Introducción

La provisión mundial de alimentos, depende en gran medida de la agricultura. Para lograr en la actualidad este objetivo, la tarea es compleja, difícil, sin plaguicidas, en el control de plagas y enfermedades que atacan los cultivos¹. Su aplicación trae consecuencias no deseadas, como efectos adversos en la salud humana, del suelo, medioambiente en forma general, por su toxicidad y persistencia¹. Otro aspecto negativo, es la selección de individuos resistentes, por su evolución frente a éstos, la sobrevivencia de individuos mejor adaptados y posiblemente más agresivos, conlleva un incremento en sus aplicaciones, conformándose así, un círculo cerrado en espiral, que empeora las condiciones del ecosistema¹. Para responder a las crecientes demandas de los consumidores, la producción alimentaria sostenible, debe desarrollar alternativas frente a los productos sintéticos convencionales de protección vegetal. En la actualidad, la aplicación de plaguicidas a largo plazo en los cultivos, tuvo una disminución y aceptación por los consumidores¹.

Ross² observó en un principio, que las plantas adquieren un tipo de inmunidad sistémica inespecífica después de una infección localizada, reconocida como resistencia sistémica adquirida (RSA). Un gran número de estudios, reportan aspectos fitopatológicos, químicos, bioquímicos, genéticos, genómicos, moleculares, agronómicos, que contribuyeron y continúan revelando una gran cantidad de hechos e información, que incluyen con éxito, la forma potencial de explotar los procesos fenomenológico en la protección de cultivos³. En las dos últimas décadas se publicaron modelos^4-7, de cómo se desarrolla el proceso de RSA, sea en su expresión innata o evolucionada, así como en su forma química potencial inducida. Las diversas investigaciones realizadas, además de sus formas de acción, se ocuparon de la efectividad de resistencia inducida en condiciones de campo^8-11.

A pesar de estas investigaciones, la base molecular de la RSA aún está en proceso de ser claramente formulada, aunque sigue siendo el modelo más investigado de la resistencia inducida en plantas (RIP), representa sólo uno de sus mecanismos de defensa multifuncional³. Las últimas investigaciones determinaron que la RSA es uno de los mecanismos de defensa multifacético inducible en plantas, según distintas vías, caracterizadas por diferentes señales, metabolitos y genes³. La RSA se define, como el proceso que depende del contenido de ácido salicílico (AS) que está involucrando en la proteína de transducción para desarrollar una respuesta de defensa¹². Un segundo proceso, llamado resistencia sistémica inducida (RSI), motivada por simbiontes, generada una vía que depende de hormonas, como el ácido jasmónico (AJ)³ y etileno¹³, y, un tercer mecanismo de defensa, llamada resistencia inducida por ácido β-amino-butírico (RI-BABA), que surgió en la última década a través del descubrimiento de que la aplicación exógena de BABA^13,14, puede activar múltiples respuestas de defensa, que potencian las defensas inducidas por AS, estimulando la deposición de calosa por patógenos, independiente del AS y AJ^3,15.

Estos mecanismos, interconectados, contribuyen en crear una red de defensas que compone el sistema inmunológico propio de la planta, que puede más apropiadamente incluirse en la resistencia inducida, RSA el más conocido, pero no el único proceso involucrado en la respuesta de defensa a patógenos^3,13.

Luego de un ataque por artrópodos herbívoros, un daño mecánico, contacto con algunos químicos, se inmuniza la planta contra infecciones posteriores por patógenos, aun cuando no lleve genes de resistencia específica del cultivar. Obviamente, el primer patógeno infectante, o un daño, indujo la expresión de reacciones de resistencia contra subsecuentes infecciones de patógenos, independientemente si son virus, hongos o bacterias. La capacidad de las células de repeler ataques subsecuentes, se dispersa a través de toda la planta, a esta respuesta llamada RSA³.

También, fue descubierta otra forma de resistencia inducida por rizobacterias promotoras del crecimiento de la planta (PGPR) denominada RSI^3,16.

Por lo que diversos autores^1,3,17, en una revisión extensa del tema, argumentaron que el sistema de defensa de la planta contiene una combinación de cambios físicos y bioquímicos^11,18, los primeros incluyen, lignificación, endurecimiento de la pared celular, formación de papilas, éste último, comprende el estallido oxidativo, la acumulación de fitoalexinas y la activación de proteínas relacionadas con la patogénesis (PRP), tales como quitinasas, β-1,3-glucanasas y peroxidasas^1,18,19. La activación de las respuestas de defensa puede lograrse mediante el tratamiento con agentes bióticos²⁰, formas avirulentas de patógenos, razas incompatibles, en ciertas circunstancias, por formas virulentas de patógenos, aceites esenciales¹⁷, extractos de plantas, hongos²¹, bacterias^18,22, virus²³, agentes abióticos^24,25 y otros²⁶.

Considerando la importancia y actualidad que adquiere en estos momentos la temática, el objetivo de la investigación fue evaluar cuatro bioestimulantes en la inducción de la resistencia sistémica en pepino (Cucumis sativus L.) y tomate (Solanum lycopersicum Mill.) en monocultivo y cultivo asociado en invernadero.

Materiales y métodos

Ubicación. La investigación fue desarrollada en un invernadero del Recinto Puerto la Boca perteneciente a la parroquia Puerto Cayo del cantón Jipijapa, que está ubicado en la latitud 1°18'20''S y longitud 80°45' 42" O, a una altitud aproximada de 53 msnm, su clima posee una temperatura de 24.8° C, la precipitación promedio anual es de 298 mm, concentrándose la mayor cantidad de lluvia en el mes de febrero, mientras que el mes más seco es en agosto²⁷.

Factores de estudio. Factor A: Sistema de cultivo (A₁ monocultivo del hibrido de pepino Intimator de Seminis, A₂ monocultivo de tomate hibrido Pawnee F1 de Enza Zaden y A₃ Cultivo combinado de pepino + tomate). Factor B: Bioestimulantes inductores de Resistencia Sistémica (B₁ Fossil, B₂ Grandsil, B₃ L-amino, B₄ Testigo (sólo aplicación de agua) y B₅ Bioremedy.

Diseño experimental. Los tratamientos utilizados en la investigación fueron distribuidos en arreglo factorial 3 x 5 y analizados en un Diseño Experimental Completamente Aleatorio (DCA)²⁸.

Análisis estadísticos. En las evaluaciones agronómicas una vez que los datos satisficieron los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza se analizó el experimento utilizando el modelo de un diseño completamente aleatorio²⁸.

Sobre la base en el modelo definido se realizaron análisis de varianza (ANVA) para probar hipótesis acerca de los efectos fijos, así como comparaciones de medias de los tratamientos mediante la prueba de Tukey Pr<0.05 de probabilidad. El ANVA también sirvió para estimar los componentes de varianza para los efectos aleatorios. Los análisis indicados se realizaron utilizando el software estadístico INFOSTAT²⁸.

Se realizó un análisis de correlación mediante el entre las variables de respuesta correspondientes. Para los mencionados procedimientos se realizará el análisis de correlación de Pearson²⁸.

Variables de respuesta. Altura de planta AP (cm). Se evaluó cinco plantas tomadas al azar dentro de cada uno de los tratamientos. Diámetro de tallo DT (mm). Fue evaluado cuando el cultivo alcanzo el 50 % de floración. Número de frutos por planta (NFru). Se evaluó en todas las cosechas. Peso del fruto PFru (kg). Se evaluó en todas las cosechas con una balanza. Volumen del fruto VFru (cm ³ ). Se aplicó la fórmula de Martel Moreno²⁹, que considera el largo, ancho y alto del fruto.

Manejo de la investigación. Fueron preparadas cámaras húmedas con papel toalla humedecida, en las cuales fueron sembradas para germinación semillas de pepino y tomate. A los cuatro días después de la germinación, fueron trasplantadas las plántulas a bandejas de almácigo con sustrato preparado con biocompost, hoja de guaba y tierra del lugar, en una proporción 2:1:1. Se adicionó 10 kg de humus y una bolsa de 10 g de micorriza para prevenir damping-off. El riego de las bandejas se realizó dos veces por día para mantener la humedad, y se aplicó el fungicida carboxin + captan (vitavax) a razón de 3 g/L, para prevenir enfermedades²⁷.

Posteriormente, se hizo una preparación manual del suelo, se removió y desterronó, luego se armó las platabandas para siembra, se las adicionó biocompost a razón de 75 kg/33 m de largo de hilera. Se formaron las platabandas de 0.80 m de ancho, 0.15 m de alto y 33 m de largo.

El trasplante definitivo a campo se realizó en las platabandas armadas, para esto se hicieron hoyos con una estaca a una profundidad de 0.15 m y una distancia de 0.30 m entre plantas dentro de la hilera, se aplicó 50 g de humus de lombriz por hoyo, y se realizó el trasplante, apretando bien el suelo para que no quede aire.

Durante el crecimiento a los 10 ddt se inició el control preventivo para los Oomycetes Pseudoperonospora cubensis y Phytophtora infestans para melón y tomate respectivamente²⁷, que recomienda iniciar con una aplicación alternada de un fungicida sistémico en base a metalaxil y mancozeb (2.5 g/L), y un fungicida de contacto como clorotalonil (2.5 mL/L), cada siete días y durante seis oportunidades durante todo el ciclo del cultivo. El fungicida sistémico no debe entrar en más de tres oportunidades para prevenir la selección de biotipos resistentes en los Oomycetes mencionados.

Para el control de insectos-plaga²⁷, realizando una aplicación alternada con un insecticida sistémico Thiamethoxan+lamda cihalotrina (0.25 mL/L) y uno de contacto (imidacloprid 0.60 g/L) y/o Neen (orgánico) 4 mL/L (aplicación alternada) en vez del insecticida de contacto. Hacer este proceso alternado durante seis semanas. Esta es una estrategia eficiente para el combate de insectos-plaga como la negrita (Prodiplosis longifilia), la mosca minadora (Liriomyza spp.), el pulgón (Myzus persicae), la polilla (Diaphania spp.), los trips (Frankliniella sp.) y la mosca blanca (Bemisia sp.).

Se aplicó una fertilización edáfica de NPK a los 30 ddt con Yaramira (2 g/planta) o solufol (100 g/20 L) cada semana y durante al menos seis oportunidades, y un fertilizante foliar con Chefare (25 mL/20 L), cada semana durante al menos seis oportunidades.

La poda se realizó en una rama principal para ambos cultivos, las hojas viejas y los brotes se eliminaron para evitar la formación de otras ramas secundarias. El tutoraje se hizo después de la poda, y luego se aplicó un fungicida de contacto (Mancozeb 0.47 g/L) para evitar enfermedades en las heridas causadas por la poda.

El riego de las plantas se aplicó por goteo, dos veces por día, durante 15 a 20 min en cada riego.

La cosecha se la realizó a partir de los 120 ddt en el cultivo de tomate, y a los 60 ddt en el pepino.

Resultados

El análisis de normalidad para las variables evaluadas mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov al P<0.05 de probabilidad no fue significativa, lo que se sugirió que las variables tuvieron distribución normal. Asimismo, se determinó a través de la prueba de Chi Cuadrada al P<0.05 de probabilidad que no hubo diferencias significativas entre las varianzas, denotando que hubo homogeneidad de varianzas.

Análisis de varianza. El ANVA para cultivo, con diferencias altamente significativas al P<0.01 de probabilidad AP, TFru y DFru. El tomate en monocultivo, presentó diferencias altamente significativas para PFru, TFru y DFru (Tabla 1). Asimismo, el tomate en sistema combinado con diferencias altamente significativas para todas las variables evaluadas. Esto estaría indicando que al menos uno de los tratamientos realizados tuvo un efecto diferenciado en los cultivos asociados de pepino y tomate, y en el monocultivo de tomate. Los coeficientes de variación (CV), estuvieron entre 2 a 33 %, rango permitido en este tipo de investigaciones (Tabla 1).

Análisis de medias para monocultivos. El análisis de comparación de medias para monocultivo de pepino mediante la prueba múltiple de Tukey al P<0.05 de probabilidad (Tabla 2), solamente con diferencias significativas para AP, Bioremedy, Fossil, L-amino y testigo sobresalieron respecto a Grandsil. Pero, analizando la tendencia de los promedios del PFru resaltaron el Grandsil y L-amino respecto del testigo, el Fossil y Bioremedy, aunque no se observaron diferencias significativas.

Respecto al monocultivo de tomate, el análisis de comparación de medias mediante la prueba múltiple de Tukey al P<0.05 de probabilidad (Tabla 3), con diferencias significativas para NFlo, PFru, TFru, DFru y NFru. Sobresalió NFlo para Bioremedy respecto del Fossil, con menos flores. Resaltó el PFru con Bioremedy respecto del testigo y los demás tratamientos. En TFru con Bioremedy sobresalió, con excepción del testigo y en el NFru resaltó el Bioremedy respecto del testigo y los demás tratamientos.

Análisis de medias para cultivos asociado. El análisis de comparación de medias para cultivo asociado de pepino mediante la prueba múltiple de Tukey al P<0.05 de probabilidad (Tabla 4), solo hubo diferencias significativas para todas las variables evaluadas. En AP fue el Bioremedy. L-amino y Fossil vs. el testigo y el Grandsil. Para NFlo sobresalió con Bioremedy en comparación al testigo. Para PFru resaltó, Bioremedy respecto del testigo. Para TFru se destacaron L-amino, el Bioremedy y el testigo en referencia al Fossil. Para el DFru resalto L-amino vs. el Fossil y finalmente para el NFru se observó con el Bioremedy fue el destacado versus el testigo y los demás tratamientos.

El análisis de comparación de medias para cultivo asociado de tomate mediante la prueba múltiple de Tukey al P<0.05 de probabilidad (Tabla 5), con diferencias significativas para todas las variables evaluadas. En AP con Bioremedy comparado con el testigo. Para DT se distinguió con Bioremedy versus el testigo. Para DT resaltó con Bioremedy respecto del L-amino. Para PFru resaltó con Bioremedy en referencia al testigo. Para TFru destacó con Bioremedy versus. los demás tratamientos. Para el DFru sobresalió con Bioremedy respecto del testigo y los demás tratamientos y finalmente para el NFru se observó que fue sobresaliente con el Bioremedy versus el testigo y los demás tratamientos.

Discusión

En la presente investigación se evaluaron el comportamiento morfológico y agronómico de dos cultivos taxonómicamente diferentes, una perteneciente a las Solanáceas, como es el tomate (S. lycopersicum) y otra perteneciente a las Cucurbitáceas como es el pepino (C. sativus). Diversas experiencias manifestaron que el cultivo asociado con diferentes especies, trae consigo beneficios sustanciales^30,31, en principio no comparten los mismos tipos de plagas y enfermedades, respecto a cuándo son cultivadas en monocultivo. Además, se utilizó cuatro tipos de bioestimulantes orgánicos, para observar su efecto en monocultivo como en cultivo asociado. Nuestra experiencia expresa evidencias de un comportamiento diferenciado, denotando en general que los bioestimulantes dieron una respuesta en cultivo asociado que en monocultivos.

Es importante señalar, que inocular en los cultivos bioestimulantes como las RPCV, reduce sustancialmente el uso de fertilizantes sintéticos y los impactos negativos al suelo, aumentando el rendimiento de los cultivos, contribuyendo a la economía del productor y a la alimentación de la población^32,33. Las interacciones de RPCV con el medio biótico-plantas y microorganismos son muy complejas y utilizan diferentes mecanismos de acción para promover el crecimiento de las plantas³⁴.

Los bioestimulantes tienen un efecto en la RSI del cultivo de pepino y tomate, por lo que están involucrados en los mecanismos de defensa de la planta y reúnen los requerimientos de seguridad en la aplicación en condiciones de invernaderos y campo, no causa toxicidad a plantas, no tiene efectos negativos en el crecimiento vegetal, incentiva el desarrollo vegetal, mejora el rendimiento, se emplea en bajas concentraciones, inducen un amplio espectro de defensas, produce efecto de protección duradera y son de reducido costo económico³⁵.

Peteira et al.³⁵, observaron el efecto de fitomas en la inducción de diferentes sistemas enzimáticos, relacionados con los mecanismos de defensa en plantas de arroz infestadas con Steneotarsonemus spinki y comparó con el efecto provocado por el BION en idénticas condiciones. Sus resultados expresaron que la aplicación de fitomas fue tan efectiva en la disminución de las poblaciones del ácaro como la aplicación del BION y que provocó la activación de enzimas como las peroxidasas, polifenoloxidasas, fenilalanil amonio liasas y quitinasas.

Ribaut & Poland³⁴, mencionan que los bioestimulantes aplicados a las plantas desarrollan mecanismos de defensa complejos y variados. Éstos, pueden ser constitutivos o inducibles. Los inducibles pueden activar sistémicamente a células y tejidos alejados, adquiriendo la planta una inmunidad fisiológica. En este sentido, la inducción de RSA y con ello, de un conjunto de proteínas y compuestos de defensa que incluyen enzimas involucradas en la vía de síntesis de los fenilpropanoides, Fenilalanina amonio liasa (PAL), Chalcona sintasa (CHS), Peroxidasas (PO), entre otras), glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (Hyp), relacionadas con el reforzamiento de la pared celular, y Glucanasas y Quitinasas que hidrolizan las paredes celulares de los hongos, entre otras.

Burbano-Figueroa¹¹, menciona que el efecto contaminante y la posibilidad de que los patógenos desarrollen resistencia a los plaguicidas químicos provocaron su desuso en los últimos años. También se ha probado el desarrollo de variedades resistentes a la pudrición causada por Fusarium con resultados no tan promisorios en producciones comerciales de tomate³⁶. En tal sentido, los estudios han sido dirigidos al uso de estrategias de control biológico para el manejo de la mancha del tomate causada por Fusarium usando agentes de biocontrol tales como Pseudomonas fluorescens¹⁶, Trichoderma harzianum y Glomus intraradices, que son hongos micorrízicos arbusculares, los cuales aparte del efecto directo contra el patógeno, han señalado un efecto de inducción sistémica de la resistencia de la planta. Varias especies de Trichoderma y aislados de Pseudomonas han resultado ser eficientes en el control de fusariosis en tomate^16,36.

En nuestro experimento pudimos determinar que el Bioremedy resultó ser una alternativa para su uso en cultivo asociado, aunque también recomendable en monocultivo. El Bioremedy un bioestimulantes en base a ácidos húmicos, malto dextrina, sacarosa, extracto de algas y aminoácidos totales, incentiva el desarrollo de rizobacterias que promueven el crecimiento de la planta, bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre, bacterias promotoras de enzimas extracelulares, hongos que promueven la descomposición, transformación y ciclo de los nutrientes del suelo³⁷.

Destacar que los bioestimulantes como el L-amino y Grandsil, son recomendables para su uso, debido a que el Grandsil es un biocatalizador que estimula la función de respiración, endurece el tallo, hojas y raíces que las hace resistentes y estimula los mecanismos de defensa contra los hongos¹⁶. El L-amino es un complejo de aminoácidos que se utiliza como bioestimulador foliar y puede incrementar la resistencia de la planta a condiciones adversas³⁸ y finalmente Grandsil contiene silicio, potasio y ácido monosilícico y actúa como potenciador agrícola, aumentado la conductividad eléctrica, regenerando una mayor capacidad de intercambio catiónico, incorporando minerales insolubles, estimulando la actividad microbiana en el suelo, mejora la estructura de los suelos y por ende el manejo del agua, como consecuencia las plantas tendrán accesos a mas nutrientes, resistirán mejor el estrés e incrementar notablemente la produccion¹⁶.