INTRODUCCIÓN

El Lupus Eritematoso Sistémico (LES) es una enfermedad inflamatoria crónica de tipo autoinmune de etiología desconocida, se caracteriza por desregulación de la respuesta inmune que conduce a la producción de autoanticuerpos dirigidos contra antígenos núcleo-citoplasmáticos y el depósito de complejos inmunes en diversos órganos. El carácter de enfermedad autoinmune sistémica implica la presentación de manifestaciones clínicas variadas, que afectan múltiples sistemas y órganos. (^{Jiménez et al., 2021}).

Si bien él LES afecta principalmente a mujeres en edad reproductiva, no se conocen los desencadenantes precisos de la enfermedad. Se ha reportado que factores genéticos, epigenéticos, hormonales y ambientales pueden estar implicados en la producción de autoanticuerpos, que a su vez influyen en la diversidad de las manifestaciones clínicas que van desde formas leves a graves de la enfermedad. (^{Gómez-Puerta & Cervera, 2008}; ^{Tsokos, 2011})

El Antígeno 4 del linfocito T citotóxico conocido por su sigla en inglés como CTLA-4 (CD 152) es un receptor de superficie celular que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, se expresa constitutivamente en la membrana celular de los LT CD4+ CD25+ activados. También se ha observado su expresión en otros tipos celulares como linfocitos B, monocitos y granulocitos, entre otros. la función que cumple en estos tipos celulares es desconocida. (^{Walker & Sansom, 2015}). Si bien no se conoce con certeza los mecanismos por los cuales el CTLA-4 cumple su función inhibitoria, se ha demostrado que la interacción de CTLA-4 con sus ligandos CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2) conduce a la regulación negativa de la activación mediada por el receptor de células T (TCR) de los linfocitos T (^{Tamariz Campillo et al., 2021}). El gen CTLA-4 se encuentra ubicado en el cromosoma 2 (2q33), este gen presenta 4 exones: Los exones 1 y 2 codifican la región extracelular de la molécula, mientras que el exón 3 codifica la región transmembranal y el exón 4 la región intracelular. (J. ^{Liu & Zhang, 2013}). Se han reportado cuatro polimorfismos del gen CTLA-4, el primero un microsatélite dinucleótido en el exón 3 del cual se conocen 23 alelos, el segundo corresponde a un cambio de una guanina (G) por adenina (A) en la posición +49 (G49A) del exón 1, el tercero un cambio de citocina (C) por timina (T) en la posición -318 (C-318T) en la región promotora y el polimorfismo CT60 A/G ubicado en la región 3ÚTR. (^{Lee et al., 2005}). Uno de los polimorfismos G49A se ha asociado con la susceptibilidad a LES en población asiática, siendo un factor de riesgo que predispone a 1.246 veces más de padecer la enfermedad. (Lee et al., 2005)

En la actualidad, aún se desconoce cómo este polimorfismo puede modificar la función de la proteína CTLA-4. El estudio llevado a cabo por ^{Kouki et al., (2000}), analizaron cómo el polimorfismo +49 (A/G) afecta la función de la proteína CTLA- 4 y contribuye a la patogénesis de la enfermedad de Grave´s; en sus hallazgos mostraron una elevada proliferación de células T en pacientes de los grupos caso y control portadores del genotipo G/G, mostraron también que la expresión del alelo G se correlacionaba con el incremento en la capacidad de proliferación de células T en comparación con pacientes que expresan el alelo A en sus células T. (Kouki et al., 2000; ^{Katkam et al., 2016})

Dado el impacto socioeconómico que tiene él LES a nivel mundial y nacional, con el fin de aportar al campo de la investigación médica preventiva, el presente trabajo planteo como objetivo, determinar en qué medida, el polimorfismo + 49 (A/G) en el exón 1 del gen CTLA-4 está asociado al riesgo a padecer LES y las manifestaciones clínicas de la enfermedad en una población de pacientes bolivianos que asistieron al Instituto SELADIS de la Universidad Mayor de San Andrés durante el año 2015.

MATERIAL Y MÉTODOS

Población en estudio. El presente trabajo de investigación corresponde a un estudio analítico de tipo caso control, el cual incluyó 80 pacientes con diagnóstico confirmado de LES (casos) de los cuales el 92.5% eran mujeres en edad fértil. Se incluyó también un grupo control de 80 pacientes de los cuales 63 (78.75%) eran mujeres en un rango de edad 11 a 61 años y 17 (21.25%) varones entre 21 a 40 años de edad . Todos los pacientes involucrados en el estudio fueron seleccionados en base a criterios de inclusión y exclusión. Los pacientes de los grupos caso y control acudieron al Laboratorio de Histocompatibilidad e Inmunogenética del Instituto de Servicios de Laboratorio de Diagnostico e Investigación en Salud (SELADIS) de la ciudad de La Paz durante los meses de marzo a noviembre del año 2015.

Criterios de inclusión: Pacientes con diagnóstico clínico y serológico de LES, de cualquier edad y sexo que cumplieron con al menos 4 de los 11 criterios de clasificación para diagnóstico de LES del Colegio Americano de Reumatología. A los pacientes se les realizó un cuestionario con la finalidad de obtener datos importantes sobre el inicio, evolución de la enfermedad y las manifestaciones clínicas que presentaron. Los pacientes del grupo control eran personas aparentemente sanas, sin antecedentes personales ni familiares de enfermedad autoinmune y que al momento de la toma de muestra no se encontraban recibiendo tratamiento médico. Tanto pacientes del grupo caso como control otorgaron un consentimiento informado para participar en el estudio.

Criterios de exclusión: Pacientes que presentaron otras patologías de tipo autoinmune, o que no otorgaron su consentimiento para que su muestra biológica forme parte del estudio, o quienes después de firmar el consentimiento informado hicieron conocer su desistimiento para formar parte del estudio.

Extracción de ADN y genotipificación del polimorfismo +49 del gen CTLA-4. A los participantes de ambos grupos de estudio se colectó 5 ml de sangre venosa en tubos Vaccutainer con anticoagulante EDTA-K3. La obtención del ADN genómico de las muestras sanguíneas se realizó mediante el protocolo propuesto por el kit de “Extracción de ADN de sangre periférica por membrana de sílica, sales caotrópicas y proteinasa K” (FAVORGEN, Taiwán).

El tipaje molecular del polimorfismo de un solo nucleótido +49 (A/G) ubicado en el exón 1 del gen CTLA-4 se realizó mediante el método de reacción en cadena de la polimerasa y fragmentos de restricción de longitud polimórfica (PCR-RFLP) tomando como base del método las condiciones propuestas por ^{Sfar et al. (2010}). La preparación del master Mix se realizó para un volumen de reacción final de 20 µl: Buffer 1X, dNTPs 0.2 mM; 0.5 mM de cada primers (forward: CAAggCTCAgCTgAACCTgggT; reverse: TACCTTTAACTTCTggCTTTg); MgCl2 1.5 mM; 0.008 U/ µl de Taq polimerasa platinum (Invitrogen, USA). La PCR consistió en la desnaturalización inicial de un ciclo a 94°C/10 min; un ciclo a 95°C/10 seg; 30 ciclos a 55°C/30 seg y una extensión final a 72°C/10 min. Posteriormente, se analizaron los productos amplificados en electroforesis de agarosa al 4% utilizando como diluyente el tampón TBE (Tris, ácido bórico y EDTA) 1X y el intercalante de ácidos nucleicos SYBR Green al 4,66%. La electroforesis se visualizó bajo un transiluminador de luz ultravioleta.

Restricción enzimática por Kpn I. Una vez verificada la amplificación del gen CTLA-4, se realizó la digestión enzimática de los productos del PCR, utilizando la enzima Kpn I 2000 U (Invitrogen, USA). Para lo cual se tomaron 10 µl del producto amplificado del PCR y se añadió 1 µl (10 U/ µl) de la enzima Kpn I 10 U/ µl (5´G GTAC↓C3´/3´C↑CATG G5´) y 2 μl del Tampón 10X para un volumen de reacción final de 30 μl. Dejando incubar la muestra toda una noche a 37°C. Los productos de la digestión enzimática se revelaron mediante electroforesis horizontal a 150 voltios, 350 mAmp por 120 min. en gel de agarosa al 4% teñido con 0,05% de SYBR® Green (Invitrogen, USA) usando como tampón de corrida TBE 1X y H2O libre de DNAsas como control negativo. Los polimorfismos de simple nucleótido se verificaron con ayuda de un transiluminador de luz UV. Los productos esperados fueron los siguientes: para homocigotos del alelo G una banda de 195 pb, para homocigotos del alelo A una banda de 182 pb y para heterocigotos A/G dos bandas, una de 195 pb y otra de 182 pb respectivamente como se observa en la figura 1.

Figura 1 Fotografía de la electroforesis de los productos amplificados de digestión enzimática con Kpn I que determina el polimorfismo +49 (A/G) del gen CTLA-4. En los pozos 1 y 4 se observa una banda de 195 pb que corresponde a homocigosis para el alelo A, los pozos 2 y 5 dos fragmentos heterocigotos de 195 pb y 172 pb y en los pozos 3 y 6 se observa una banda homocigota para el alelo G de 195 pb. 

Análisis estadístico. Para el análisis y levantamiento estadístico de los datos se hizo uso del programa estadístico IBM SPSS statistics 22 (versión de prueba), se realizó la prueba de CHI cuadrado para establecer diferencias entre las frecuencias alélicas o genotípicas. Para establecer la relación entre la exposición genética a la enfermedad se calculó el Odds Ratio para un intervalo de confianza (IC) del 95%.

RESULTADOS

A partir de las frecuencias genotípicas y alélicas de los dos grupos estudiados se realizó el análisis de la asociación genética por cada alelo del gen CTLA-4. Los resultados de la PCR-RFLP demuestran que el genotipo G/G es más frecuente en los pacientes lúpicos (21.25%) con respecto al grupo control (7.50%), mostrándose además como un factor de riesgo que predispone 3 veces más a un individuo a padecer la enfermedad (OR= 3.33; IC: 1.24 - 8.95) (Tabla 1)

Tabla 1 Comparación de las frecuencias genotípicas del polimorfismo +49 (A/G) del gen CTLA-4 en pacientes con LES frente al grupo control 

Con relación a las frecuencias alélicas, el alelo A muestra una asociación negativa, lo que otorga cierto grado de protección a padecer la enfermedad (OR=0.56; IC=0.35-0.90), a diferencia del alelo G que presenta una asociación positiva que predispone a duplicar el riesgo a padecer LES (OR=1.79; IC=1.11-2.88). (Tabla 2)

Tabla 2 Comparación de las frecuencias alélicas del polimorfismo +49 (A/G) del gen CTLA-4 en pacientes con LES y grupo control 

En la tabla 3, se muestran los resultados obtenidos de la asociación entre las frecuencias genotípicas del polimorfismo estudiado y las manifestaciones clínicas más frecuentes que presentaron los pacientes lúpicos en el transcurso de la enfermedad. Se observa que existe una asociación de riesgo significativa del genotipo A/A con la presencia de fotosensibilidad, observándose también que el portar este genotipo es un factor protector del desarrollo de complicaciones renales y hematológicas.

Tabla 3 Asociación de las frecuencias genotípicas del polimorfismo +49 (A/G) del gen CTLA-4 de pacientes lúpicos con las manifestaciones clínicas reportadas en el transcurso de la enfermedad. 

El genotipo en heterocigosis A/G se observó como factor predisponente a complicaciones renales, serositis y hematológicas. Este genotipo además muestra ser un factor protector de la presencia de complicaciones como fotosensibilidad, úlceras en la mucosa oral y nasal.

En la tabla 4, se muestran los resultados de la asociación entre la frecuencia de los alelos A (aminoácido tirosina) y G (aminoácido alanina) en la posición +49 del exón 1 del CTLA-4. Estableciéndose que el alelo A por sí solo es factor de riesgo para el desarrollo de fotosensibilidad y presenta un carácter protector para el desarrollo de las manifestaciones hematológicas. Con respecto al alelo G se observa que es un factor genético predisponente a riesgo de desarrollo de manifestaciones articulares y hematológicas; este alelo por otra parte, se constituye en un factor protector para la fotosensibilidad en pacientes lúpicos.

Tabla 4 Asociación de las frecuencias alélicas del polimorfismo +49 (A/G) del gen CTLA-4 de pacientes lúpicos con las manifestaciones clínicas reportadas en el transcurso de la enfermedad 

DISCUSIÓN

Él LES es una enfermedad autoinmune compleja en la que se ha demostrado que los factores genéticos juegan un rol importante en la predisposición al desarrollo de enfermedad. A la fecha se financian muchos estudios en diferentes grupos poblacionales y raciales que buscan identificar marcadores genéticos que sirvan como herramientas para el diagnóstico y pronostico del LES, especialmente en el grupo de pacientes donde la clínica y la serología no son suficientes. (^{Cozzani et al., 2014}; J. ^{Liu & Zhang, 2013}; ^{Nath et al., 2004})

La asociación del polimorfismo +49 (A/G) del gen CTLA-4 en pacientes lúpicos es controversial ya que varios estudios, entre ellos, el de los autores ^{Ahmed et al., en 2001} y Fernández-Blanco et al., en 2004 observaron una importante asociación del alelo G con los pacientes lúpicos en población japonesa, a diferencia del estudio realizado por ^{Liu et al., el 2001} quienes mostraron que no existe diferencias estadísticamente significativas a nivel del polimorfismo del exón 1 del gen promotor de CTLA-4 entre pacientes lúpicos y grupo control. (Ahmed et al., 200; Fernández-Blanco et al., 2004; M. F. Liu et al., 2001; ^{Sfar et al., 2010})

Con respecto al alelo A, el estudio Shooja et al. (2004) determinó que en población iraní existe una correlación importante entre el genotipo A/A (67.2% vs. 41.1%, p=0.0001, OR= 2.93, CI= 1.99-4.32) y la susceptibilidad a desarrollar lupus; en contraste el genotipo heterocigoto A/G (49.7% vs. 27.8%, p=0.0001, OR=0.39, CI-=0.26-0.57) muestra un papel protector para lupus. (^{Shojaa et al., 2014})

El presente estudio fue realizado en población mixta boliviana, de la cual el 96,25% eran oriundos del Departamento de La Paz - Bolivia, la población del departamento de La Paz - Bolivia tiene un importante aporte genético de los grupos étnicos de origen quechua y aymara. Los resultados muestran que el genotipo G/G se encuentra en mayor frecuencia en los pacientes lúpicos con respecto al grupo de pacientes aparentemente sanos. Por lo tanto, el alelo G representa un factor de riesgo a desarrollar lupus. En contraste al alelo A, especialmente en homocigosis, se muestra como un factor protector para el desarrollo de LES.

Respecto a la asociación entre el polimorfismo del gen estudiado y las manifestaciones clínicas expresadas en los pacientes lúpicos, se encontró que el polimorfismo A/G es un factor de riesgo para el desarrollo de alteraciones hematológicas y nefritis lúpica, pero al mismo tiempo, se comporta como un factor protector para el desarrollo de serositis, fotosensibilidad y úlceras orales o nasales. Por otra parte, el polimorfismo A/A es un factor de protección para el desarrollo de alteraciones hematológicas y nefritis lúpica, siendo a su vez un factor de riesgo para el desarrollo de fotosensibilidad.

La asociación entre las manifestaciones clínicas y el polimorfismo alélico, evidencia que, el alelo G es un factor de riesgo para el desarrollo de alteraciones hematológicas, y a su vez, es un factor protector para fotosensibilidad. El alelo A demuestra un papel protector para de desarrollo de alteraciones hematológicas.

Pocos estudios han evaluado la posible asociación entre polimorfismo +49 (A/G) y las manifestaciones clínicas del LES. Entre ellos, ^{Sfar y cols. (2010}), observaron que si bien no existe asociación de riesgo de desarrollo de LES con respecto a portar el alelo G, las frecuencias observadas de pericarditis, vasculitis cutánea, crioglobulinas, inmunocomplejos y anticuerpos anticardiolipinas son mayores en pacientes portadores del alelo G que en los que portan el alelo A. También reportaron que no observaron diferencias en las frecuencias de nefritis lúpica y manifestaciones hematológicas con respecto a los alelos A y G. (Sfar et al., 2010) Los estudios de ^{Devaraju et al. (2014}) y Katkam et al (2015) tampoco reportaron asociaciones estadísticamente significativas entre el polimorfismo +49 (A/G) y las manifestaciones clínicas del LES. Katkam et al (2015) evaluaron manifestaciones clínicas como úlceras orales, eritema malar, eritema discoide, fotosensibilidad, artritis, pericarditis, pleuresía, afecciones hematológicas, renales y neurológicas, concluyendo que el polimorfismo estudiado no influencia ningún fenotipo clínico del LES. (Devaraju et al., 2014)

CONCLUSIÓNES

En conclusión, el presente estudio permite establecer que en población boliviana, la presencia del genotipo G/G o del Alelo G en el SNP +49 (A/G) del gen CTLA-4 predispone a riego de desarrollar LES. Además, se establece que los pacientes heterocigotos A/G tienen mayor riesgo de padecer nefropatía lúpica, serositis y alteraciones hematológicas; que el genotipo A/A predispone a fotosensibilidad a la radiación solar. Por otra parte, el genotipo A/A tiene carácter protector contra problemas hematológicos y renales y el genotipo A/G es de carácter protector para el desarrollo de úlceras y sensibilidad a la luz solar. Desde el punto de vista del polimorfismo alélico se observó que el alelo G representa un factor de riesgo para alteraciones hematológicas y como factor protector para la sensibilidad a la radiación UV. Finalmente, el alelo A del gen CTLA-4 es un factor protector para manifestaciones hematológicas.