Espanhol (pdf)
Artigo em XML
Referências do artigo
Tradução automática
Enviar este artigo por email
Citado por SciELO 
Similares em
SciELO 
uBio 
Permalink
INTRODUCCIÓN
El desarrollo de un método analítico comienza con pruebas estándar iniciales, aplicando el método en muestras reales y definiendo los parámetros de ajuste para asegurar el correcto funcionamiento del sistema durante el análisis. La validación del método analítico es el último paso, una vez determinadas las características y requisitos que debe cumplir, tales como la precisión requerida, sensibilidad deseada, grado de selectividad, costo de tiempo y tipo de instrumento requerido. Este proceso nos permitirá comprender la confiabilidad del método en aplicaciones diarias (USP-NF, 2024b).
La validación analítica debe demostrar que las metodologías analíticas brindan resultados que permiten una evaluación objetiva de la calidad especificada de los productos farmacéuticos (WHO, 2014). Además, es fundamental que las metodologías farmacopeicas adaptadas para otros usos y las metodologías no farmacopeicas sean validadas apropiadamente (USP-NF, 2024b).
Adquirir conocimientos científicos y tecnológicos nos permite contribuir a satisfacer las necesidades de la sociedad y ofrecer soluciones a los problemas de salud a través de la medicina. En este sentido, se sabe que los medicamentos orales en polvo para la gripe son efectivos en el alivio de los síntomas asociados a esta enfermedad, gracias a su combinación de ingredientes activos. Por ejemplo, la vitamina C (Ácido L-ascórbico) actúa como un antioxidante, protegiendo las células y apoyando el sistema inmunológico (Flores, 2013). El Clorhidrato de Fenilefrina alivia la congestión nasal (García, 2014), mientras que el Acetaminofeno o paracetamol reduce la fiebre al inhibir la síntesis hipotalámica de prostaglandina. La Cafeína disminuye la sensación de fatiga (Flores, 2013), y el Bromhidrato de Dextrometorfano, un antitusígeno sin actividad opioide, actúa sobre el sistema nervioso central para reducir la tos (Urbina, 2020).
En el presente trabajo se desarrolló y validó un método por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), que presenta ventajas sobre los métodos tradicionales, ya que actualmente, no existe un método analítico validado descrito en alguna Farmacopea reconocida en Bolivia que permita la valoración simultánea de estos cinco principios activos en polvo oral.
METODOLOGÍA
Equipo Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución Agilent Technologies 1260 y 1290 Infinity II, conformado por una bomba binaria, modelo G7112B; automuestreador, modelo G7129A; compartimento de columna termostatizado, modelo G7116B; detector con arreglo de diodos (DAD), modelo G7115A y Software OpenLAB CDS edición ChemStation.
Reactivos y estándares de referencia Metanol grado HPLC (JT Baker); acetonitrilo grado HPLC (Supelco), fosfato monobásico de potasio (Innovating Science Aldon Corporation); ácido fosfórico al 85% (Sigma-Aldrichy) agua HPLC. Estándar de trabajo de acetaminofeno (Paracetamol) pureza: 99,40%; bromhidrato de dextrometorfano, pureza: 99,92%; clorhidrato de fenilefrina pureza: 100,61%; cafeína, pureza: 99,38%; ácido Ascorbico, pureza: 100,19%.
Condiciones cromatográficas Cromatógrafo equipado con una columna ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl (L11) de 4,6 x 150 mm de 5-Micron, precolumna Eclipse XDB-Phenyl de 4,6 x 12,5 mm 5-Micron; longitud de onda de 202 nm y volumen de inyección de 10 uL. Además, se utilizó una fase móvil compuesta por fosfato monobásico de potasio 20 mM tamponada a pH 3,5 con ácido fosfórico al 10% (solución A) y acetonitrilo grado HPLC (solución B), y agua a pH 3,5 ajustado con ácido fosfórico al 10% como diluyente.
Preparación de la solución estándar. Se preparó la solución estándar pesando 32,5 mg de acetaminofeno y 25,0 mg de ácido ascorbico en un matraz aforado de 25 mL (preparación 1); se añadió 1 mL de metanol HPLC y diluyente, agitando mecánicamente para favorecer la disolución. Paralelamente, se pesaron 12,5 mg de clorhidrato de fenilefrina, 37,5 mg de cafeína y 18,8 mg de bromhidrato de dextrometorfano en un matraz aforado de 50 mL (preparación 2), al que se agregó diluyente y se agitó. Ambas preparaciones se sometieron a ultrasonido durante 20 minutos, luego se dejaron enfriar a temperatura ambiente. La preparación 2 se llevó a volumen con diluyente. Se tomó una alícuota de 2 mL de la preparación 2 y se transfirió al matraz de la preparación 1, completando el volumen con diluyente para obtener concentraciones finales de 1 mg/mL de ácido ascorbico, 0,02 mg/mL de clorhidrato de fenilefrina, 1,3 mg/mL de acetaminofeno, 0,06 mg/mL de cafeína y 0,03 mg/mL de bromhidrato de dextrometorfano. Finalmente, las soluciones se filtraron a través de filtros de jeringa de NYLON de 0,45 um antes del análisis.
Parámetros de evaluación para el desarrollo del método analítico
Nota. Estudios preliminares, desarrollo del método y puesta a punto del método analítico.
Preparación de la solución muestra. La matriz fue fortificada con los cinco principios activos y se añadió diluyente junto con 1 mL de metanol HPLC. La mezcla se sometió a baño maría a 60 °C con agitación continua hasta la disolución completa. Posteriormente, se ajustaron las concentraciones de los analitos para que coincidieran con las establecidas en la solución estándar. Finalmente, las soluciones se filtraron a través de filtros de jeringa de NYLON de 0,45 um antes del análisis.
Parámetros de validación. Linealidad instrumental en 5 niveles de concentración de principio activo (80, 90, 100, 110 y 120%), con 12 réplicas por nivel; linealidad del método en 5 niveles de concentración de principio activo más matriz (80, 90, 100, 110 y 120%), con 12 réplicas por nivel; precisión, repetibilidad instrumental en un nivel de concentración de principio activo (100%), con 10 réplicas, repetibilidad del método en 3 niveles de concentración de principio activo más matriz (90, 100, 110%), con 12 réplicas por nivel, precisión intermedia en 3 niveles de concentración de principio activo más matriz (80, 100 y 120%), durante 3 días y con 2 analistas diferentes, con 10 réplicas por nivel; exactitud en 3 niveles de concentración de principio activo y principio activo más matriz (80, 100 y 120%), cada nivel con 10 réplicas; especificidad en un nivel de concentración de principio activo y principio activo más matriz (100%), con 6 réplicas.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Desarrollo del método analítico
En el desarrollo del método analítico se evaluaron un total de 14 parámetro. El estudio inició con el estudio de las características fisicoquímicas de cada analito y la predicción del posible orden de elución. Posteriormente, se realizaron pruebas de solubilidad en agua a pH 3,5, tanto a temperatura ambiente para la solución estándar, como a 60 °C para la solución muestra con agitación mecánica, determinando que la solubilidad óptima para la preparación estándar y la muestra se alcanzaba en aproximadamente una hora bajo agitación continua.
La concentración de los principios activos en la solución estándar se definió de manera que se obtuvieran áreas cromatográficas representativas, cuidando al mismo tiempo la integridad de la columna, dado que la matriz contiene una cantidad considerable de azúcar. En este sentido la tabla 1 presenta el gradiente desarrollado, que fue diseñado en función de las características fisicoquímicas de los compuestos analizados y el tipo de relleno de la fase estacionaria. La estabilidad de los principios activos fue evaluada mediante corridas cromatográficas sucesivas de la solución estándar y la muestra, calculando el porcentaje de recuperación, y demostrando estabilidad mínima de 9 horas en solución.
Tabla 1 Gradiente desarrollado para la valoración simultanea de ácido Ascórbico, clorhidrato de Fenilefrina, Acetaminofeno, Cafeína y bromhidrato de Dextrometorfano
Nota. Solución A (solución buffer de fosfato monobásico de potasio a pH 3,5) y solución B (Acetonitrilo).
Asimismo, se realizaron corridas cromatográficas a 6 longitudes de onda en el espectro Ultravioleta (UV): 202, 245, 298, 280 y 262 nm, como se muestra en la figura 2.
Nota. Picos de principios activos a 6 longitudes de onda. Obtenido de OpenLAB CDS edición ChemStation Agilent Technologies del HPLC Agilent 1260 y 1290.
Estas longitudes corresponden a los de máxima absorción de cada uno de los principios activos, además de incluir 254 nm, donde absorben la mayoría de los compuestos. Para definir la longitud de onda de trabajo, se seleccionó aquella que permitiera detectar los cinco compuestos analizados en sus máximos de absorción, estableciendo la longitud de onda de trabajo a 202 nm.
La figura 3 muestra el cromatograma obtenido, evidenciando la resolución y el orden de elución de los cinco principios activos bajo las condiciones del método desarrollado. La temperatura de la columna se fijó en 30 °C, ya que a esta temperatura se obtuvo una resolución superior en comparación con los picos obtenidos a 20 °C, garantizando así una separación más eficiente.
Nota. Los picos corresponden a Ácido Ascórbico (1), Clorhidrato Fenilefrina (2), Acetaminofeno (3), Cafeína (4) y Bromhidrato de Dextrometorfano (5). Obtenido de Software OpenLAB CDS edición ChemStation Agilent Technologies del HPLC Agilent 1260 y 1290.
La tabla 2 resume los parámetros evaluados durante el desarrollo del método, incluyendo análisis estadísticos con prueba t de Student y ANOVA. Para la compatibilidad de filtros, se usaron jeringas de NYLON de 0,45 um, con recuperaciones entre 98,9% y 101,3% para los cinco principios activos, indicando ausencia de pérdidas significativas.
Tabla 2 Resumen de parámetros evaluados durante el desarrollo del método analítico
Nota. parámetros evaluados durante el desarrollo del método analítico. Rs= resolución, A= longitud de onda, conc. concentración, T°= temperatura, BM= Baño María, 1 = Ácido Ascórbico, 2= Fenilefrina HCI, 3= Acetaminofeno, 4= Cafeína, 5= Dextrometorfano HBr
Se evaluó el pH a 3,0 y 3,5, sin observar interferencias relevantes; se seleccionó pH 3,5 para compatibilidad con la fase estacionaria. El volumen de inyección se fijó en 10 uL, adecuado para detectar incluso el principio activo en menor concentración, bromhidrato de dextrometorfano, con un área promedio de 1735,59 a nivel 80%. El orden de elución se definió mediante corridas individuales y combinadas de estándares, la figura 3 muestra y confirma buena separación. La matriz no constituye un interferente significativo para la cuantificación de los principios activos, en cuanto a las recuperaciones, estas se encuentran entre 99,5% y 100,5%. Finalmente, la relación concentración-respuesta fue estadísticamente lineal en cinco niveles de concentración para los cinco analitos.
Validación del método analítico
Linealidad. El ácido Ascórbico, clorhidrato de Fenilefrina, Acetaminofeno, Cafeína y bromhidrato de Dextrometorfano presentaron linealidad en los siguientes rangos: 0,8 a 1,2 mg/mL; 0,016 a 0,024 mg/mL; 1,04 a 1,56 mg/mL; 0,048 a 0,072 mg/mLy 0,024 a 0,036 mg/mL respectivamente. Todos los compuestos mostraron un coeficiente de determinación (R2) superior a 0,990 y una regresión lineal adecuada. La tabla 3 presenta datos de coeficiente de correlación (r) mayores a 0,990; así como resultados de la pendiente e intercepto, indicando una linealidad aceptable.
Tabla 3 Resultados de linealidad instrumental y linealidad del método
Nota. Tratamiento estadístico para comprobar la linealidad. b pendiente, a intercepto, r coeficiente de correlación.
Precisión. En la tabla 4 indica que el método es preciso, independientemente del analista que lo ejecute y del día de análisis (condiciones ambientales diferentes). Esto se evidencia por los coeficientes de variación obtenidos, que fueron inferiores al 2 %.
Tabla 4 Resultados de precisión del método
Nota. Coeficiente de variación (CV), Repetibilidad instrumental (Rl), repetibilidad del método (RM) y precisión intermedia (Pl).
Especificidad. La especificidad del método se evaluó mediante la prueba de Anderson-Darling, que demostró que los datos siguen una distribución normal. Además, el análisis de varianza de Fisher confirmó que las varianzas son equivalentes. La Tabla 5 presenta los resultados de la prueba t de Student, del principio activo más la matriz sobre el principio activo, que nos indica que la matriz no actúa como un interferente significativo, ya que el valor t experimental es menor que el valor t de tablas para los cinco principios activos.
Tabla 5 Prueba de t de Student para verificar la Interferencia de matriz
Nota. El método es específico para la valoración de los cinco principios activos. La muestra corresponde a y Principio activo + matriz /Principio activo
Exactitud. La exactitud del método se evaluó en 3 niveles de concentración (80, 100 y 120%). Se utilizó el estadístico de Cochran para probar la homogeneidad de varianzas, determinando que la concentración no influye en los resultados, ya que el valor G experimental es menor que el valor G de tablas. En la tabla 6 se presenta el porcentaje de recuperación de cada uno de los cinco principios activos en los tres niveles de concentración, mostrando resultados cercanos al 100% (98,1% a 100,5%). Además, se calculó el sesgo que surge de errores sistemáticos inherentes al método, que se situó entre -2% y +2%.
En la literatura científica existen métodos HPLC para la cuantificación simultánea de algunos de los principios activos estudiados. Mahesh et al. (2013) desarrollaron un método para Paracetamol, Cafeína, clorhidrato de Fenilefrina y bromhidrato de Dextrometorfano en tabletas, logrando alta precisión y tiempos de análisis menores a 20 minutos.
Elkady et al. (2020) validaron un método para ácido Ascórbico, Fenilefrina, Paracetamol y Cafeína en sus formas puras y en tabletas, con parámetros dentro de los límites ICH. Sin embargo, estos métodos no incluyen simultáneamente el Ácido Ascórbico y Bromhidrato de Dextrometorfano, ni emplean la matriz de polvo oral. Samaniego & Arias (2016) validaron un método para la cuantificación simultánea de Fenilefrina clorhidrato, Paracetamol, Salicilamida, Cafeína y Clorfeniramina maleato en tabletas, sin Acetaminofeno ni ácido Ascórbico.
Tabla 6 Porcentajes de recuperación de los cinco principios activos
Nota. El sesgo es la diferencia entre el resultado obtenido en la prueba y un valor de referencia aceptado (100%).
En contraste, el método desarrollado en este trabajo permite la valoración simultánea de cinco principios activos en polvo oral, una formulación muy utilizada en la industria farmacéutica. Optimizando el tiempo de análisis y usando una columna fenilo, descrita en la USP-NF (2024) para el análisis de antigripales. Esto confiere al método un carácter único y una mejora significativa respecto a los existentes.
CONCLUSIONES
Se desarrolló un método para la valoración simultánea de cinco principios activos en polvo oral, por HPLC utilizando una columna fenilo (L11) y una fase móvil compuesta por un buffer fosfato a pH 3,5 y acetonitrilo HPLC. La detección se realizó a 202 nm, con una temperatura de columna de 30°C y un tiempo de corrida de 45 minutos. Los tiempos de retención fueron 2,16 min (ácido Ascórbico), 4,96 min (clorhidrato de Fenilefrina), 11,68 min (Acetaminofeno), 23,07 min (Cafeína) y 30,38 min (bromhidrato de Dextrometorfano).
Después del desarrollo, el método fue validado conforme a la USP e ICH Q2(R2), éste demostró especificidad, linealidad (80% a 120% concentración, coeficiente de correlación (r) > 0,999), precisión (CV ≤ 2,0%), exactitud (recuperación entre de 90,0% y 110%) y un sesgo del ± 2%. Este método validado constituye una herramienta importante para la industria farmacéutica, porque de esta manera se asegura la obtención de resultados confiables conforme a normativas internacionales en formulaciones de antigripales en polvo oral, en consecuencia, representa un ahorro significativo de recursos y tiempo en comparación con la realización de análisis individuales. Además, garantiza la eficacia, seguridad y estabilidad del producto, protegiendo la salud del paciente mediante la minimización de variaciones en la concentración de los principios activos.
