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INTRODUCCIÓN
Las biotecnologías reproductivas se han caracterizado por sus grandes avances durante años, en los procedimientos dirigidos a la reproducción asistida en humanos y mejoramiento en la manipulación reproductiva y genética de los animales (Hansen, 2006). El empleo de estas técnicas puede implicar un importante progreso biotecnológico en la producción lechera del ganado bovino (Morales, 2017).
Una técnica de gran valor que dio paso para la aplicación de la inseminación artificial y la transferencia de embriones, es la producción in vitro de embriones bovinos, esto ha ido incrementado en estos últimos años a nivel mundial con fines comerciales (Perry, 2014). Aprovechando reproductivamente de hembras sacrificadas de alto valor económico y también produciendo embriones en masa con toros mejorados, los embriones producidos in vitro pueden ser criopreservados o bien transferidos a hembras receptoras, los pasos de esta técnica son: la obtención y maduración de ovocitos, fertilización y el cultivo y desarrollo del embrión (Morales, 2017).
Para promover la competencia de desarrollo de ovocitos de bovino y la subsecuente calidad de los embriones se ha adicionado al fluido oviductal de vesícula extracelular del istmo (Lopera-Vásquez et al., 2017) y glucocorticoides como también la piridoxina que inhibe la actividad de la catepsina B durante la maduración in vitro y el cultivo in vitro (IVC), los dos anteriores benefician el desarrollo embrionario (Da Costa et al., 2016).
No obstante, el mayor obstáculo en el desarrollo de embriones in vitro en varias especies, tales como la fertilización in vitro, ha sido el bloqueo de las divisiones celulares que ocurre en el método de cultivo in vitro (Tervit et al., 1972). En el bovino el bloqueo ocurre en el estado 8 a 16 células, no permitiendo alcanzar la etapa de blastocisto (Enright, et al., 2000; Rizos et al., 2002; Galli et al., 2003; Lonergan, et al., 2004). Los blastocistos que llegan hasta esta etapa se consideran de menor calidad donde el potencial de desarrollo disminuye (Bang et al., 2015).
Los elevados costos de los materiales equipos e insumos, para realizar comercialmente los procesos biotecnológicos de la fertilización in vitro, limitan el desarrollo de esta técnica, es por esa razón que recurre a medios biológicos que se puedan disponer para poder garantizar dicho procedimiento, en tal sentido el presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del fluido uterino de Llama (Lama glama) en el desarrollo embrionario del ganado bovino para cultivos in vitro.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación de la zona de estudio
El presente trabajo se realizó en el centro de Mejoramiento Genético del altiplano-UAC BATALLAS, se encuentra ubicado en la comunidad de Batallas, en tercera sección municipal de la provincia Los Andes; situado a 50 km de la ciudad de La Paz, Bolivia. Se encuentra geográficamente a una latitud sur de 16° 28' 51.45'' y longitud Oeste de 68° 55' 02.72'' y una altitud de 3 838 m s.n.m. La temperatura media del lugar es de 10°C, y cuenta con una precipitación pluvial media de 600 mm al año.
Metodología
Mediante cronología dentaria, se consideró la edad aproximada de 4 años, condición corporal 4 Buena. Animal alimentado con pasturas nativas todo el año, con buen estado sanitario. Para la colecta del fluido uterino en llamas se administró 1 ml de la hormona liberadora de gonadotropina (GNRH), por vía intra muscular. Pasado las 24 horas, se procedió a la colecta a través de la sonda Foley, se extrajo 7 uL de fluido uterino técnica se repitió unas 15 veces, se congelaron a -80°C, hasta su aplicación al medio de cultivo.
Los ovarios de bovino fueron obtenidos de 214 hembras beneficiadas en el matadero municipal de “Los Andes” El Alto, sin considerar raza ni edad, con la extracción de los ovarios derecho e izquierdo, las muestras fueron transportadas hasta el respectivo laboratorio, manteniendo la temperatura a 38°C.
La recuperación de ovocitos fue mediante la técnica de aspiración folicular de aquellos folículos que se encuentran entre 3 a 6 mm de diámetro de su desarrollo. Su contenido fue colocado en un tubo de ensayo de 10 ml una vez llenado se dejó sedimentar por 10 minutos, luego fue sacado cuidadosamente el líquido folicular con la pipeta fip adosada a una jeringa de tuberculina, dejando solo los ovocitos sedimentados en el tubo de ensayo. En una caja Petri fueron vertidos los ovocitos y lavados con el medio de lavado (Bio-Wash IVF). Mediante esterescopio y a un aumento de 10 X, procediendo a la categorización de los ovicitos.
Para el proceso de maduración de los ovocitos se preparó y estabilizó el medio de maduración (BO-HEPES) 700 uL en forma de microgotas. Luego se procedió a su selección e introducidos al medio de maduración, bajo un medio ambiente con CO2 e incubando a 38.5°C durante 24 horas.
Para la fertilización in vitro se utilizó semen congelado de raza Holstein y Pardo suizo procedente de la Estación Experimental de Choquenaira del Laboratorio de Criopreservación de Semen. La capacitación de los espermatozoides se llevó a cabo por la técnica (Swin-up). Para realizar la fertilización se verifico previamente la maduración de los ovocitos observando con el estereoscopio el grado de la expansión del cumulus ophorus.
Pasado las 24 horas los cigotos fueron retirados de la incubadora y llevados al estereoscopio y observar la formación del segundo corpúsculo polar, sin embargo, no siempre es posible la visualización de todas las estructuras, por esta razón se propone la formación de las primeras blastómeras como criterio (Fukui, 1990).
El medio de cultivo utilizado fue bajo la misma técnica del medio de maduración no habiendo ninguna diferencia a excepto del cambio de medio de cultivo (BO-IVC). En esta etapa se adicionó el fluido uterino de la Llama y este se mantuvo por ocho días a 38.5°C, con el 5 % de CO2 en aire y 95 % humedad relativa.
Para los ovocitos con el medio de cultivo convencional o sin la adición del fluido uterino, la renovación del medio de cultivo se realizó cada 48 horas y para el día
8 se evaluó el porcentaje de embriones en sus diferentes estadios. La evaluación del desarrollo embrionario in vitro se llevó a cabo el porcentaje de embriones en sus diferentes estadios con la ayuda de un estereoscopio y un microscopio a un aumento de 10 x, a las 48 horas y al día 8, registrando el número de mórulas y blastocistos.
Los datos fueron evaluados mediante comparación de proporciones con la prueba de chi-cuadrado.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La fertilización in vitro bajo el medio ambiente como el Altiplano de Bolivia y considerando la altitud de 3 800 m s.n.m., son condiciones adversas que limitan el desarrollo de biotecnologías reproductivas en muchas especies de animales domésticos. Por tanto, los resultados obtenidos muestran las posibilidades de poder concretar el uso de la fertilización in vitro, como alternativa para una mejor producción. La Tabla 1, muestra el porcentaje de maduración de ovocitos, para los dos medios de cultivos utilizados, tanto el convencional y el enriquecido con fluido uterino.
Tabla 1 Porcentaje de maduración de ovocitos in vitro de bovino para medios de cultivo convencional +fluido uterino.
No presentan diferencia estadística (p<0.05).
Los resultados son superiores significativamente frente a los demás estudios en condiciones de altura de la zona del altiplano boliviano, con un periodo de incubación de 24 horas. Mamani (2017) obtuvo como dato el 61.79 %, adicionando la hormona luteinizante (LH) al fluido folicular a diferencia (Carazas, 2018) logró obtener el 44.73 % utilizando el medio de cultivo sintético TCM-199 suplementando la hormona Luteinizante (LH) y GnRH (eCG) esto puede atribuirse al suplementar diferentes componentes en la maduración in vitro. En el estudio actual se trabajó con medio de maduración comercial (BO-HEPES) sin ninguna suplementación alguna no afectando en la maduración a cambio se logró obtener una mayor expansión de ovocitos con un cúmulo compacto formado por varias capas de células.
La Tabla 2 muestra el porcentaje de desarrollo embrionario a las 48 horas, con el medio convencional, así como el medio de cultivo con adición del fluido uterino, comparando con lo que señala (Pahuara, 2015) con el medio SOFaa obtuvo el 39.19 % similar a nuestros resultados del 36.97 % con adición del fluido uterino, esto debido a que utilizó la misma técnica Swin up, produciendo la capacitación y reacción acrosomal, permitiendo la penetración de espermatozoides a través de la zona pelúcida.
Es necesario considerar el hecho de que el mayor problema del cultivo de embriones bovinos in vitro indicado en los trabajos de diversos autores, ha sido el bloqueo de las divisiones celulares que experimentan los embriones cuando alcanzan el estado de 8-16 células (Wright y Bondoli, 1981; Eyestone et al., 1987; Telford et al., 1990). La investigación muestra una mejora a razón al bloqueo logrando obtener desarrollo de 8 células, Otros estudios han demostrado que los cigotos bovinos que se dividen tempranamente a las 32-36 horas post-fertilización in vitro, son más capaces a desarrollar al estadio de blastocisto, comparado a los que se dividen más tardíamente (Lonergan et al., 2000; Yadav et al., 1993).
Tabla 2 Porcentaje del desarrollo embrionario in vitro bovino cultivados a las 48 horas, con el medio de cultivo convencional + la adición del fluido uterino de camélido.
No presentan diferencia estadística (p<0.05).
En los estadios más tempranos (embriones de 1-2 células) se utiliza el piruvato y/o el lactato y algunos aminoácidos, pero no la glucosa. De hecho, la adición de glucosa a los embriones bovinos fertilizados resulta en un descenso del desarrollo embrionario posterior (Takahashi y First, 1992). Esta puede ser la causa donde se observa un bajo porcentaje de clivaje de embriones al inicio, en su componente del fluido uterino se evidencia la glucosa, pero en bajas proporciones no afectando a tan extremo el desarrollo embrionario en las siguientes divisiones. El porcentaje del clivaje embrionario cultivados al día ocho suplementados con fluido uterino de camélido, se demostró por medio de prueba de chi cuadrado, donde existe diferencias significativas (p>0.05) en ambos medios de cultivo lo cual demuestra claramente que no existe una relación entre ambos tratamientos, tal como lo muestra la Tabla 3, existiendo en sus resultados una mejoría con la adición del fluido uterino lograron su clivaje hasta blastocisto expandido del 1.68 % a diferencia sin la adición del 0 %.
Tabla 3 Porcentajes de clivaje para la producción de embriones in vitro bovino cultivados al día ocho, mediante la adición del fluido uterino de camélido al medio de cultivo.
Presentan diferencia estadística (p>0.05).
Arista (2019) reporta que trabajó con semen congelado de toros homocigoto de la raza aberdeen angus, donde adiciono el fluido oviductal sintético al medio de cultivo como resultado en etapa de blastocisto expandido obtuvo para el toro 0.82 % JTRM y 1.13 % VTRM, en cuanto a nuestros resultados no existe diferencias. Sin embargo con las células del epitelio oviductal (Muci et al., 2000) obtuvo 26.7 % superior al presente estudio, efectuó mediante una insición y raspado al oviducto, donde adicionó este componente al medio de cultivo logrando se evitar el bloqueo en el desarrollo, de tal forma que los embriones alcanzaron la etapa de blastocisto expandido viables y de calidad al día ocho de cultivo dentro del tiempo establecido.
El mayor aporte por parte del suero sanguíneo a los fluidos del oviducto y útero son las albuminas, α y β, y-globulinas y lipoproteínas de alta densidad. Sin embargo, el aporte de las inmunoglobulinas es mayor en el fluido uterino. Esto puede estar asociado al aumento de la motilidad uterina durante el estro y la consecuente entrada de microorganismos. En la especie bovina influyen el contenido de IgG donde actúa como defensa de microorganismos (Alavi-Shoushtari et al., 2014). Conforme a las investigaciones, puede ser un efecto benéfico para acceder al desarrollo de los embriones, evitándose la propagación de microorganismos en el medio de cultivo a la vez permitiendo su desarrollo hasta la etapa de blastocisto expandido.
Respecto en la etapa de mórula y blastocisto temprano (Mamani, 2017) llego a obtener 2.27 % en mórula y en blastocisto el 0 % a diferencia de nuestro resultado donde se adicionó al fluido uterino alcanzando un mayor porcentaje de mórulas 12.60 % y blastocistos 5.88 %, a diferencia del anterior estudio donde no se adicionó ningún suplemento en condiciones de altura, tal como lo muestra la Figura 1. Debe plantearse en suplementar al medio de cultivo con algún componente para promover propiedades embriotróficas, ayudando a la compactación y blastulacion del desarrollo embrionario del ganado bovino.
A su vez Soto et al. (2019b) registró una incidencia del 30 % mórulas y 7 % blastocistos cultivados al día ocho con células del oviducto, no habiendo diferencia en el resultado actual. A si mismo, De los Reyes et al. (2003) evaluó los porcentaje de desarrollo embrionario al comienzo del cultivo, a las 24 horas y al sexto día de incubación con la adición de células epiteliales ovidutales (BOEC), sin embargo la proporción total de blastocistos tempranos al sexto día fue significativamente superior al obtenido del 12.3 %, no habiendo ninguna complicación en el tiempo de in-cubación, por ende podría incubarse hasta esta etapa pero dependería de la suplementación en la que se utilice.
El fluido uterino tiene en su composición altos niveles de albumina lo que mejora en el desarrollo embrionario del bovino protegiendo de sustancias toxicas, aportando los factores de crecimiento a ciertas hormonas, previniendo a que los embriones se adhieran al instrumental todo lo contrario al medio de cultivo.
No obstante, existe otro componente que recorre todo el largo del oviducto y útero denominándose la glucosa, principal fuente de energía para la división del desarrollo celular (Thompson y Peterson, 2000). En el presente estudio las referencias recabadas (Gardner y Lane, 2002) sobre la concentración de glucosa se encuentra 3.15 mM en el útero, este requerimiento en base al fluido uterino suplementado permite al desarrollo del embrión hasta el estadio de blastocisto expandido.
Los factores biológicos y técnicos que posiblemente hayan contribuido en las bajas tasas del desarrollo embrionario en ambos medios de cultivos, pueden estar presentes en el tiempo entre colección de ovarios e incubación. Por esto, se precisa la reducción de este factor, así como el estricto control térmico tanto en el manejo de los ovarios como de los gametos obtenidos durante todo el proceso, Así mismo, existe otra causa en lo referente a la maduración incompleta o la vejez de los ovocitos cultivados.
Como señala Peixoto (2010) puede atribuirse a la edad del animal, en este estudio se trabajó con animales beneficiadas en camal donde se encuentran en diferentes fases del ciclo ovárico, lo cual puede tener efecto en el porcentaje de embriones producidos in vitro. Existen otras causas como ser; el número de ovocitos y embriones por gota de cultivo, concentración de espermatozoides, la experiencia del personal de laboratorio. Otra referencia es el caso al medio de cultivo el hecho de haber obtenido altos porcentajes de maduración in vitro y bajo índice de desarrollo embrionario indica que necesitan adicionar algunos componentes para soportar el incremento celular de los embriones, en el estudio presente se adicionó el fluido uterino de Llama donde se llegó alcanzar hasta blastocitos expandido, para incrementar el porcentaje se necesitaría suplementar como por ejemplo de las células somáticas. Según Block et al. (2011) estimulan el crecimiento de los embriones de los mamíferos mejorando la tasa de clivaje y desarrollo embrionario.
Las diferentes investigaciones reportadas no son idénticas a nuestro estudio para la producción in vitro de embriones bovinos, no fue posible encontrar un estudio que acontezca la suplementación del fluido uterino de Llama al medio de cultivo por lo cual se hace énfasis al oviducto.
Tabla 4 Clasificación de los embriones de bovinos producidos in- vitro según IETS (Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones).
En la Tabla 4 se muestra el resultado de la clasificación embrionaria según su calidad luego del día ocho, para el medio de cultivo convencional se obtuvo los siguientes resultados (excelente calidad de 9.91 %, regular calidad 19.83 %, mala calidad 24.79 %, muertos y degenerados 45.45 %) (no coinciden los valores) y para el medio de cultivo suplementado con el fluido uterino de camélido (excelente calidad 15.13 %, regular calidad 25.21 %, mala calidad 27.73 %, muertos y degenerados 31.93 %) se establecieron de acuerdo a las normas de la Sociedad Internacional de Transferencias de Embriones no encontrando diferencias entre ambos tratamientos.
A diferencia de Pahuara (2015) obtuvo porcentajes bajos haciendo referencia al SOFaa (Fluido oviductal sintético) del (3.03 % de embriones de excelente calidad, 8.69 de regular calidad y de 6.62 % de mala calidad, muertos y degenerados del 81.66 %. En la clasificación de embriones producidos in vitro, se presentó embriones degenerados del 31.93 % para el cultivo + FU en relación al medio de cultivo 45.55 %. Estudios realizados por Holm y Henrik (1998) reportaron una incidencia del 15 a 30 %, donde observaron anormalidades cromosómicas, otro caso es por mixoploides, oseá poseían dos o más líneas celulares, se daba cuando alcanzaban el 72 % de 151 embriones degenerados. No hay duda que los medios de cultivo embrionario afectan la calidad embrionaria, por lo que, hasta la actualidad, no hay suficiente información para concluir cuál es el "mejor" de los medios o sistemas de cultivo (Millano et al, 2016).
CONCLUSIONES
Los porcentajes para la maduración de ovocitos in vitro, para ambos grupos son similares, promoviendo la expansión del cumulus ophorus y el reinicio de la meiosis. El porcentaje de embriones cultivados a las 48 horas post inseminación se obtuvo el 31.40 % para el medio de cultivo convencional y 36.97 % para el medio de cultivo más fluido uterino de Llama. No existiendo diferencia estadística significativa (P<0.05) entre ambos tratamientos, atribuyen un mayor progreso sobre el desarrollo embrionario bovino in vitro. El porcentaje de embriones cultivados al día ocho, con la adición de fluido uterino de Llama, mejora el desarrollo hasta el estadio de blastocistos expandido del 1.68 %, por su parte al medio de cultivo sin fluido uterino del 0 %. Existiendo diferencia estadística (P>0.05). Los embriones de ganado bovino fueron clasificados según su calidad de acuerdo a las normas IETS, tras realizada la evaluación sobre el desarrollo embrionario existe una mayor competencia en el medio cultivo más fluido uterino.
