Introducción

Los antibióticos constituyen al tratamiento de enfermedades infecciosas. El desarrollo de mecanismos evolutivos, por parte de los microorganismos para evadir la acción antibiótica, genera riesgos en la terapia y la salud, animal como humana. A pesar de los avances en la investigación, búsqueda y desarrollo de nuevos antimicrobianos, frecuentemente se reportan situaciones difíciles, al tratar infecciones bacterianas que, por su uso indiscriminado presentan, resistencia a estos¹.

Durante los últimos años diversos microorganismos han desarrollado resistencia a diferentes drogas utilizadas para su control. Dentro de estos, se destaca la alta resistencia que presentan Escherichia coli y Staphylococcus aureus a los antibióticos, constituyéndose las principales causas de enfermedades intrahospitalarias². S. aureus presenta resistencia a la meticilina entre un 50 a 85 % de los aislados en todo el mundo³.

Los estafilococos son microorganismos aerobios Gram-positivos. El más patogénico de ellos, S. aureus, típicamente es causante de infecciones de la piel, a veces neumonía, endocarditis y osteomielitis, en general se lo asocia con la formación de abscesos. Algunas cepas elaboran toxinas que causan gastroenteritis, síndrome de la piel escaldada y síndrome de shock tóxico. El diagnóstico se realiza con tinción de Gram y cultivo, en su tratamiento suele incluirse beta-lactámicos resistentes a las penicilinasas, pero como es frecuente la resistencia a antibióticos puede ser necesario el uso de vancomicina u otros fármacos más modernos⁴.

Debido a la alta resistencia de los patógenos en México frente a los diversos tratamientos con antibióticos sintéticos como: ampicilina, ciprofloxacino, ceftriaxona (los que han demostrado susceptibilidad por debajo del 60 %), se buscan tratamientos de origen natural y amigables para el medio ambiente⁵.

El propóleo es un producto natural e inocuo empleado en la medicina tradicional desde tiempos ancestrales, por sus propiedades biológicas, una sustancia de composición compleja y aspecto resinoso, elaborado por abejas Apis melífera L. a partir de la vegetación adyacente a la colmena, estos insectos colectan los exudados de las plantas, tejidos dañados como medida de protección, resinas, lacas, gomas y aceites⁶.

La actividad biológica de los propóleos se debe a su composición química a base de: 55 % de resinas y bálsamos, 30-40 % de cera de abeja, 5-10 % de aceites esenciales o volátiles, 5 % de polen y de otros materiales orgánicos y minerales⁷. La fracción resinosa del propóleos está integrada por compuestos fenólicos y flavonoides que son muy importantes a nivel terapéutico⁸, presentan un efecto sinérgico esencial para las actividades biológicas benéficas en humanos como animales: antibacteriana, antifúngica, antiviral, antioxidante, inmunomoduladora, entre otras⁹.

Debido a la capacidad antimicrobiana que proporcionan los polifenoles, en mayor parte, flavonoides, esteres y ácidos fenólicos, se atribuyen a los propóleos diferentes efectos benéficos para la salud¹⁰.

Entre otros compuestos del propóleos aparte de los polifenoles se encuentran: ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido isoferúlico, ácido 3,4-dimetoxicinámico, pinobanksina, éster bencílico del ácido cafeico, éster fenetílico del ácido cafeico, apigenina, pinocembrina, crisina y galangina, etc¹¹. Los flavonoides, ácidos aromáticos, diterpenoides y compuestos fenólicos se consideran como los principales constituyentes químicos responsables de las propiedades biológicas del propóleos¹².

La actividad antimicrobiana, una propiedad fundamental de los propóleos, su acción bacteriostática, bactericida está basada en la inhibición de ácidos nucleicos y degradación de la membrana citoplasmática, principalmente se le atribuye a los flavonoides como pinocembrina, quercetina, naringenina, acacetina, apigenina, crisina, galangina, kaempferol y pinobanskina¹³, así como alteración en los canales iónicos a consecuencia de reacciones de fosforilación y desfosforilación, disminuyendo la inhibición de la motilidad bacteriana.

Akca et al.¹⁴ plantean, que los mecanismos antimicrobianos que muestran los flavonoides son: inhibición de la motilidad, inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos, inhibición de las funciones de la membrana citoplasmática, inhibición del metabolismo energético, inhibición de la unión y formación de biopelículas, inhibición de las porinas y atenuación de la patogenicidad.

Los flavonoides son compuestos conformados por dos anillos fenilo, A y B, unidos a través de un anillo C de pirano con grupos funcionales adicionales, lo que genera diferentes tipos de flavonoides, como las chalconas, flavanonas, flavonas, flavonoles, proantocianidinas, antocianidinas, flavandioles, isoflavonas y auronas, compuestos que le dan las características antioxidantes, antimicrobianas, cicatrizantes, antiinflamatorias¹⁵.

Aparte del papel activo que juegan los flavonoides en la destrucción de los organismos, afectan fuertemente los tejidos conectivos al inhibir algunas de las enzimas que pueden hidrolizar su red de proteoglicanos y proteínas. Esta malla dificulta estéricamente la difusión de organismos infecciosos a través del tejido¹⁶.

Dada sus propiedades antimicrobianas, el propóleos es objeto de innumerables estudios donde se evaluó el efecto inhibitorio sobre bacterias como: E. coli, Lactobacillus plantarum, S. aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, Listeria monocytogenes, L. innocua, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, S. enteritidis, Streptococcus agalactiae, S. mutans, Bacillus cereus, B. subtilis, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Shigella dysenteriae, Yersinia enterocolitica, Pantoea agglomerans, Vibrio cholerae, entre otras, los resultados son variables aun tratándose del mismo microorganismo^12,17.

Ensayos in vitro han demostrado que los extractos de propóleos son más eficaces frente a los cocos Gram (+) (S. aureus, Streptococcus β-haemolyticus) y que solo actúan frente a algunas bacterias Gram (-) como E. coli o P. aeruginosa¹⁸.

Autores como Gil et al.¹⁹ y Agurto Mendizábal & Cuya López²⁰ obtuvieron actividad antimicrobiana con efecto bacteriostático parcial y bactericida al aplicar extractos etanólicos de propóleos venezolanos, europeos y mexicanos²⁰, contra el S. aureus, al utilizar concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) de 1 % y 2 %, y CMI de 62.5 μg/mL y 125 μg/mL.

Al considerar que el uso excesivo de antibióticos acarrea la resistencia antimicrobiana de las bacterias, y resulta necesario estudiar tratamientos de origen natural contra ellas, el objetivo de este trabajo se basó en realizar una comparación de los halos de inhibición de una muestra de S. aureus luego de aplicar de manera in vitro discos de antibiograma de ocho antibióticos utilizados en salud y discos de cuatro concentraciones etanólicas de propóleos, con el fin de obtener resultados satisfactorios con las soluciones de propóleos y así contar con un producto natural e inocuo para el enfrentamiento del microorganismo analizado.

Materiales y métodos

La cepa de S. aureus que se empleó en esta investigación partió del banco de cepas perteneciente al Centro de Higiene y Epidemiología de la provincia de Sancti Spíritus, Cuba, se aisló de un paciente que presentaba una lesión de piel. En el Laboratorio de Referencia para Investigaciones y Salud Apícola (LARISA), el microorganismo se sembró en medio agar nutriente (AN), después de su incubación y crecimiento a 37 ºC/ 24 h, se conservó en refrigeración, hasta el momento de su uso para el trabajo investigativo, dicha bacteria se confrontó a ocho antibióticos, así como, a cuatro diluciones alcohólicas de propóleos. El propóleos fue adquirido en la Empresa APICUBA, encargada de comercializar este producto de la colmena.

Las diluciones de extractos etanólicos de propóleos (EEP) se prepararon con agua destilada, alcohol y propóleos bruto según el volumen a preparar y cantidad en gramos de dicho producto que se necesitaba para cada dilución. Para realizar las diluciones se tomó en cuenta el método descrito por Sforcin²¹, quien utilizó 30 g de propóleos para elaborar una dilución en 100 mL de alcohol al 70 %, aunque en las condiciones del laboratorio se partió de una muestra de propóleos (30 g), a la que se le adiciono 100 mL de alcohol al 96 %, de esta formulación pura, se realizaron los distintos cálculos de las diluciones con menor concentración de propóleos y alcohol. Luego de elaborar las cuatro soluciones, estas se mantuvieron en recipientes ámbar resguardados de la luz durante 14 días. Varias veces al día todas las diluciones se homogenizaron para ayudar al propóleos a aportar sus propiedades bioactivas en el preparado etanólico.

Al final del plazo las diluciones fueron depuradas en papel de filtro estéril, manteniéndose los extractos en frascos ámbar a temperatura ambiente.

En la investigación se utilizaron además discos de antibiograma de ocho antibióticos usados en el control de la bacteria nombrada anteriormente, fueron proveídos por el Ministerio de Salud Pública de Cuba, correspondientes a la Marca Liofilchem, Italia con número de Lote: 093019116.

En el trabajo de laboratorio, bajo condiciones de esterilidad dentro de una Cabina de Seguridad Biológica, se utilizaron dieciocho placas Petri estériles con el medio de cultivo AN, en cada una de las placas se realizó la siembra de S. aureus luego de tomarse una azada bien cargada de un cultivo previo. En el medio se estriaron las colonias de bacteria, efectuándose este proceso a todo lo ancho de las placas. Con ayuda de un lápiz cristalográfico se dividieron en cuatro cada placa. En cada sección enmarcada se detalló el antibiótico que se utilizaría para verificar la CMI de S. aureus, por lo que, seis placas contenían los discos de antibiograma de: amikacina, cloranfenicol, tetraciclina y penicilina, y otros seis con los discos de: doxiciclina, ciprofloxacino, cotrimoxazol y eritromicina. En las restantes seis placas se adicionaron discos de papel de filtro previamente esterilizados y embebidos durante 24 h con las diluciones de propóleos 20, 15, 10 y 5 %. Luego, todas las placas se encubaron a 37 ºC/ 24 h, después se midió los halos de inhibición, producidos por los antibióticos como las diluciones etanólicas del propóleos.

Al no contarse en el laboratorio con el medio de cultivo agar Mueller Hilton (ANH), medio ideal para la lectura del antibiograma, se empleó AN, donde también se comprobó el crecimiento e inhibición de S. aureus.

Para realizar el análisis estadístico de los resultados se utilizó Statgraphics Versión 5.1 en español para Windows²², se realizaron las Pruebas de Contraste t de comparación de medias (t-test) para conocer si existían diferencias significativas en los resultados obtenidos para los diferentes porcientos a los que se aplicaron las tinturas del propóleos.

Resultados

De los ocho antibióticos utilizados, se obtuvo actividad antimicrobiana frente a S. aureus con siete de ellos, la eritromicina no mostró inhibición (Tabla 2). Las cuatro diluciones etanólicas de propóleos dieron halos de inhibición contra el microorganismo en mayor o menor medida. Aunque con la mayoría de los antibióticos se alcanzaron halos superiores a los obtenidos con las soluciones de propóleos, sus halos presentaron similitudes a los producidos por los antibióticos, además, al comparar las diluciones de propóleos al 10 y 5 %, obtuvimos halos de inhibición mayores a los reportados por la penicilina (Tabla 3).

Al realizar el análisis estadístico entre los antibióticos se obtuvieron diferencias que beneficiaron principalmente al cloranfenicol, doxiciclina, ciprofloxacino y cotrimoxazol. La amikacina y tetraciclina mostraron diferencias altamente significativas al compararlas con la penicilina.

Figura 1 Medias obtenidas al promediarse los halos de inhibición de las seis réplicas de antibióticos amikacina y cloranfenicol, luego de las lecturasLetras diferentes expresan diferencia significativa, beneficiándose el cloranfenicol con un P-Valor = 0.0470679 

Figura 2 Medias obtenidas al promediarse los halos de inhibición de las seis réplicas de antibióticos amikacina y ciprofloxacino, luego de las lecturas Letras diferentes expresan diferencia significativa, beneficiándose la ciprofloxacino con un P-Valor = 0.00419613 

Las medias obtenidas al promediarse los halos de inhibición de las seis réplicas de antibióticos amikacina y cloranfenicol (Figura 1), amikacina y ciprofloxacino (Figura 2), cotrimoxazol y penicilina (Figura 3), luego de las lecturas al cabo de 24 h de incubación.

Como se menciona con anterioridad al comparar los halos producidos por la amikacina y la tetraciclina, con los de la penicilina, se encontraron diferencias altamente significativas con valores de p=0.000105 644 y 0.0000178965, contra el S. aureus.

Figura 3 Medias obtenidas al promediarse los halos de inhibición de las seis réplicas de antibióticos cotrimoxazol y penicilina, luego de las lecturasLas Letras diferentes expresan diferencia significativa, beneficiándose el cotrimoxazol con un P-Valor= 0.00132035 

En la Figura 4 los halos de inhibición frente a S. aureus producto a la acción antimicrobiana de los antibióticos, así como, la ausencia de halos por parte de la eritromicina.

Durante el análisis estadístico de las cuatro concentraciones etanólicas de propóleos se encontró diferencias entre las diluciones del 20-10, 20-5, 15-10 y 15-5 %, siendo beneficiadas las soluciones del 20 y 15 %. Al comparar las tinturas de propóleos con los antibióticos, se obtuvieron diferencias que favorecieron a la mayoría de los antibióticos. Entre la dilución del 20 % y la amikacina, tetraciclina, cotrimoxazol no se encontraron diferencias estadísticas al contar con resultados similares en cuanto a los halos de inhibición de la bacteria estudiada. Solo se alcanzaron diferencias significativas al confrontar las concentraciones de propóleos del 20 y 15 %, y compararlas con los resultados arrojados por la penicilina (P= 0.000947989 y 0.00329998). Aunque las diluciones del 10 y 5 % mostraron halos de inhibición mayores a los producidos por este último antibiótico, no arrojaron diferencias estadísticas.

Figura 4 Halos de inhibición del Staphylococcus aureus producidos por siete de los antibióticos utilizados en la investigaciónComo se aprecia, la bacteria también es inhibida en medio agar nutriente, en ausencia del medio agar Mueller Hilton. 

En las Figuras 5 y 6 los resultados de las medias obtenidas al promediarse los halos de inhibición de las seis réplicas de propóleos al 20 y 10 % (Figura 5), propóleos al 15 y 5 %, (Figura 6) luego de las lecturas al cabo de 24 h de incubación.

Figura 5 Medias obtenidas al promediarse los halos de inhibición de las seis réplicas de propóleos al 20 y 10 %, luego de las lecturasLetras diferentes expresan diferencia estadística significativa, beneficiándose la solución del 20 % con un P-Valor= 0.00294017 

Además de estos análisis entre las soluciones etanólicas del propóleos, también se obtuvieron diferencias estadísticas significativas al comparar las tinturas del 20-5 y 15-10 %, viéndose favorecidas en todo momento, las diluciones del 20 y 15 %.

Figura 6 Medias obtenidas al promediarse los halos de inhibición de las seis réplicas de propóleos al 15 y 5 %, luego de las lecturasLetras diferentes expresan diferencia estadística significativa, beneficiándose la solución del 15 % con un P-Valor= 0.012966 

Se puede advertir con claridad la inhibición producida por las cuatro soluciones etanólicas de propóleos, las que podrían haber sido mayores, de mantenerse en incubación por 24 h más, pero se decidió concluir la investigación con un tiempo igual al utilizado con los antibióticos.

Figura 7 Se observan los halos de inhibición de la bacteria S. aureus producto a la acción antimicrobiana del propóleos 

Discusión

García Rodríguez et al.²³ exponen en un trabajo previo, los patrones estándar del halo de inhibición para S. aureus frente a un gran número de antibióticos, algunos de estos se utilizaron en esta investigación: penicilina (resistente halos ≤ 28 mm, no hay rango para intermedio, mientras que, la bacteria sería sensible halos ≥ 29 mm), eritromicina (resistente halos ≤ 13 mm, intermedio 14-22 y sensible ≥ 23 mm), ciprofloxacino (resistente halos ≤ 15 mm, intermedio 16-20 y sensible ≥ 21 mm), cloranfenicol (resistente halos ≤ 12 mm, intermedio 13-17 y sensible ≥ 18 mm), tetraciclina (resistente halos ≤ 14 mm, intermedio 15-18 y sensible ≥ 19 mm). Al analizar los promedios que alcanzaron algunos de los antibióticos que se utilizaron en este trabajo, luego de compararlos con los patrones estándar del halo de inhibición propuestos por García Rodríguez et al.²³, Staphylococcus spp., muestra sensibilidad a ciprofloxacino y cloranfenicol, mientras que, frente a tetraciclina su inhibición recae al rango intermedio.

Según Mensa et al.²⁴ más de 90 % de aislados S. aureus producen betalactamasas que inactivan la penicilina, siendo una de las causas que en dicha investigación la penicilina provocó menor inhibición de S. aureus. Koneman et al.²⁵ plantean, que S. aureus desarrolla resistencia a antibióticos como penicilina y eritromicina, coincidiendo nuestros resultados con lo expuesto por dichos autores.

La actividad antimicrobiana del propóleos se atribuye a sus compuestos: ácidos fenólicos, cumarinas, alcaloides, flavonoides, ésteres, aldehídos fenólicos y cetonas un alto potencial antimicrobiano, acción antibiótica, fungicida, antiviral y antitumoral, entre otras^26-28. La presencia de triterpenos pentacíclicos constituye una característica importante de la composición química del propóleos, vinculada a su actividad antiinflamatoria, anticancerígena y antiviral²⁹. Boisard et al.³⁰ en estudios antimicrobianos in vitro con propóleos revelaron que la actividad inhibitoria frente a bacterias Gram-positivas pertenecientes a los géneros Staphylococcus y Streptococcus, está dada por la pinocembrina, un flavonoide presente en dicho producto de la colmena. Según Popova et al.³¹, las abejas A. melífera elaboran propóleos ricos en diterpenos totarol y totarolona, quienes han mostrado actividad antimicrobiana contra S. aureus. Trusheva et al.³² plantean que la propolina C, D, F y G inhiben el crecimiento de cepas bacterianas Gram-positivas (S. aureus, B. subtilis, L. monocytogenes y Paenibacillus larvae), mostrando la propolina C, la mayor actividad antibacteriana contra la bacteria estudiada, quien fue resistencia a la meticilina, quedando demostrado que los Gram-positivos presenten elevada susceptibilidad a la acción de los principios activos del propóleos, ya que, la pared celular de estas bacterias está formada por un solo tipo de molécula en comparación con las bacterias Gram-negativas, que tienen su pared compuesta por varias capas, y por ende, son más resistentes a la actividad antimicrobiana de dicho producto de la colmena³³.

Los resultados alcanzados con las soluciones EEP muestran halos de inhibición mayores y también en menor escala a los obtenidos por Ferreira Bastos et al.³⁴, en su investigación aplicaron contra S. aureus dieciséis muestras de propóleos, alcanzando halos de inhibición entre 8 y 23 mm. Datos semejantes a los de esta investigación fueron reportados por Kujumgiev et al.³⁵, en un estudio de la actividad antimicrobiana del propóleos de diferentes países, obtuvieron halos de inhibición entre 11 y 29 mm para S. aureus. Tovalino & Contreras³⁶, in vitro investigaron el efecto antibacteriano de dos soluciones de propóleos de Oxapampa-Perú (10 y 30 %) contra S. aureus (ATCC 25923), al 30 % mostró mayor inhibición con una media de 11.77 mm. En esta investigación se obtuvieron resultados superiores con las cuatro diluciones utilizadas. Gómez et al.³⁷, utilizaron concentraciones de EEP 20, 40, 60, 80 y 100 % (diluciones en alcohol al 96 %), contra el S. aureus en la que alcanzaron halos entre 13 y 17 mm, determinándose la dilución 20 % como la de mayor CMI. Cabrera-Rojas³⁸, utilizó soluciones etanólicas de propóleos entre 90, 80, 70 y 60 % contra la bacteria estudiada, y obtuvieron halos de inhibición de 28.5 mm, 27.5 mm, 17.1 mm y 8.5 mm. Las diluciones de 90 y 80 % provocaron los mayores halos, y fueron más elevadas que las obtenidas en nuestro trabajo, aunque, con las concentraciones del 70 y 60 % utilizadas por el autor, obtuvieron halos que coinciden con los alcanzados en esta investigación, y también menores, quedando demostrado que, con soluciones más bajas, se logra la inhibición de dicho microorganismo. Bucio-Villalobos & Martínez-Jaime³⁹, obtuvieron halos de inhibición de 1.6 cm con EEP. Gil et al.¹⁹ en su investigación mediante la técnica de macro dilución en tubo demostraron que S. aureus puede ser inhibido con EEP en concentraciones muchos más bajas de 2 y 1 %. Agurto Mendizábal & Cuya López²⁰ alcanzaron halos de inhibición de 12 mm al utilizar EEP procedentes de Ayacucho y Huaral (México), contra el S. aureus. Iguales resultados se obtuvieron en este trabajo con diluciones de 10 y 5 %, en las que además se observaron halos de 13 y 14 mm.

Díaz-Mena et al.⁴⁰, al evaluar la actividad antimicrobiana de EEP cubanos por el método de dilución en agar demostró que los EEP presentaron un efecto marcadamente mayor frente a bacterias Gram-positivas, con valores de CMI entre 0.025 y 10 %, coincidiendo sus resultados con los de nuestra investigación, se obtuvo inhibición del crecimiento de S. aureus, Gram-positiva, con una concentración de 10 %. Otros investigadores como Mercan et al.⁴¹ y Gonsales et al.⁴² encontraron actividad antibacteriana en muestras de propóleos de Turquía, Panamá y Sao Paulo, contra bacterias Gram-positivas, como el S. aureus.

Según Moreno et al.⁴³, durante su investigación con diluciones de propóleos, cuando S. aureus se incuba 48 h, se incrementa su efecto bactericida. En su estudio concluyeron que, el 70 % de las muestras de propóleos incrementó su actividad antimicrobiana luego de un tiempo de incubación de 48 h al compararlo con el efecto detectado a las 24 h. Como en esta investigación las lecturas tanto para los antibióticos como para las diluciones de propóleos se realizaron a las 24 h de incubación, este tiempo pudo influir en que no se obtuvieran halos de inhibición mayores para las concentraciones de propóleos, de haberse mantenido en incubación por dos días.

Al tomar en consideración la investigación de Bucio-Villalobos & Martínez-Jaime³⁹ quienes comprobaron que al utilizar el etanol como un tratamiento de control contra S. aureus dicho reactivo no provocó ningún efecto inhibitorio, en comparación con la inhibición provocada por el EEP, se decidió no aplicarlo como otro tratamiento de control, en este trabajo.

El EEP puede ser una alternativa en tratamientos antibacterianos, pues es un producto natural al cual no se le ha demostrado resistencia y cuya única contraindicación hasta ahora es que el paciente sea alérgico a los productos apícolas⁴⁴.

De los ocho antibióticos utilizados en la investigación solo la eritromicina no produjo inhibición de S. aureus en comparación con las cuatro diluciones etanólicas del propóleos, se obtuvo inhibición de la bacteria con todas las soluciones. Frente a los patrones con los que se cotejaron los halos de inhibición producidos por los antibióticos, el microorganismo resultó sensible al ciprofloxacino y cloranfenicol, ante la tetraciclina su inhibición recayó en el rango de intermedio. La acción antimicrobiana de la penicilina se vio inactivada por las betalactamasas que produce este microorganismo al entrar en contacto con este antibiótico. Las concentraciones de propóleos 20 y 15 % provocaron los mayores halos de inhibición del microorganismo por parte de este producto de la colmena. Durante el análisis estadístico ambas concentraciones arrojaron diferencias significativas al comparar los halos producido por estas, con los obtenidos con el antibiótico penicilina. Aunque los halos derivados por los EEP del 10 y 5 % fueron mayores a los de la penicilina, no se obtuvo diferencia estadística al compararlos con dicho antibiótico. Todas las soluciones de propóleos arrojaron inhibición del microorganismo analizado y, aunque en este trabajo no se comprobó la presencia de sus compuestos bioactivos como se citaron por algunos autores, se puede estimar por los resultados alcanzados, que el propóleos cubano cuenta con dichas propiedades biológicas.