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INTRODUCCIÓN
La zona andina de Bolivia, es una región que presenta altos riegos en la producción agrícola debido a factores abióticos (sequias, heladas, granizadas) y bióticos (malezas, plagas y enfermedades). Entre los factores bióticos, los insectos plagas se constituyen en uno de los principales problemas ocasionando reducciones en el rendimiento agrícola de los cultivos. La medida de control depende de los insecticidas químicos, los cuales representan un costo, además tienen efectos nocivos en la salud humana, animales y el ambiente, así como la generación de resistencia de los insectos plaga.
Una forma de reducir los productos químicos, es mediante el uso de hongos entomopatógenos (Urra, 2015), los cuales regulan poblaciones de insectos plaga en diversos ecosistemas mediante epizootias (Valle et al., 2022). Estos hongos son la capacidad de renovar inoculo sobre insectos muertos, establecerse en forma permanente en el suelo y no inducen la aparición de resistencia (Alves, 2003 citado por Mandujano, 2015), a diferencia de los agroquímicos (Sepúlveda, 2017), siendo una opción frente al control químico de insectos (Bautista et al., 2018). Los principales géneros de hongos que se utilizan en la agricultura son: Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces y Verticillium (Rodríguez, 2017), controlando plagas en una amplia variedad de cultivos (García et al., 2019).
Las especies del género Beauveria más estudiados y utilizados en el control de insectos plaga son B. bassiana y B. brongniartii (Bustillo, 2001). B. brongniartii (Saccardo) Petch, tiene actividad patogénica sobre diversos ordenes de insectos, con amplia distribución en el agroecosistema andino, sobre los 2 800 m s.n.m., donde las bajas temperaturas prevalecen (Alcázar et al., 2003), sin riesgo para humanos y animales (Cova et al., 2009), siendo una alternativa para el control de insectos plaga (Vargas, 2003), presenta dos fases en su desarrollo, una saprofítica, viviendo sobre materia en descomposición y otra parasítica, infectando a insectos (Vera, 1996), considerado seguro para el ambiente (Cova et al., 2009).
El control biológico de plagas con hongos entomopatógenos depende de la producción del inóculo para su aplicación en campo, la selección de cepas o aislados con alta virulencia, el buen desarrollo, la esporulación y la resistencia a condiciones ambientales adversas (García et al., 2015 citado por Valle et al., 2022). Al buscar agentes de control biológico, una estrategia básica es investigar los enemigos naturales nativos, antes de introducir agentes exóticos (García et al., 2011). Existe reportes de hongos entomopatógenos nativos en el altiplano boliviano, entre ellos Beauveria sp (Rojas, 2014; Rojas et al., 2017), sin embargo, los estudios en este campo son escasos (Pacasa, 2018), donde aislamientos nativos de B. brongniartii no han sido obtenidos ni evaluados en esta región. La variabilidad intraespecífica en los hongos entomopatógenos en cuanto a rango de hospederos, características fisiológicas y virulencia (Ayala et al., 2005 citado por Gerónimo et al., 2016) hacen necesario la caracterización para seleccionar hongos con los mejores atributos como reguladores de plagas (Valle et al., 2022).
Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue la caracterización morfológica y fisiológica de aislamientos nativos de B. brongniartii in vitro a partir de insectos infectados en campo, en la Estación Experimental Choquenaira, Viacha - Bolivia. Bajo estas consideraciones los objetivos específicos del estudio fueron: a) Aislar los aislamientos nativos del hongo a partir de insectos parasitados en campo, b) Caracterizar a nivel morfológico los aislamientos obtenidos, c) Caracterizar fisiológicamente los aislamientos nativos del hongo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación de la zona de estudio
El estudio se realizó en el laboratorio de entomopatógenos de la Estación Experimental Choquenaira (EECH) dependiente de la Facultad de Agronomía de la Universidad Mayor de San Andrés (UMSA); ubicado en el Distrito 3 del municipio de Viacha, provincia Ingavi del departamento de La Paz, Bolivia. Geográficamente situado a 16º 42' 05'' de Latitud Sur y 68º 15' 15'' de Longitud Oeste, a una altura de 3 870 m s.n.m., con una precipitación pluvial media de 473 mm año-1, la temperatura media anual de 16.52 ºC, una humedad relativa de 66.93 %, la evapotranspiración aproximada de 1 050 mm año-1 y la velocidad del viento que oscila de 13.5 a 17 km h-1 (Flores, 2012; EECH, 2021).
Metodología
El presente estudio se realizó en dos fases (Figura 1). La fase de campo, con la búsqueda y colecta de insectos infectados por B. brongniartii de los suelos de los cultivos agrícola forrajeros de la EECH. La fase de laboratorio, se desarrolló mediante protocolos, con la reactivación, aislado, purificación y caracterización morfológica y fisiológica de colonias de aislamientos nativos del hongo en el laboratorio de entomopatógenos de la EECH, con el uso de equipos, materiales, reactivos y otros.
Fase de campo: recolección de insectos infectados por el hongo B. brongniartii
Con el método de captura de Castillo (2012) mediante muestreo dirigido se obtuvo los aislamientos nativos del hongo a partir insectos infectados, con características de crecimiento fungoso de color blanco (micelio y esporulación) (Cañedo y Ames, 2004), denotando su capacidad patogénica natural (Vega y Kaya, 2012). La colecta de insectos infectados se realizó en la EECH, en época húmeda y seca (febrero a junio del 2022), en suelos de los cultivos de papa (Solanum sp), avena forrajera (Avena sativa) y cebada forrajera (Hordeum vulgare). El material biológico se colecto en viales, etiquetándose (lugar, fecha, tipo de insecto) y llevándose al laboratorio de entomopatógenos de la EECH, para su procesamiento.
Fase de laboratorio: reactivación, aislado y purificación de aislamientos
Bajo la metodología de Gerónimo et al. (2016), con algunas modificaciones. Los insectos colectados se desinfestaron con hipoclorito de sodio (X.5) al 5.5 % por tres minutos, eliminando el exceso de hipoclorito con el lavado triple en Agua Destilada Estéril (ADE), y se colocaron sobre papel toalla estéril para quitar el exceso de humedad. Se depositaron los insectos en cámaras húmedas preparadas (90 % HR) a 18±2 °C, durante 12 días, para la reactivación del hongo con nueva esporulación sobre los insectos.
Con la metodología de Villamil (2015), a partir de los insectos reactivados, bajo la técnica de aislado directo, se multiplico los aislamientos del hongo (conidias y micelio), en cajas Petri (CP) con medio de cultivo Saboraud Dextrosa Agar (SDA) esterilizado en autoclave a 121 °C, durante 30 minutos. Las CP se rotularon e incubaron por 20 días a 18±2 °C, observando el desarrollo del hongo y la presencia de contaminantes saprofitos (Aspergillus sp., Penicillum sp). Se realizó de dos a tres resiembras de los aislamientos en medio SDA, obteniendo colonias puras, los cuales se sellaron con cinta Parafilm, rotulándose y conservándose en refrigeración (4 °C), para su uso posterior en las diferentes pruebas de caracterización.
Caracterización morfológica
- Características macroscópicas: En la identificación macroscópica del hongo se utilizó la metodología de observación con la ayuda de claves y descriptores morfológicos (Cañedo y Ames, 2004). En el proceso de producción de aislamientos del hongo en medio de cultivo SDA, se observaron a simple vista las características de las colonias en: crecimiento, aspecto, color, superficie, pigmentación y formación de sinemas del hongo.
- Características microscópicas: La identificación microscópica del hongo se basó en la observación de estructuras reproductivas (Barnett y Hunter, 1998; Humber, 2012). Después de la obtención de aislamientos, en una lámina portaobjetos se colocó una gota de colorante policrómico, y con la ayuda del asa de platino se raso una parte de la colonia del hongo, lo cual se dispersó sobre la gota del colorante, y se colocó el cubreobjetos. Se observó en microscopio (Olympus), identificando las estructuras del hongo: conidióforos, fiálides, raquis y conidias.
Se determinó el género y especie de los aislamientos obtenidos.
Caracterización fisiológica
- Crecimiento radial y tasa diaria de crecimiento radial: Se empleo la metodología de Vélez et al. (2000), con algunas modificaciones. Se preparo una solución fúngica de 1 x 107 c.ml-1 en base a conteo realizado en la cámara de Neubauer, y con una micropipeta se inoculo 5 µL al centro de la CP con medio de cultivo SDA, incubándose a 18±2 °C, por 20 días en ausencia de luz. Con un Vernier digital se midió a diario el crecimiento radial de las colonias por el reverso de la CP en dirección vertical y horizontal. Para el análisis se consideró la tasa diaria de crecimiento radial (TDCR), empleando el DCA con 4 repeticiones, cada CP represento una unidad experimental. Se aplico la formula modificada de Vela et al. (2018), para velocidad de crecimiento radial:
Donde: V = velocidad de crecimiento radial; X = radio de la colonia en milímetros; T = tiempo en días de ensayo.
- Producción de conidias: Se utilizó la metodología propuesta por Gerónimo et al. (2016), con alguna modificación. A los aislamientos en CP con medio SDA con 20 días de incubación, se agregó 10 ml de ADE y Gomax al 1 %, lavándose cada colonia con la ayuda de un hisopo estéril. Para determinar la concentración de conidias se tomó 1 ml de la solución madre obtenida de cada aislamiento y se realizó diluciones seriadas con un factor de dilución de 0.1, en tubos de ensayo con 9 ml de ADE (101, 102, 103, 10n). El conteo de conidias se realizó en la cámara de Neubauer utilizando un microscopio (objetivo 40x), eligiendo la dilución adecuada (10 a 50 conidias. cuadrante-1). Se utilizo el DCA con 4 repeticiones, la suspensión conidial de cada CP represento una unidad experimental, considerando el promedio de 6 lecturas para cada repetición. La concentración de conidias se estimó con:
Dónde: C = concentración que se desea conocer (c ml-1); N = número promedio de conidias por cuadrante; D = dilución empleada; F = factor de cámara.
- Prueba de viabilidad: Para evaluar la viabilidad de conidias se utilizó la metodología propuesta por Malpartida et al. (2013), con algunas modificaciones. Se preparó en CP 10 ml del medio SDA, marcando en la superficie externa inferior 5 puntos, donde se inoculó 2 μL de una suspensión ajustada de 1 x 107 c ml-1, incubándose a 18±2 ºC por 24 horas. Se añadió una gota de colorante policrómico a cada alícuota para la tinción de la germinación, luego se cortó y pego las alícuotas en portaobjetos con alcohol etílico al 96 %. En un microscopio se contó por punto las conidias germinadas del total presente, considerando conidia germinada, el que presenta la longitud del tubo germinativo al menos al tamaño de la conidia. Se utilizó el DCA, el valor promedio de los 5 puntos representó la tasa de germinación (%) de una unidad experimental. El porcentaje de germinación se calculó mediante:
Tipo de investigación
El estudio es de carácter descriptivo, por el uso de técnicas en la toma, recepción y procesamiento de datos, asociando las variables e identificando las características y conductas propias del problema del estudio, es exploratorio porque se da a conocer las características del hongo nativo B. brongniartii (aislamientos) en este agroecosistema a partir de insectos infectados recolectados en predios agrícolas de la EECH.
Variables de estudio
- Características morfológicas: descripción macroscópica de colonias (crecimiento, aspecto, color, superficie, pigmentación y formación de sinemas) y descripción microscópica (forma de hifas, conidióforos, fiálides, raquis, conidias y genero).
- Características fisiológicas: evaluación del crecimiento radial (mm) y tasa de crecimiento diario de colonias (mm dia-1), la producción conidial (c ml-1) y la viabilidad de conidias (porcentaje de germinación).
Análisis estadístico
Para el análisis de caracterización morfológica de aislamientos nativos del hongo se utilizó la estadística descriptiva, y para la caracterización fisiológica se realizó un análisis de varianza (ANVA) de un solo factor, determinando el coeficiente de variación de los ensayos y la comparación de medias de los aislamientos con la prueba de rangos múltiples Duncan (p < 0.05) (Peñafiel, 2020), utilizando el software Microsoft Office Excel 2010 versión en español.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamientos obtenidos del hongo B. brongniartii
Con las búsquedas realizadas en los predios agrícolas de la EECH, se logró colectar especies de insectos parasitados (larvas y adultos) con el hongo en forma natural, obteniendo a través de su proceso de reactivación, aislado y purificación cinco aislamientos nativos del hongo entomopatógeno B. brongniartii, provenientes de suelos de los cultivos de papa, avena forrajera y cebada forrajera, tomando un periodo de cinco meses (febrero a junio del 2022), codificados según su origen (Tabla 1).
Tabla 1 Aislamientos de B. brongniartii obtenidos a partir de insectos infectados en campo.
Se utilizaron en el presente estudio, aislados del hongo a partir de insectos colectados en el cultivo de la papa.
Figura 2. Insectos infectados por B. brongniartii en campo: gallina ciega (A), gorgojo de los andes (B), gorgojo del follaje de papa (C), merilido rayado (D), escarabajo de suelo (E).
Con la obtención de los aislamientos se confirma la presencia del hongo nativo B. brongniartii en esta región del altiplano a 3 873 m s.n.m., denotando su capacidad de adaptación a las condiciones climáticas adversas (alta radiación, baja humedad y temperatura), coincidiendo con Rojas et al. (2017), evidenciando el amplio rango de hospederos del hongo con la parasitación natural de diferentes insectos, concordando con Alcázar et al. (2003) y Vargas (2003), su especificidad de control sobre insectos coleópteros, corroborado por Zenner y Posada (1992), siendo un factor fundamental la presencia de especies de insectos en la región para el desarrollo y multiplicación del hongo. Destacar la presencia natural del hongo en cultivos de importancia como la papa, parasitando insectos plagas clave y ocasionales, validando lo descrito por Narrea y Malpartida (2006), Alcázar et al. (2003). Para estudios de caracterización patogénica, los aislamientos obtenidos son una alternativa manejable por su tolerancia a las condiciones climáticas de la zona (García et al., 2011).
Análisis de caracterización morfológica del hongo
Morfología macroscópica de los aislamientos
Las características macroscópicas de los aislamientos obtenidos varían (Tabla 2), presentando colonias de Crecimiento circular moderado con bordes definidos e irregular ancho lobulado; aspecto algodonoso y pulverulento; color, blanco, crema a café claro - oscuro (centro y anillos posteriores), bordes blancos, al reverso naranja claro - oscuro, amarillo naranja, amarillo a verde claro - oscuro (centro y anillos posteriores) y borde blanco; Superficie elevada, pulvinada a elevada y umbonada a elevada (centro y anillos); Pigmentación, sin difusión al medio; Sinemas, con y sin formación. Lo cual coincide y difiere con las características descritas por Vargas (2003), Pariona et al. (2007) y Rojas et al. (2017), al caracterizar cepas y aislamientos del hongo B. brongniartii.
Figura 3. Morfología macroscópica de aislados en cultivo SDA, vistas de anverso (arriba) y reverso (abajo): gallina ciega (A), gorgojo de los andes (B), gorgojo del follaje (C), merilido rayado (D), escarabajo de suelo (E).
Morfología microscópica de los aislamientos
Las características microscópicas de los aislamientos estudiados coinciden con las claves taxonómicas de Barnett y Hunter (1998); Humber (2012). Las características observadas en las estructuras reproductivas de los aislamientos (Tabla 3), presentaron: hifas septadas, hialinas y lisas, con células conidióforas y/o conidiogénica sencillos, formando racimos irregularmente densos, formada desde una base hinchada y adelgazadas en el ápice (Fiálide subglobosa), con raquis largo bien desarrollado, geniculado o curvado, denticulado (forma de zig - zag), produciéndose las conidias en cada punto de flexión. Las conidias de carácter hialino, globoso a elipsoidal, lisas, unicelulares y grandes; cuyas características corresponden a la especie B. brongniartii, tal como lo describen Vargas (2003); Bravo (2017), Pariona et al. (2007) y Rojas et al. (2017), encontrando diferencias con la especie B. bassiana.
Figura 4. Características morfológicas microscópicas de B. brongniartii (estructuras reproductivas).
Análisis de la caracterización fisiológica de aislamientos
Evaluación de crecimiento radial y la tasa diaria de crecimiento radial (TDCR)
El ANVA (Tabla 4) de la tasa diaria de crecimiento radial (TDCR) de colonias de aislamientos nativos, no presentaron diferencias significativas, manifestando un desarrollo regular expansivo y homogéneo (circular), directamente proporcional con el tiempo, distinguiendo desde su centro una fase de crecimiento inicial, seguido de una fase de crecimiento acelerado y finalizando con un crecimiento lento.
Tabla 4 ANVA de la tasa diaria de crecimiento radial de aislados.
Coeficiente de variación (CV): 4.75%.
El crecimiento radial de los aislamientos (Tabla 5), bajo la siembra fúngica de 1 x 107 c ml-1, en medio SDA, durante 20 días a 18 ºC, manifestó una longitud de crecimiento radial promedio que varío de 35.55±1.17 mm (diámetro menor) a 39.20±2.27 mm (diámetro mayor), y la TDCR que vario de 1.78±0.06 mm día-1 (menor velocidad) a 1.96±0.11 mm día-1 (mayor velocidad).
Figura 5. Crecimiento radial de aislamientos de B. brongniartii en medio SDA: gallina ciega (A), gorgojo de los andes (B), gorgojo del follaje (C), merilido rayado (D), escarabajo de suelo (E).
Los resultados obtenidos de crecimiento radial y TDCR en los aislamientos son superiores a lo reportado por Narrea y Malpartida (2006), quienes obtuvieron valores de 57, 58, 62 y 65 mm de crecimiento diametral y 1.91, 1.93, 1.94 y 2.05 mm día-1 de tasa de crecimiento diario, al evaluar cuatro cepas de B. brongniartii sobre SDA, durante 30 días a 20 °C; asimismo, son superiores a lo obtenido por Arcoccaulla (2020), con valores de 38 mm y 2.5 mm día-1 de longitud diametral y tasa de crecimiento diario, al evaluar diferentes aislamientos de hongos entomopatógenos sobre PDA, en 15 días; no obstante, se aproxima a la TDCR obtenido por Vargas (2003), con valores de 1.79, 1.69 y 1.83 mm día-1, en tres cepas de B. brongniartii sobre PDA, en 15 días a 22 °C. El crecimiento del hongo es variable y depende de varios factores, tales como el material biológico empleado (tipo de cepas y/o aislamientos), método de producción (medios de cultivo, siembra, incubación) y climáticos (temperatura, humedad) (Espinoza y Vallejos, 2016).
Evaluación de producción de conidias (conidiación)
El ANVA de la producción de conidias (Tabla 6) presento diferencias significativas, determinando la variabilidad de los aislamientos del hongo entomopatógeno, con heterogeneidad de conidiación sobre el medio de cultivo SDA, a los 20 días de incubación a una temperatura de 18±2 °C. El coeficiente de variación de 13.13 % indica que hubo precisión en el ensayo por estar en el rango de aceptación y no presentar dispersión con respecto a la media.
En la producción de conidias (Tabla 7), el aislamiento Bbr5 mostro el valor más alto con 5.95 x 107 c ml-1, siendo significativamente superior a los otros aislamientos; a su vez, los aislamientos Bbr4, Bbr1 y Bbr2 revelan una producción intermedia de conidias con valores de 4.78 x 107, 4.38 x 107 y 4.18 x 107 c ml-1, sin diferencias significativas entre ellas; y finalmente el aislamiento Bbr3 presenta el valor más bajo de conidiación con 2.59 x 107 c ml-1, siendo significativamente inferior a los demás aislamientos.
Los resultados obtenidos de conidiación en los aislamientos, son inferiores a la producción obtenida por Vargas (2003), con valores de 2.10 x 108, 12.70 x 107 y 9.25 x 107 c ml-1 al caracterizar 3 cepas de B. brongniartii en medio PDA, a los 15 días, a 22 °C. A su vez, la conidiación obtenida en los aislamientos son superiores a los encontrados por Narrea y Malpartida (2006), con esporulaciones que variaron de 1.95 x 107 a 2.04 x 107 c ml-1, al evaluar cuatro cepas de B. brongniartii en medio SDA, durante 15 días a 20 °C.
La producción de conidias depende del medio de cultivo, respondiendo los aislamientos mejor a un cultivo que a otro (SDA, PDA, AN, arroz, etc.), debido a los nutrientes que lo conforman (Narváez et al., 1997 citado por Flores, 2009). La selección de aislamientos con potencial genético en la producción de conidias es primordial para la producción a escala comercial de hongos entomopatógenos (Torres et al., 2013), una alta producción de conidias hace más viable su comercialización, reduciendo los costos de ejecución en campo (García et al., 2012), siendo la producción masiva de conidias uno de los aspectos más importantes en los programas de control biológico (Castro et al., 2013).
Evaluación de viabilidad de conidias
El ANVA (Tabla 8) no presentó diferencias significativas para esta variable, indicando similitud en sus porcentajes de germinación de conidias (viabilidad), no permitiendo establecer diferencias entre los aislamientos estudiados, en medio SDA hasta las 24 horas a 18 °C.
La germinación de conidias de los aislamientos estudiados (Tabla 9) oscilaron de 90.40 a 94.20 %, siendo inferiores a los obtenidos por Vargas (2003) con germinación de 95.40, 99.07 y 99.74 % en tres cepas de B. brongniartii en medio PDA, a 24 horas, a 22 °C, también inferior a lo obtenido por Mandujano (2015), con la germinación de 98.84 % a las 18 horas en medio PDA. Asimismo, los resultados se aproximan a lo obtenido por Pariona (2006), con germinación de 92.50, 94.10, 94.70 y 95.40 % en cepas de Beauveria sp en medio Agar Saboraud Glucosa (ASG), a las 18 horas a 20 °C. La germinación de conidias difiere y se aproxima a otros estudios, dependiendo de varios factores, sin embargo, para Tanada y Kaya (1993) citados por Alean (2003), la germinación de conidias en gran parte depende de la humedad ambiental y temperatura y en menor grado de las condiciones de luz y nutricionales.
La germinación obtenida (> 90 %) supera el parámetro de comparación de 85% (Marín, 1994 citado por Poma, 2011), denotando la buena calidad biológica de los aislamientos estudiados, coincidiendo con los requisitos para el control de calidad de hongos entomopatógenos (Gómez, 1998 citado por Pariona et al., 2007), siendo una característica deseable, debido a que las conidias deben presentar un rápido desarrollo del tubo germinativo, para acelerar el proceso infectivo y disminuir el tiempo de exposición a factores ambientales adversos de campo (Toscano y Yucailla, 2018), la calidad del inoculo de un hongo entomopatógeno se relaciona con la viabilidad de conidias generando variabilidad en las respuestas de patogenicidad sobre el hospedero (Lazo, 1990 citado por Flores, 2009), sin embargo con los datos obtenidos, no se puede deducir cuál de los aislamientos nativos presentan mayor patogenicidad y/o virulencia, lo cual se evidenciara más adelante con estudios de caracterización patogénica sobre insectos plaga en la región.
Figura 6. Conidias de B. brongniartii: Sin germinar y germinadas hasta las 24 horas.
CONCLUSIONES
Se obtuvo cinco aislamientos nativos de B. brongniartii en esta región del altiplano (3873 m s.n.m.), a partir de insectos infectados, colectados en campo en la EECH, denotando su capacidad de adaptación a las condiciones climáticas adversas, su amplio rango de hospederos, con especificidad de control de insectos coleópteros, la presencia del hongo en cultivos de importancia como la papa controlando plagas claves y ocasionales.
Los aislamientos obtenidos presentaron características morfológicas variables en: crecimiento, aspecto, color, superficie, pigmentación y formación de sinemas; con similitud en estructuras reproductivas de hifas, conidióforos, fiálides y raquis, con diferencia en la forma de conidias (globosas y ovoides), correspondiendo a la especie B. brongniartii.
En las características fisiológicas los aislamientos manifestaron similitud estadística en crecimiento radial y en la TDCR con valores de 35.55 a 39.20 mm y 1.78 a 1.96 mm dia-1, asimismo, similitud en viabilidad de conidias con valores de germinación de 90.40 a 93 %. La producción de conidias presentaron diferencias significativas con valores de 2.59 x 107 a 5.95 x 107 c ml-1 en los aislados Bbr3 y Bbr5 respectivamente.
La caracterización de aislamientos nativos de B. brongniartii a partir de diferentes insectos infectados en condiciones de laboratorio, aportan resultados positivos, confirmando el potencial de la especie para la obtención de cepas promisorias en un futuro inmediato para el control biológico de plagas en la región.
