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INTRODUCCIÓN
Bolivia cuenta con importantes poblaciones de cacao (Teobroma cacao) a lo largo de la cuenca amazónica, se establece que hasta el año 2007 se estimaba la existencia de 12 115 ha de cacao silvestre en Bolivia, 2 275 ha del cacao amazónico boliviano cultivado y 6 360 ha de cacao híbrido cultivado o convencional (Espinoza et al., 2014). De la misma manera, se puede decir que, la región productora en las provincias Caranavi y Sud Yungas aportan con la mayor cantidad de grano, representando en 75 % de la producción total. No obstante, en la reciente campaña se verifica un descenso de la producción nacional de cacao de 25.9 % respecto al periodo 2011-2012; de acuerdo a la percepción de los actores, principalmente de las organizaciones de productores y las instituciones de apoyo, los factores que incidieron en el descenso de la producción fueron: en La Paz, particularmente en la provincia Caranavi, la enfermedad conocida como Moniliasis, producida por el hongo Moniliophthora roreri, que durante la gestión 2013 afectó un promedio de 53 % de las plantaciones, con rangos de 30-70% de afectación de acuerdo al área de colonización (Espinoza et al., 2014).
La Moniliasis es un hongo fitopatógeno que ataca la mazorca del cacao siendo uno de los principales factores limitantes, causando pérdidas mayores al 30 %, pero que en muchas localidades alcanzan el 100 %, los efectos devastadores han causado el abandono de miles de hectáreas durante un periodo de casi 200 años, la reciente aparición y agresividad mostrada por el hongo en los dos extremos longitudinales de distribución (México y Perú) indica que esta es muy intensa y expansiva (Phillips, 2012).
El convenio CABI-CATIE ha realizado trabajos sobre el control biológico de monilia utilizando principalmente microorganismos antagonistas como el hongo Trichoderma ssp., que ha tenido resultados prometedores además de una reducción en el gasto económico en comparación con el método químico, lo que hace necesario realizar estudios que permitan entender estos factores y crean la posibilidad de desarrollar nuevas formulaciones en el manejo de estos antagonistas que permitan mejorar la eficiencia en el control de esta enfermedad (Urquillas, 2004).
Los hongos del genero Trichoderma son activos contra una amplia gama de patógenos foliares y del suelo económicamente importantes, y se utilizan exitosamente como bioplaguicidas en aplicaciones tanto en casas de cultivo como campo (González et al., 2011).
Las especies de Trichoderma se caracterizan por presentar un rápido crecimiento, poseer una gran capacidad de esporulación y de adaptación a un amplio rango de suelos agrícolas. Los aislados de Trichoderma son sensibles a diferentes condiciones abióticas medioambientales, temperatura, humedad y nutrientes, si bien su gran adaptabilidad les permite sobrevivir en gran cantidad de hábitats. Estos hongos compiten en la rizósfera de la planta, como endófitos, siendo capaces de colonizar completamente la superficie radicular. Además, penetran en el tejido de la raíz, normalmente hasta la primera o segunda capa de células y sólo los espacios intercelulares.
En la acción bio-controladora de Trichoderma se han descrito en diferentes mecanismos de acción que regulan el desarrollo de los hongos fitopatógenos. Entre estos, los principales son la competencia por el espacio y nutrientes, el micoparasitismo y la antibiosis, que tienen una acción directa frente el hongo fitopatogeno (Infante et al., 2009).
Además, se conoce que Trichoderma presenta otros mecanismos, cuya acción bio-reguladora es de forma indirecta. Entre estos se pueden mencionar los que incitan o inducen mecanismos de defensa fisiológicos y bioquímicos como es la activación en una planta de compuestos relacionados con la resistencia, con la detoxificación de toxinas excretadas por patógenos y la desactivación de encinas durante el proceso de infección; la solubilización de elementos nutritivos, que en su forma original no son accesibles para las plantas, tienen la capacidad además, de crear un ambiente favorable al desarrollo radical lo que aumenta la tolerancia de la planta al estrés (Infante et al., 2009).
Por lo mencionado anteriormente se planteó como objetivo principal evaluar la capacidad antagonista in vitro de dos aislamientos de Trichoderma sobre el fitopatógeno Moniliophthora roreri, el mejor antagonista será evaluado en parcelas de cacao in vivo para ver su nivel de control sobre M. roreri en condiciones medio ambientales naturales, posteriormente comparar la capacidad antagonista de ambas pruebas, en los ambientes propuestos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación de la zona de estudio
La evaluación in vitro se realizó en los laboratorios de Biotecnología de la Estación Experimental Sapecho, región de Alto Beni; y el laboratorio de Fitopatología en la ciudad de La Paz, dependientes de la Facultad de Agronomía, Universidad Mayor de San Andrés (Bolivia). La segunda fase in vivo se desarrolló en parcelas de cacao de la Estación Experimental Sapecho. Ambas fases de investigación pertenecen a la investigación cuantitativa.
Metodología
Fase I
El patógeno Moniliophthora roreri fue aislado de los cultivos de cacao de la Estación Experimental Sapecho, y posteriormente purificado en laboratorio. Las cepas de Trichoderma harziarum y Trichoderma viridae, fueron obtenidas del cepario del laboratorio de Fitopatología de la Universidad Mayor de San Andrés.
La evaluación in vivo utilizó cultivares de cacao altamente susceptibles a los agentes patógenos Moniliophthora roreri, los cuales fueron debidamente identificados por el Ing. Casto Maldonado, Docente Investigador de la Estación Experimental de Sapecho- especialista en el área. Previo a la prueba de antagonismos se refrescaron en crecimiento libre los aislamientos de Trichoderma y Moniliophthora en medio puro PDA donde se monitoreo la velocidad de crecimiento de cada uno dibujándose sobre el envés de la placa una cruz marcando el centro, luego se marca los cuatro radios con una letra. Se inocula el hongo, se incuba hasta observar avance definitivo del hongo y se marcó el punto de avance sobre los cuatro radios marcados en la placa, esto se hizo cada vez que se realizó la medición del incremento del hongo en crecimiento. El ritmo promedio de crecimiento se calcula dividiendo el incremento total por el tiempo (French, 1980).
Una vez conocido el ritmo de crecimiento de todos los microorganismos se procedió a realizar la prueba antagónica in vitro, empleándose un Diseño Completamente al Azar (DCA) con tres repeticiones, La unidad experimental correspondió a una caja Petri con medio PDA. Para las pruebas de enfrentamiento se tomaron discos de 0.5 cm de diámetro obtenidos a partir de propágulos del patógeno (crecimiento libre) y se sembraron en la superficie de las cajas de Petri con PDA, a un centímetro del borde de la caja (Coundom et al., 2002).
Este procedimiento se realizó por triplicado, después de 24 horas de incubación a una temperatura de 28 °C el patógeno Moniliophthora roreri fue sembrado a 1 cm del borde de la caja y en oposición un disco de 0.5 cm de diámetro del antagonista (Coundom et al., 2002). Al igual que en el crecimiento libre se procedió a medir el ritmo de crecimiento esta vez en la prueba dual, en la prueba cuantitativa se empleó la evaluación del potencial inhibitorio micelial. Se calcularon los valores para el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (PICM) según la fórmula:
Dónde: Ma = micelio del fitopatógeno inhibido; Mb = Micelio del fitopatógeno con crecimiento libre.
En la prueba cualitativa se compararon las cepas teniendo en cuenta la capacidad antagónica, de acuerdo con la escala propuesta por Bell et al. (1982) (Tabla 1).
Fase II
Una vez identificado el mejor antagonista de Trichoderma se procedió a la prueba in vivo, bajo un diseño de Bloques Completamente al Azar (DBA), con tres tratamientos y tres repeticiones se procedió a la aplicación de los diferentes tratamientos, se usaron dos mochilas aspersores con motor de 20 litros. Siendo los tratamientos Testigo (T1) aplicación con agua, T2: Dosis de esporas 300 g (108) y T3: Dosis de esporas 200 g (107). Las variables de estudio para de campo in vivo fueron la incidencia y severidad de Moniliophthora roreri sobre las mazorcas del cacao. Evaluados según (French, 1980) como la intensidad de una enfermedad, siendo el grado de daño que esta ejerce sobre un campo de cultivo e incluye dos componentes según Rivera y Wright (2020):
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fase I: Investigación en laboratorio (in vitro)
La velocidad de crecimiento libre de microorganismos los agentes biocontroladores bajo crecimiento libre en medio PDA demostraron tener mayor velocidad de crecimiento llegando a cubrir en su totalidad la caja Petri a los ocho días de inoculado siendo que T. harziarum llego a cubrir la caja Petri con 35.28 cm2, siendo seguido por T. viridae con 30.08 cm2 a los ocho días a una temperatura constante de 28 ºC coincidiendo estos datos con lo mencionado por (Infante et al., 2009) que indica que Trichoderma está biológicamente adaptado una colonización agresiva, abundante esporulación sobre una amplia gana de sustratos, dándole de esta manera una ventaja biológica sobre otros microorganismos antagónicos por lo que puede ejercer así una función de control por la competencia de nutrientes. La velocidad de crecimiento de M. roreri fue significativamente menor ya que al octavo día solo alcanzó un crecimiento de 19.71 cm2 bajo condiciones in vitro. El seguimiento de crecimiento día por día se refleja en la Figura 1.
La prueba dual entre T. harziarum y M. roreri en condiciones in vitro realizada bajo un DCA mostró que desde un principio T. harziarum tomó la ventaja de velocidad de crecimiento, siendo que el primer día de evaluación obtuvo 1.60 cm2 de crecimiento en comparación con M. roreri que logró solamente 0.30 cm2 de crecimiento, al quinto día de evaluación se llegaron a encontrar los microorganismos alcanzando a T. harziarum un crecimiento de 19.70 cm2 y M. roreri obtuvo un crecimiento de 8.16 cm2, posteriormente ambos inhibieron el crecimiento aproximadamente un día para luego continuar el crecimiento T harziarum sobre M. roreri micoparasitandolo invadido totalmente el micelio de T. harziarum sobre M. roreri (Figura 2).
De acuerdo a Suarez y Cabrales (2008), la capacidad antagónica de los aislamientos estudiados aumentó hasta el sexto día, lo que demuestra que el hongo fitopatógeno había dejado de crecer mientras que el hongo antagonista continuaba creciendo hasta invadir totalmente la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno, lo cual es la manifestación microscópica de los procesos de mico parasitismo.
El porcentaje de inhibición del crecimiento del micelio fue medido tomando en cuenta que en cultivo dual M. roreri ha crecido 8.16 cm2, comparado con un crecimiento libre donde ha alcanzado 19.71 cm2, entonces para fines de cálculo se estima que no pudo crecer 11.55 cm2, con estos datos se aplica la fórmula, en donde se encontró que el PICM fue del 58.60 %, con respecto a M. roreri que fue inhibido su crecimiento, tomado en cuenta los datos se comparó con la escala de Bell, donde indica que el nivel de antagonismo es de 1, el antagonista crece totalmente sobre el fitopatógeno (Figura 3).
La prueba dual entre T. viride y M. roreri muestra que en el primer día apenas se notaba una diferencia de crecimiento siendo T. viride de 0.8 cm2, en comparación con M. roreri que fue de 0.2 cm2, con el transcurso de los días esta brecha se fue más notoria, finalmente se encontraron al sexto día T. viride un crecimiento de 18.4 cm2, en comparación con M. roreri que alcanzó un crecimiento de 10.3 cm2 (Figura 4).
El porcentaje de inhibición del crecimiento del micelio fue medido tomando en cuenta en cultivo dual, M. roreri ha crecido 9.37 cm2, comparado con un crecimiento libre donde alcanzó 19.71 cm2, para fines de cálculo se estima que no pudo crecer 10.34 cm2, con estos datos se aplica la fórmula dando que el PICM fue de 52.46 % con respecto a M. roreri. Asimismo, se evidencia que una vez encontrados los microorganismos ambos inhiben su crecimiento emitiendo T. viride encinas que retraen el crecimiento de M. roreri pero que ninguno se coloniza por lo que en la escala de Bell se lo clasifica como nivel de antagonismo de 2, donde el antagonista crece sobre las 2/3 partes de la caja de cultivo, inhibiendo el crecimiento y desarrollo del fitopatógeno (Figura 5).
Al respecto Hjeljord y Tronsmo (1998) indican que Tricoderma está biológicamente adaptado para una colonización agresiva de los nutrientes disponibles y para sobrevivir en forma de clamidosporas o conidios cuando estos son escasos. La rápida velocidad de crecimiento esporulación abundante y rango amplio de sustratos sobre los que puede crecer hace que sea muy eficiente como saprofito y aún más como agente de control biológico.
Según estos datos obtenidos se elige para la prueba in vivo a Trichoderma harziarum, siendo este que tiene un mejor control sobre Moniliophthora roreri.
Fase II. Investigación en campo (in vivo)
La prueba de campo in vivo bajo un diseño DBA muestra que para la variable incidencia a los 15 días de aplicación, todos los tratamientos resultan estadísticamente iguales a la prueba Duncan, esto debido al reciente establecimiento de Trichoderma en las mazorcas para ejercer su influencia y el patógeno, al finalizar la evaluación se presentaron diferencias altamente significativas en cuanto al testigo con los tratamientos siendo estadísticamente diferentes a la prueba Duncan (Figura 6), la aplicación de los tratamientos logró reducir la incidencia de la enfermedad en las mazorcas en el orden del 6 %, siendo importante para la variable de incidencia.
La incidencia de moniliasis en los frutos de cacao mostraron menores porcentajes en lo tratamientos con los antagonistas, durante las dos primeras semanas, después de la aparición de los síntomas, sin diferencia estadística frente al control. Aunque las diferencias no alcanzaron los niveles de significación se destaca que la menor incidencia ocurrió en los frutos inoculados con el hongo antagonista Trichoderma harziarum (T2), aislamiento que en condiciones in vitro inhibió por completo el crecimiento y esporulación de M. roreri (Villamil et al., 2015). A partir de la tercera semana la incidencia de moniliasis fue del 100 % en todos los tratamientos, independientemente de la presencia de antagonista.
La evaluación variable de la severidad tiene un comportamiento similar a la incidencia, siendo que a las primeras aplicaciones no mostró diferencias significativas, las diferencias se mostraron en la última evaluación (75 días) donde T1 (testigo) al igual que T2 (200 g de Trichoderma) no fueron estadísticamente diferentes a la prueba Duncan (Figura 7). El avance de la enfermedad en ambos tratamientos fue el mismo, sin embargo, en el T3 (300 g de Trichoderma) sobre el cacao, tubo un eficiente control sobre el avance de la enfermedad de la mazorca consecuentemente evitó la esporulación del hongo para que pueda realizar nuevas infestaciones a frutos sanos, alcanzando con relación al testigo un descenso de la severidad del 10.87 %.
Según Villamil et al. (2015), el menor porcentaje de severidad externa se encontró en los frutos inoculados con el antagonista Trichoderma harziarum (T2). Las diferencias en cuanto a la severidad externa entre el tratamiento T2 y el testigo (T4) fueron significativas durante las seis semanas del estudio y frente a los otros dos antagonistas, a partir de la semana 3. Entre los tratamientos T1 (hongo H5) y T3 (bacteria B3) no se presentaron diferencias significativas en el tiempo del estudio, pero los dos también se diferenciaron del testigo (T4), a partir de la semana 4. La tendencia en la severidad externa del patógeno a través del tiempo mostró que el menor porcentaje de expresión de severidad externa de M. roreri durante las seis semanas del experimento fue el Trichoderma harziarum, etapa en la que los porcentajes de severidad fueron significativamente los más bajos.
CONCLUSIONES
La prueba dual mostro que Trichoderma harziarum tiene un porcentaje de inhibición de crecimiento de micelio del (PICM) 58.60 %, así mismo en la escala de Bell lo clasifica en un nivel de 1, invadiendo el micelio de M. roreri ocupando así todo el espacio de la caja
Petri, por estas características se la elige como el antagonista más eficiente. En contraposición Trichoderma viride con un PICM de 52.46, es calificado en la escala de Bell en nivel 2 es decir solo inhibe el crecimiento de M. roreri, no lo invade dentro de la caja Petri, como también su velocidad de crecimiento es inferior al de T. harziarum.
La prueba en campo (in vivo) con T. harziarum muestran que la incidencia en ambos niveles de aplicación rebajo está en un 6 % con respecto al testigo, que muestra que T. harziarum reduce la incidencia eficientemente. La severidad en campo fue medida en base a sintomatología externa siendo el T2 con 300 g fue el más eficiente reduciendo la severidad en 10.87 % con relación al testigo, por lo que se recomienda trabajar con este nivel de Trichoderma.
En la prueba de campo fue preponderante las condiciones ambientales en donde falta de lluvias al inicio y concentradas en un solo mes afectaron la expresión de ambos hongos estudiados. Se recomienda realizar la prueba de campo con 300 g, empezando en octubre con aplicaciones al suelo y follaje para cortar el ciclo de M. roreri desde el suelo antes que empiece su infección.
