores a 1 ppm.

Figura 1 Sensibilidad in vitro de fungicidas sobre el crecimiento de S. rolfsii a las 216 horas después de la inoculación a concentración de 1 000ppm: Testigo (A); tratamiento con Benomyl (B); Metil tiofanato (C); Carbendazim (D); Tiabendazol (E). 

Figura 2 Producción de esclerocios a los 40 días de tratamiento en medio de cultivo con fungicidas. Testigo (A); Benomyl 100 ppm (B); Metil tiofanato 1 000 ppm (C); Carbendazim 1 ppm (D); Tiabendazol 1 ppm (E). 

Figura 3 Viabilidad de esclerocios en medio PDA evaluado las 24 horas después de la inoculación. Testigo (A); Benomyl 1 ppm (B); Metil tiofanato 1 ppm (C); Carbendazim 10 ppm (D); Tiabendazol 10 ppm (E). 

Continuando con el análisis, tiabendazol fue el siguiente fungicida más efectivo; además su eficiencia es diferente de benomyl, a 1 000 ppm. El fitopatógeno no es sensible a tiabendazol, únicamente atrasa el crecimiento miceliar y disminuye la producción de esclerotes. Datos opuestos encontró (^{García et al., 2020}) donde este fungicida presenta acción inhibitoria sobre Sclerotinia sclerotiorum en concentraciones inferiores a 1 ppm en condiciones controladas.

De manera similar los fungicidas metil tiofanato y carbendazim dieron como resultado una reducción menor al 40% sobre el crecimiento del fitopatógeno, cuando se usa concentraciones de 1 000, 100, 10 y 1 ppm; desde las 24 horas hasta las 72 horas, en las evaluaciones posteriores (96, 120, 144 y 216 horas) los tratamientos no impidieron el crecimiento del patógeno. Estos resultados coinciden a los reportados por ^{Arce et al. (2019}) quienes determinaron pruebas de sensibilidad a fungicidas benomyl, carbendazim y metil tiofanato sobre Bipolaris sp., Colletotrichum sp. y Mycoleptodiscus sp., aquellos no inhibieron totalmente en el crecimiento de las cepas evaluadas durante el ensayo; unas con 0% y otras de ellas con porcentajes inferiores a 53%.

Los antifúngicos empleados ejercieron efecto parcial de inhibición a las primeras 72 horas, luego de esto ningún benzimidazol (benomyl, carbendazim y tiabendazol) o tiofanato, impidió el crecimiento de Sclerotium rolfsii durante el ensayo. Según FRAC (2019), a pesar de que los benzimdazoles, específicamente interfieren en el ensamblaje de b-tubulina en el proceso de la mitosis, este grupo presenta riesgos elevados de forjar resistencia por varias especies de fitopatógenos incluso dentro de la misma (^{Nocua-Báez et al., 2020}), el control de la resistencia está establecido por el riesgo específico del fungicida, hongo y cultivo. ^{McGrath (2004}), afirma que al utilizar fungicidas con alteraciones en dosis y consecutivas aplicaciones el hongo fitopatógeno desarrolla resistencia.

Tal como ha sido observado en los datos obtenidos en este estudio, la resistencia de diferentes hongos a fungicidas que afectan la división celular y la mitosis (benzimidazoles y tiofanatos) no es un hecho aislado, que ha sido relatado desde hace mucho tiempo hasta la actualidad (González et al., 2022; ^{Sun 2010}; ^{Koenraadt et al., 1992}), por ejemplo, aislados de Venturia y Dydimella han demostrado resistencia frente al fungicida benomil, asociada a mutaciones genéticas en el gen de la β-tubulina (Koenraadt et al., 1992), sin embargo no es el único caso de fitosanitarios dentro de este grupo químico que presenta casos de resistencia; aislados de Botrytis cinerea obtenidos a partir de cereales y Giberella zeae proveniente de trigo, demostraron ser resistentes al carbendazim en diferentes ensayos de sensibilidad realizados (^{Myresiotis et al., 2007}; ^{Qiu et al., 2012}).

Otra de las moléculas que no consiguió inhibir el crecimiento de Sclerotium rolfsii en este ensayo bajo condiciones in vitro fue el tiabendazol, casos similares han sido relatados por (^{Baraldi et al., 2003}), que indican adicionado al medio de cultivo y que al analizarse molecularmente las secuencias se reportan mutaciones en el gen de la beta-tubulina (^{Cabañas et al., 2009}).

De la misa forma, al realizar un análisis minucioso de lo acontecido en base a los casos de resistencia a que aislados de Penicillium expansum fueron resistentes a altas concentraciones de tiabendazol fungicidas en hongos, se puede enfatizar que se han encontrado aislados de Colletotrichum spp. con niveles de resistencia, desde moderada a alta al fungicida metil-tiofanato y que esta resistencia está asociada a mutaciones en el gen de la beta-tubulina (^{Vieira et al., 2017}; ^{Wu et al., 2022}); a su vez, en un estudio desarrollado en California con aislados de Botrytis cinerea provenientes de uva, pistacho y granada, revelan que existe un cambio del ácido glutámico por alanina en la posición 198 en las secuencias de β- tubulina (^{Avenot et al., 2020}). También, en esta misma posición de la β-tubulina, aislados de Colletotrichum siamense sufrieron modificaciones y su crecimiento fue inhibido en más del 50%, con dosis de 100 µg ml^-1 (^{Hu et al., 2015}).

La aplicación de fungicidas es la estragia más utilizada para controlar la podedumbre del tallo (^{Behiry et al., 2022}), sin embargo el uso intensivo de estos, especialmente los que son específicos en su modo de acción, pueden seleccionar aislados resistentes (^{Toda et al., 2021}) y generar mutaciones que ocasiona la resistencia de benzimidazoles (^{Appiah et al., 2023}), una vez que se desarrolla resistencia a un fungicida específico, existe la posibilidad de que se produzca resistencia cruzada entre todos los miembros del mismo grupo de fungicidas (^{Brent, 1995}).

El benomil, la carbendazim, el tiabendazol y el tiofanato-metil, fueron los primeros fungicidas sistémicos de sitio único y la primera clase química afectada por la rápida evolución de la resistencia (^{Hawkins y Fraaije, 2016}), en consecuencia causa fallos en el control de enfermedades. La diversidad genética del fitopatógeno es uno de los factores que hacen ineficiente a los fungicidas químicos (González et al., 2022). Los hongos fitopatógenos están experimentando cambios sustanciales como resultado de nuevos hallazgos, pocas especies identificadas se ha evaluado mediante metodologías de genética molecular, y algunas regiones siguen dependiendo de una taxonomía obsoleta. Además, S. rolfsii parece estar expandiendo rápidamente su distribución geográfica, probablemente como resultado del cambio climático, lo que provoca alteraciones genéticas y cambios en las redes huésped-patógeno establecidas desde hace tiempo. Esto se refleja en el hecho de que se están descubriendo nuevos patógenos en leguminosas que previamente se sabía que causaban enfermedades en esa especie. S. rolfsii se ha encontrado recientemente en frijol mungo, causando la enfermedad del tizón sureño (^{Patra et al., 2023}). Por lo tanto, la evolución de la resistencia a los fungicidas se ha convertido en una preocupación significativa a nivel mundial (^{Wang, 2022}). De aquí la importancia del empleo de enfoques novedosos y amigables con el ambiente para controlar enfermedades en las plantas, mitigar pérdidas y garantizar una producción alimentaria segura.

Los mecanismos detrás de los resultados observados aún deben evaluarse, bajo condiciones de campo para demostrar firmemente que los benzimidazoles evaluados no tienen efecto sobre el fitopatógeno. Este estudio amplía conocimiento sobre el impacto de los fungicidas sobre Sclerotium rolfsii y abre nuevas vías para la gestión razonada del uso de fungicidas en el control de hongos fitopatógenos, limitando al mismo tiempo su impacto. También muestra las estrategias de supervivencia de las colonias de hongos en condiciones controladas.