Ubicación de la zona de estudio

Los trabajos fueron realizados en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Agronómicas y Veterinarias de la Universidad Autónoma de Santo Domingo (UASD), Engombe, Santo Domingo Oeste, con las coordenadas geográficas 18.461164 N -69.997392 W. El estudio fue realizado en el período 23 agosto al siete de septiembre de 2019 (14 días).

Metodología

Colección de muestras y aislamiento del hongo

Para el ensayo se aisló el hongo causante de la Sigatoka negra de muestras de hojas de banano orgánico procedentes de plantaciones de la Línea Noroeste, República Dominicana. El material vegetal para muestrear debía mostrar síntomas de la enfermedad (Figura 1). Las hojas fueron cortadas con cuchillo de metal, luego fueron envueltas en papel, depositadas en bolsas de plástico, almacenadas en una nevera portátil y luego, trasladadas al laboratorio.

Figura 1 Hoja de banano con síntomas de la enfermedad Sigatoka negra (Izq.) y estrías o rayas negras las de las cuales se aisló el hongo (Der.) 

En el laboratorio, las hojas con síntomas de la enfermedad fueron limpiadas con papel toalla estéril (no desinfectadas), cortadas en trozos pequeños y se sembraron directamente en medio de cultivo Agar- agua (AA) en placas de Petri, se incubaron por 24 horas a temperatura ± 24 °C, según la metodología descrita por ^{Conde-Ferráez et al. (2008}). A las 24 horas posteriores a la siembra, se revisaron las placas Petri con una lupa estereoscópica, donde se seleccionaron las estructuras monospóricas del crecimiento fúngico. Estas fueron transferidas a medio de Papa Dextrosa Agar (PDA) e incubadas por 21 días, esto debido al lento crecimiento del hongo Conde- Ferráez et al. (2008). Luego de la obtención de las colonias del hongo, este fue multiplicado en PDA y conservado para su posterior uso.

Identificación de Mycosphaerella fijiensis Morelet

Una vez crecidas las estructuras derivadas de los cultivos monospóricos, se utilizó este crecimiento para su identificación morfológica usando un microscopio compuesto. Similar procedimiento fue usado para los micelios y esporas. Luego, se realizó la extracción ácidos desoxirribonucleicos (ADN) del crecimiento fúngico. El hongo fue identificado mediante PCR, amplificando la región ITS (del inglés Internal transcribed spacer) del gen 18S del ADN (Pérez- Martínez, 2013). El procedimiento incluyó, colocar el hongo en medio PDA por 21 días, una vez crecida la masa micelial fue recolectada en tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. La extracción de ADN se realizó usando el kit de extracción QIAGEN, según el procedimiento sugerido por el fabricante QIAGEN. Para la amplificación del ADN por medio de PCR se usaron iniciadores que amplifican dos regiones del genoma de la especie M. fijiensis (^{Johanson y Jeger, 1993}; ^{Arzanlou et al., 2007}) y los mismos fueron sintetizados por Invitrogen, en los Estados Unidos (Tabla 1).

Tabla 1 Iniciadores elaborados a partir de secuencias conocidas para la identificación del hongo. 

Se usaron dos ciclos para la amplificación en PCR: ciclo termal inicial de 94 ºC durante 3 min, seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 1 min y 65 ºC a un 1 min; extensión a 72 ºC por 2 min; y finalizando una extensión de 72 ºC por 5 min. Con los iniciadores MFactF y ACTR se amplifica una banda de fragmento de ADN entre 300-500 pb (^{Arzanlou et al., 2007}) y con los pares MF137 y R635 entre 1 000-1 500 pb (^{Johanson y Jeger, 1993}).

Los fragmentos amplificados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1 % (^{Checa, 2017}) con modificaciones, usando 4 μl de bromuro de etidio y sumergidos en buffer TBE 1X. En la comparación de tamaño de los fragmentos se empleó un marcador de peso molecular de100 pares de bases (pb) DNA Ladder de Invitrogen. El voltaje usado fue de 80 durante una hora. La visualización de los fragmentos se realizó por irradiación con luz UV.

Cultivos duales con bacterias PGPRs y el hongo aislado

Para los ensayos in vitro del control de crecimiento del hongo aislado, en la investigación se usaron cepas de bacterias PGPRs aisladas de raíces de plantaciones de banano orgánico de la República Dominicana (^{Marcano, 2014}), la identificación, procedencia y características PGPRs de las cepas se describen en la Tabla 2.

En la preparación del inoculo del hongo, se utilizó el procedimiento descrito por ^{Leiva-Mora et al. (2010}), con modificaciones. Se puso el hongo a crecer en medio PDA durante 14 días a 28 °C, pasado el tiempo se preparó una suspensión micelial en agua destilada estéril con las colonias crecidas a una concentración aproximada de 1x105 fragmentos de micelio por mililitro (FM ml), de esta suspensión se tomaron 5 ml y se vertieron en Erlenmeyers de 250 ml conteniendo 100 ml caldo de cultivo de papa y Dextrosa (PDB) y se incubó durante 14 días más a 28 °C. Este proceso se realizó para una mayor obtención de micelio, ya que el hongo es de crecimiento lento (^{Arzate-Vega et al., 2006}). Agotado este tiempo el hongo se homogenizó en el medio PDB, obteniendo así una mayor cantidad de inóculo líquido con una concentración de aproximadamente 1x105 FM ml.

Tabla 2 Bacterias promotoras del crecimiento vegetal. 

Fuente: ^{Marcano (2014}).

Paralelo al crecimiento del hongo, 48 horas antes de la preparación del inóculo fúngico, las bacterias fueron crecidas en medio TSA por 24 horas a 28 °C, pasado este tiempo fueron resembradas en el centro de una placa Petri, conteniendo medio PDA y se incubaron por 24 horas más a la misma temperatura; ya que, las bacterias también se desarrollan en medio PDA (^{Barquero, 2014}). Crecidas las bacterias en medio PDA se procedió a asperjar toda la superficie de las placas con el inóculo fúngico a razón de 1.5 ml por placa. Se dejó evaporar el exceso de medio PDB de las placas en cabina de flujo laminar y luego se incubaron a 28 °C por 14 días. Se tomaron datos sobre el desarrollo del hongo los 6, 10 y 14 días de establecido el ensayo. Los datos para evaluar este experimento se realizaron de la siguiente manera, si existía un halo de inhibición del crecimiento del hongo en torno a la bacteria se puso un signo positivo (+) si el halo era leve, para moderado (++) y fuerte (+++), (±) para un 50 % y (-) no hubo inhibición del crecimiento.

Análisis estadístico

Se utilizó el Software estadístico: Infostat (2018) para el análisis estadístico de los de datos recopilados en la investigación. Se realizó análisis de conglomerado o dendrograma con los grupos bacterianos que se forman en placa Petri.

Aislamiento de Mycosphaerella sp.

Se visualizó el crecimiento de un micelio de color blanco y apariencia algodonosa en la placa Petri (Figura 2A) y al reverso de esta se mostró un color negro con bordes blancos típicos de la enfermedad causada por Sigatoka negra (Figura 2B).

Figura 2 Crecimiento fúngico Mycosphaerella sp. en placas Petri a ambos lados después de 14 días a 28 ºC: A) crecimiento en la parte superior de las colonias algodonosa del hongo; B) crecimiento negro con bordes blancos del hongo visto desde la base de la placa Petri. 

Las características de color del micelio fueron similares a la descrita por ^{Sepúlveda (2016}). Por otro lado, ^{Martínez-Bolaños et al. (2012}), reporta y describe la forma redondeada para el micelio. El tamaño que presentan las colonias en la figura 2A y 2B, son de aproximadamente 20 días de crecimiento, lo que indica un desarrollo lento, estos resultados coinciden con otros autores, describiendo crecimiento entre 14 y 30 días (^{Manzo-Sánchez, 2001}; Martínez-Bolaños et al., 2012; ^{Arzate-Vega et al., 2006}).

Identificación de Mycosphaerella sp.

Las colonias del hongo identificadas presentaron fragmentos de ADN amplificados los cuales corresponden, según los iniciadores usados, a la especie Mycosphaerella fijiensis. En la Figura 3, en las líneas 3 y 4 se produjo una amplificación de la banda de ADN entre 300-500 pb, estos datos se corresponden a los reportados por ^{Arzanlou et al. (2007}). En las líneas 5 y 6 (Figura 3) con los iniciadores MF137 y R635 se visualiza una banda de AND amplificada entre los 1000-1500 pb que identifican la misma especie, estos resultados son comparables con los documentados por Martínez- Bolaños et al. (2012) y ^{Johanson y Jeger (1993}). Benavides-López (2019), también describe M. fijiensis, identificada con estos marcadores específicos y que en la actualidad es identificada como Pseudocercospora fijiensis.

Figura 3 Gel de agarosa evidenciado los fragmentos de ADN. 1 y 7 marcador de peso molecular de 100 pb, 2: blanco; 3, 4: iniciadores MFactF y ACTR amplificación entre 300-500 pb; 5, 6: iniciadores MF137 y R635 amplificación entre 1 000-1 500 pb, ambos pares de iniciadores son identificadores de la especie M. fijiensis. 

Ensayo in vitro entre bacterias PGPRs y Mycosphaerella fijiensis para la inhibición del crecimiento del hongo

En los primeros seis días de evaluación solo cuatro cepas controlaron el crecimiento de M. fijiensis en las cinco repeticiones (DARA 33, PMB10, MTF12 y MAM11, estas fueron Bacillus licheniformis, Leclercia adecarboxylata, Bacillus safensis y Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum, respectivamente)

Estos resultados se mantuvieron iguales en todas las repeticiones en las lecturas realizadas a los 10 y 14 días (Figura 4 y Tabla 2). Estos resultados corresponden con los reportados por ^{Marcano (2014}), estas cepas tienen el potencial inhibidor del crecimiento del M. fijiensis. Según ^{Chávez (2020}) y ^{Arbeláez (2018}), el uso de las bacterias benéficas y sus diferentes características metabólicas han sido probadas en el control del agente causal de la Sigatoka negra.

Figura 4 Placas Petri con ensayos in vitro entre las bacterias PGPRs y M. fijiensis. a, b y c = cepas mostrando el control del crecimiento de M. fijiensis, a los 6, 10 y 14 días de lectura del ensayo; d, e, y f = cepas de bacterias que no controlan el crecimiento de M. fijiensis, evaluaciones cada 6, 10 y 14 días consecutivamente para todos los casos. 

Tabla 2. Datos del ensayo in vitro de Mycosphaerella fijiensis y bacterias PGPRs a los 6, 10 y 14 días.

En el dendrograma de la Figura 5, se presentan las cuatro cepas bacterianas PGPRs más efectivas en el control de M. fijiensis y la relación con su comportamiento ante dicho hongo. Se formaron tres grupos: un primer grupo con las cepas DARA33 (B. licheniformis), MTF12 (B. safensis) y PMB10 (B. amyloliquefaciens subsp. Plantarum), que muestran un control total para el hongo (Figura 5). Un segundo grupo solo incluye a MAM11 (L. adecarboxylata) con un control medio, y el tercer grupo con 16 cepas que no controlan el crecimiento del hongo (Figura 5).

Figura 5 Dendrograma con los grupos bacterianos que se forman según su control sobre el hongo Mycosphaerella. DARA 33, MTF12, PMB10 (control total); MAM11 (control medio) y resto de las bacterias (no control).