Introducción

La criopreservación es una biotécnica reproductiva que permite la conservación del valor genético de diferentes especies a largo plazo. En camélidos sudamericanos (CSA) el proceso de la criopreservación afecta negativamente a la viabilidad de los espermatozoides (EPZ). Sin embargo, en los últimos años, varios estudios buscan protocolos viables, uso de crioprotectores y diluyentes que permitan mejorar su supervivencia^1-3.

Los eventos durante la congelación/descongelamiento de las células espermáticas pueden causar cambios y daños parciales irreversibles, especialmente en la membrana, llevando a disminución de su capacidad fecundante⁴. La membrana de los EPZ está compuesta de lípidos y proteínas, siendo predominantes, los fosfolípidos y el colesterol⁵, cuando son sometidos a bajas temperaturas afectan a la fluidez de la membrana, permeabilidad y distribución de fosfolípidos⁶. La ratio de colesterol/fosfolípidos en los EPZ es un factor indispensable para la fluidez de la membrana. Varios estudios observaron que mayor ratio colesterol/fosfolípidos son altamente resistentes al shock térmico, como en el humano, conejo y perro^7,8 mientras en toro, jabalí y carnero⁶ son susceptibles.

La adición de colesterol a la membrana de los EPZ incrementa la tasa de supervivencia a la criopreservación, su incorporación en los estratos de la membrana espermática se realiza fácilmente por medio de las ciclodextrinas (CD)^9,10. Las CD son oligosacáridos cíclicos que pueden ser de carácter externa hidrofílica o cavidad interna hidrofóbica, se encuentra en la forma más común como 6 a 8 unidades glicosídicas, designadas α, β y γ¹¹. De estas, la β-ciclodextrinas poseen mayor afinidad con los compuestos lipídicos, particularmente con el colesterol, incluso la adición del grupo metil a la molécula de las CD aumenta su solubilidad en agua y la capacidad de solubilidad de compuestos hidrofóbicos¹².

Basados en estas observaciones, existen investigaciones que revelan mejor tolerancia a la criopreservación en ovinos¹³ equinos¹⁴ bovinos¹⁰ y dromedarios¹⁵. Por tanto, el objetivo fue evaluar el efecto de concentraciones de 0, 1.5 y 3 mg de colesterol cargado con metil-β- ciclodextrina (MCD) en la criopreservación de EPZ de alpacas colectado por el método de poscópula (PC) y recuperados por desviación del conducto deferente (DCD).

Materiales y métodos

Código de ética. Los autores declaran que el presente estudio se ha llevado a cabo de acuerdo con el Código de Ética para los experimentos con animales, tal y como se refleja en la normativa: http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm

Zona de estudio y animales. El estudio se realizó en el Centro de Investigación en Camélidos Sudamericanos (CICAS) La Raya, de la Facultad de Ciencias Agrarias (FCA) de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco (UNSAAC) a 4130 metros de altitud, de febrero a marzo del 2018. Se usaron un total de 6 alpacas machos con edades entre 6 y 8 años, y un peso corporal promedio de 71.91±4.05 kg, se utilizó una balanza electrónica (Guindaste industrial LCD portátil). Los animales fueron desparasitados bajo la supervisión de un médico veterinario. La alimentación fue en una pradera nativa con predominancia de Festuca sp., Muhlenbergia fastigiata, Scirpus rigidus, Alchemilla pinnata y agua ad libitum.

Colección de semen/recuperación de espermatozoides y evaluación de espermatozoides.

Método de PC. Se colectó el semen de 3 alpacas machos, en 3 ocasiones por animal, y con intervalos de una semana^3,16. Previamente los animales fueron adiestrados y acostumbrados al manejo para facilitar la obtención de la muestra. El semen colectado fue mantenido a 37º C en baño seco, la filancia se calculó por la ruptura del hilo de la muestra, medida con una regla, el volumen fue evaluado visualmente¹⁷. Posteriormente se añadió papaína (1:1) (v:v) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), se mezcló homogéneamente e incubo 30 min a 37º C en baño maría. En seguida se adicionó inhibidor de papaína (E64, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) a una concentración de 20 µL/mL de semen diluido con papaína durante 5 min, manteniendo la misma temperatura, se centrifugó a 3000 rpm por 10 min¹⁵. El sobrenadante de plasma seminal fue eliminado, y finalmente, se adicionó a las muestras de semen, dilutor a base de Tris (fructosa y ácido cítrico ) a 37º C¹⁸.

Desviación del conducto deferente (DCD). Se utilizaron 3 animales, en 3 oportunidades con intervalos de una semana¹⁹. Las alpacas fueron previamente intervenidas quirúrgicamente y desviados los conductos deferentes hacia la cara interna del musculo²⁰ mediante una fistula, las gotas de EPZ fueron absorbidas y depositadas en 0.3 mL de dilutor base Tris en tubos Eppendorf de 2 mL²¹ inmediatamente mantenidos a 37° C un baño seco.

Preparación del colesterol saturado con ciclodextrina (MCD). Se prepararon dos soluciones, A y B. Para la solución A se diluyó 1 g de CD en 2 mL de metanol, y la solución B se diluyó 200 mg de colesterol en 1 mL de cloroformo¹⁰. Una vez preparadas, se añadió 0.45 mL de la solución B en la solución A, se mezcló homogéneamente y se vertió sobre una placa Petri de cristal, hasta su secado completo (1.5 días) a 37° C en estufa. Una vez evaporado el solvente, se recogió el precipitado restante, se almacenó en botellas de vidrio ámbar a temperatura ambiente hasta su uso. Posteriormente, el MCD se mezcló con dilutor base Tris, a una concentración de 50 mg/mL¹⁰.

Adición de colesterol en los EPZ y criopreservación. Las muestras de ambos métodos PC y DCD, fueron diluidas hasta alcanzar una concentración final de 15 millones de EPZ/mL, se separaron en 3 alícuotas para ser adicionadas con 0, 1.5 y 3 mg de MCD en oscuridad, a una temperatura de 37° C durante 15 min¹⁵. Inmediatamente las muestras fueron centrifugadas (1750 rpm x 10 min), el sobrenadante se eliminó, el pellet fue diluido en un crioprotector, que contenía, dilutor a base Tris 10 mL, yema de huevo 5 mL y dimetilformamida 3.125 µL²². Los EPZ fueron cargados en pajillas de 0.5 mL y selladas, para la etapa de refrigeración, la temperatura se descendió gradualmente de 37 a 4° C en un periodo de 2.5 h. Luego, fueron mantenidas en vapor de nitrógeno líquido sobre 3 cm por 15 min. Para el congelamiento las pajillas fueron sumergidas y mantenidas en nitrógeno líquido a -196º C hasta la posterior evaluación y la descongelación fue después de 7 días en agua a 37º C por 60 s²².

Se evaluaron, la movilidad, concentración, EPZ vivos, integridad funcional de la membrana e integridad acrosomal en muestras de semen fresco, refrigerado y descongelado con 0, 1.5 y 3 mg de MCD usando el Integrated Semen Analysis System (ISAS^® v1.1) dotado de un microscopio UOP-UB200i (Proiser R+D, Paterna, Valencia, España). La movilidad se evaluó sobre la platina temperada a 37° C del microscopio con el objetivo de 10X de contraste de fase negativo. Se evaluaron 10 microvideos, cada señal de video fue adquirida con un video cámara Proiser782C, a una velocidad de captura de 25 imágenes por segundo, tanto para la movilidad y concentración espermática se empleó una muestra de 5µL.

El porcentaje de EPZ vivos se evaluó con el kit Vital Test^®, la funcionalidad de la membrana espermática (HOST) se realizó con una solución hipoosmótica de 50 mOsm/L¹⁹, el análisis de la integridad acrosomal se hizo empleando el Coomasie blue²³.

Análisis estadístico. La estadística descriptiva fue empleada para las variables macroscópicas (volumen, filancia) y microscópicas (movilidad total, concentración, EPZ vivos, funcionalidad de la membrana espermática e integridad del acrosoma) de los EPZ colectados PC y recuperados de los conductos deferentes.

Se determinaron los supuestos de normalidad y homocedasticidad mediante las pruebas de Shapiro-Wilks y Levene de las variables microscópicas en el proceso de refrigeración y descongelado, se realizó la transformación de datos del porcentaje de movilidad total y de EPZ vivos, con el procedimiento Transreg del SAS. Estas variables fueron analizadas con un arreglo factorial en un diseño al azar, la comparación de medias se hizo con la prueba LSD (α=0.05). Todos los procedimientos estadísticos se realizaron con el programa SAS v 8.2 (NC State University, Estados Unidos).

Resultados

Figura 1 Movilidad de espermatozoides cargados con ciclodextrina (MCD) con 1.5 mg clasificados según su trayectoria, (color rojo, verde y azul) y estáticos (amarillo) 

Discusión

Figura 2 Integridad acrosomal con tinción Coomasie blue. (A) EPZ con pérdida de acrosoma y (B) EPZ acrosoma intacto 

Las características macroscópicas de los EPZ de alpacas obtenidas por dos métodos de colección PC y DCD se exponen en la Tabla 1.

El volumen seminal hallado fue similar a los reportados por Quispe et al.¹⁹, y Ordoñez et al.²⁴, tal variabilidad posiblemente sea por la disponibilidad y valor nutritivo del forraje en la época de lluvias en relación a la época de secas. El color predominante fue rojo claro con 44 % para el método de PC, valores que están dentro del rango descrito por Huanca²⁵. La filancia es la capacidad de formar hilo y es una característica distinta a la viscosidad Giuliano et al.¹⁷ en este trabajo se observó 23.8±0.70 mm. La filancia está influenciada principalmente por la especie, raza, animal, calidad de forraje Giuliano et al.¹⁷ y Ciprian Achircana²⁶ incluso el método de colección. Los EPZ recuperados por DCD. En CSA la concentración de EPZ está influenciada directamente por el método de colección. Los EPZ recuperados por DCD están desprovistos de plasma seminal, por tanto, muestran mayor concentración de EPZ en relación a los métodos de PC, electroeyaculación y vagina artificial debido a las características reológicas (viscosidad) del semen entero se sostiene que los EPZ tienden a la aglomeración Ordoñez et al.²⁴, Huanca et al.²⁵. Ello se ve reflejado en la movilidad total del semen fresco que en el método de colección por PC fue 13.6±7.30 %, menor al de DCD de 30.34±15.65 %.

Figura 3 Vitalidad de espermatozoides analizados con Vital test ^® EPZ vivos de color verde y muertos de color rojo (magnificacion 400X) 

Tanto para la vitalidad, funcionalidad de la membrana e integridad acrosomal los valores encontrados están dentro de los rangos descritos por Huanca²⁵, Quispe et al.¹⁹ y Meza et al.²⁰, todos estos estudios se realizaron en el mismo centro experimental, y con los mismos animales usados para la DCD.

Comparación de la adición de la metil-β-ciclodextrina cargadas de colesterol (MCD) sobre las características microscópicas de los EPZ refrigerados y descongelados. Las características microscópicas de los EPZ refrigerados y descongelados de alpacas, precargados con MCD en función de la movilidad, EZP vivos, funcionalidad espermática e integridad acrosomal se muestran en la Tabla 2.

La ratio de fosfolípidos/colesterol en los EPZ es variable entre especies, haciéndolos a algunos altamente resistentes al shock térmico como en el humano, conejo y perro Oscheroff et al.⁷. Se cree que los EPZ de alpaca son especialmente sensibles al choque por frío debido a su menor tasa molar de colesterol/fosfolípidos en comparación con las otras especies. Por esta razón, es importante reducir el efecto perjudicial del choque por frío, por ejemplo, aumentando el contenido de colesterol en la membrana celular.

^a-b-c Letras diferentes indican diferencias significativas (P <0.05)

Figura 4 Efecto de la adición de colesterol cargado con metil-β-ciclodextrina (MCD) con 0, 1.5 y 3 mg en espermatozoides de alpaca criopreservados. (A) Método PC refrigerado; (B) método DCD refrigerado; (C) método PC descongelado y (D) método DCD descongelado 

De manera general en este estudio los EPZ tratados con MCD al refrigerarlos tuvieron mayor movilidad, EPZ vivos, funcionalidad espermática e integridad acrosomal que las muestras de EPZ descongelados. Estos resultados conforman que la adición de MCD mejora las características microscópicas de los EPZ, independientemente de la especie y método de colección utilizado tal como señala Ciprian²⁶ que utilizó 2 y 4 mg de MCD en alpacas, Crichton et al.¹⁵ adicionaron 1.5 mg de MCD en dromedarios y Castillo et al.¹³ usaron 2 y 4 mg de MCD en ovinos.

En nuestro estudio para el método de PC y DCD en la etapa de refrigerado las muestras tratadas con 1.5 mg MCD mostraron mayor movilidad, EZP vivos, funcionalidad de la membrana plasmática e integridad acrosomal en relación al tratamiento con 3 mg de MCD y control. Por tanto, sin considerar la especie animal, método de colección y concentración de MCD se observó un efecto en las características microscópicas datos que concuerdan con Crichton et al.¹⁵, que adicionaron 1.5 mg de MCD en dos tiempos de incubación 0 y 3 h y Castillo et al.¹³ que añadieron 2 mg de MCD Figura 4 (A) y (B).

Los valores de la etapa pos-descongelado para el método de PC y DCD se muestra en la Figura 4 (C) y (D). Para la movilidad espermática no hubo diferencias estadísticas significativas (P>0.05) entre tratamientos para ambos métodos. Esta diferencia se especula que pueda deberse al método de colección, ya que los EPZ recuperados por DCD están desprovistos de plasma seminal. La presencia de plasma seminal puede influenciar a la calidad de EPZ, considerándose esencial para la conservación y viabilidad de los EPZ porque está constituida por antioxidantes (vitamina C y E, urato, albumina, taurina, proteínas) que está relacionado con la viabilidad del EPZ Novak et al.²⁷. Además, Ciprian²⁶ con (2 mg de MCD) usando el método de colección de electroeyaculación y Crichton et al.¹⁵ con (1.5 mg de MCD) utilizando vagina artificial encontraron mayor movilidad de los EPZ, estudios que sustentarían esta afirmación. Sin embargo, para la vitalidad espermática pos-descongelación, no se encontró diferencia significativa (P >0.05) entre tratamientos para el método de PC, pero para el método de DCD hubo diferencias estadísticas significativas. La vitalidad determina el porcentaje de EPZ vivos o muertos, independientemente de su viabilidad Giuliano et al.¹⁷. Las diferencias posiblemente sean por el plasma seminal, y por ende hay mayor viscosidad del semen que interfiere en una mejor acción del dilutor sobre los EPZ Ciprian²⁶ a pesar que en este trabajo se añadió como degelificador papaína. En los EPZ recuperados por DCD se observó que tuvieron mejor afinidad con 1.5 mg de MCD probablemente porque estaban desprovistos de plasma seminal. Por otro lado, Ciprian²⁶ encontró mayor porcentaje de EPZ vivos con 2 mg de MCD en alpacas, y Viñán et al.²⁸, observaron mayor porcentaje de EPZ vivos para 1.5 mg de MCD comparados con el grupo control en carneros, promedios que son superiores a los hallados en este trabajo, pero que siguen el mismo patrón de mejorar la vitalidad a los EPZ.

La funcionalidad de la membrana espermática fue mayor (P<0.05) para las muestras tratadas con 1.5 mg de MCD en relación al tratamiento con 3 mg y control para el método de PC, sin embargo, no hubo diferencias entre tratamientos, la razón de las diferencias no está bien claras.

La integridad acrosomal pos-descongelación fue superior (P>0.05) para los EPZ tratados con 1.5 mg de MCD en relación al tratamiento de 3 mg y control para ambos métodos de colección PC y DCD. Por tanto, se asume que estas diferencias estarían asociadas a la concentración de la adición de MCD. Crichton et al.¹⁵ en dromedarios, también expusieron que los EPZ con la presencia de 1.5 mg de MCD mostraron mayores porcentajes de EPZ con acrosoma intacto, similar a la reportado por Ciprian Achircana²⁶, quién obtuvo mayores promedios con 2 mg de MCD.

El efecto de adicción de MCD con diferentes concentraciones tuvo la misma tendencia de mejorar la movilidad, la viabilidad y funcionalidad de la membrana en los EPZ, la fluidez y estabilidad ante los cambios osmótico y de temperatura al criopreservado tal como lo describe Mocé et al.²⁹.

En conclusión, los EPZ al refrigerado colectados por el método de PC y DCD tuvieron mayor movilidad, vitalidad, funcionalidad de la membrana e integridad acrosomal. En la etapa de refrigerado y descongelado en ambos métodos de colección los EPZ tratados con 1.5 mg de MCD tuvieron efecto positivo sobre la movilidad, el porcentaje de EPZ vivos, la funcionalidad de la membrana espermática e integridad acrosomal.