Introducción

En México, el cereal Hordeum vulgare o Hv (cebada) es de los más consumidos por humanos y animales¹, se cultiva mediante un sistema agrícola de producción intensiva con aplicación de plaguicidas y fertilizantes químicos², que en el suelo inducen la proliferación de propágulos de hongos mitosporicos, lo que provoca que los granos de Hv se contaminen por géneros y especies fúngicas de Aspergillus, Penicillium y Fusarium, con capacidad genética de sintetizar aflatoxinas (micotoxinas): que son metabolitos secundarios, generados cuando las condiciones ambientales de transporte, almacenamiento y/o de comercialización, tales como la humedad cuando supera el 50 % y la temperatura tiene intervalos de 20-33 ºC o mayores³ las que permiten posteriormente el crecimiento de estos géneros fúngicos, que sintetizan una amplia diversidad de micotoxinas del tipo: fumonisinas, tricotecenos, zearalenona y la ocratoxina A (OTA) en los granos⁴, estos hongos y la síntesis de OTA pueden ser detectadas en medios de cultivo artificiales como el agar dextrosa Sabouraud (ADS).

Este hecho es importante, pues los granos de Hv son utilizados en la alimentación de humanos y animales⁵, en específico cuando se comercializan en zonas urbanas como la ciudad de Morelia, Mich, México. Las micotoxinas producidas por hongos en los granos de Hv son un riesgo de salud pública y animal ya que, al ingresar por la vía oral en función de la dosis consumida, pueden causar desde una intoxicación aguda hasta crónica, e incluso ciertos tipos de cáncer y/o la muerte. Por lo anterior los objetivos de esta investigación fueron en: i) analizar la densidad de propágulos de Aspergillus fumigatus de granos de H. vulgare (Hv) comercializados en la ciudad de Morelia, Michoacán, México ii) demostrar la capacidad potencial de A. fumigatus en la generación de ocratoxina A en ADS.

Materiales y métodos

La cebada (Hv) así como el Humulus lupulus (lúpulo) o Hl para la cereza artesana se colectaron de almacenes de granos de Morelia, Mich, México. Las zonas se seleccionaron en las direcciones cardinales convencionales: norte (N), este (E), oeste (O), sur (S) y centro (C), cada muestra de 1 kg se etiquetó como N-Hv, E-Hv, O-Hv, S-Hv y C-Hv. Los granos se transportaron al laboratorio a 12 ºC en bolsas de plástico estériles. El conteo y aislamiento de Aspergillus, se realizó por método de cuento viable en placa según Pitt & Hocking⁴. Para ello, se suspendió 1 g de granos de Hv o de Hl en 9.0 mL de solución salina (NaCl) al 0.85 %, plus 0.01 g de detergente comercial la Corona^MR ajustado a pH a 6.5, cada tubo se agito/30 min en un Vortex, después la solución salina plus detergente con los granos de Hv o Hl se diluyó hasta 10^-7, cada dilución se sembró en ADS con la siguiente composición química (g/L): 25.0 de glucosa, 10.0 de peptona, 1.0 de extracto de levadura, 18.0 agar ajustado a pH de 5.6 para inhibir el crecimiento bacteriano de los granos. Las cajas ADS se incubaron a 28-30 ºC/3-5 días, la técnica de cuenta viable en placa, se realizó por triplicado y el conteo de las colonias de Aspergillus se expresó por el promedio de unidades formadoras de propágulos por gramo de Hv o Hl (UFP/g de grano). Las colonias representativas de Aspergillus de cada placa se aislaron y conservaron en suelo estéril a 4 ºC, para la determinación de la capacidad potencial de síntesis de OTA en ADS bajo la presunción de que la composición química sería suficiente no solo para el aislamiento de los hongos sino también para la demostración de la síntesis de la OTA como evidencia de que estos hongos tienen la capacidad genética de expresar esta propiedad en el ADS, y a la vez permite la identificación de las especies de acuerdo a características reproductivas del género y PCR relacionadas con A. fumigatus⁶. La síntesis de OTA por A. fumigatus se detectó cualitativamente por una lámpara UV en el ADS, lo que se usó para la extracción de esta toxina a partir de 2.5 g del ADS del sitio de liberación de la OTA por A. fumigatus. Esta OTA se extrajo por el método Soxhlet con éter dietílico como disolvente a 37 ºC, entonces la toxina separada se colocó en tubos Eppendorf, se cubrió con papel de aluminio y conservo a 0 ºC en congelador, mientras para determinar la concentración de la OTA, se prepararon soluciones estándar de OTA (> 98 %, Sigma-Aldrich) en etanol para obtener la curva de calibración en un espectrofotómetro (VE-5000), a 350 nm^3,8,10_. Los datos experimentales se analizaron mediante ANOVA/Tukey α = 0.05 y el software Stat Graphics Centurion⁷.

Resultados

El principal género y especie de hongo detectado en los granos de Hv o Hl de acuerdo con las estructuras reproductivas y genéticas, fue: A. fumigatus, con potencial de síntesis de OTA en ADS.

En la Tabla 1 se muestra que independientemente de la zona de venta de Hv en los 5 puntos cardinales: norte (N), sur (S), este (E), oeste (O), y centro (C) de la ciudad de Morelia, Mich, México. Todos los granos de Hv y Hl analizados estaban contaminados por propágulos de A. fumigatus, el porcentaje detectado en los granos de Hv con la mayor densidad de propágulos fue el comercio del S-Hv con 205 UFP/g de cebada, la menor en los granos en un comercio del norte (N-Hv) con 49 UFP/g de cebada. En esta Tabla también se indica la concentración de la OTA sintetizada por A. fumigatus en el ADS, en donde la concentración de 93 ppm fue el valor más alto que se detectó en un aislado de A. fumigatus proveniente de granos de un comercio del sur (S-Hv) de la ciudad de Morelia, este valor de concentración tuvo una correlación directa con la mayor densidad de propágulos de A. fumigatus en los granos de Hv, mientras que la menor concentración fue de 21 ppm en los granos provenientes del N-Hv. No obstante, a pesar de una alta densidad de propágulos de A. fumigatus en los granos analizados de la zona centro (C-Hv) y del oeste (O-Hv) de la ciudad de Morelia, se detectó una baja concentración de OTA por los aislados de A. fumigatus cultivados en ADS: con 18 ppm proveniente del centro (C-Hv) y relativamente menor en A. fumigatus recuperados del oeste (O-Hv) con 47 ppm.

En la Figura 1 se muestra la fluorescencia a la OTA, liberada por un aislado de A. fumigatus crecido en el ADS, que se recuperó de los granos de Hv y Hl comercializados en la ciudad de Morelia, crecido en ADS, un medio de cultivo que contiene la composición química suficiente para que cualquier hongo que genéticamente sintetice la OTA sin problema para que sea posible no solo establecer que la formo sino también lo haga en una concentración suficiente para cuantificarla^8,10.

Figura 1 Detección por luz ultravioleta (señalado por las fechas rojas) de la presencia de la ocratoxina A en agar dextrosa Sabouraud por Aspergillus fumigatus aislado de granos de Hordeum vulgare comercializados en Morelia, Michoacán, México 

Con base en una de las principales propiedades químicas de la OTA, que se observó en el ADS donde creció A. fumigatus, mediante la lámpara de luz UV indicado por las flechas rojas, de ahí se extrajo y purifico la OTA, para establecer que independiente del origen de los granos comercializados en los diferentes sitios de la ciudad de Morelia, Mich, cada aislado de A. fumigatus mostro la capacidad potencial de síntesis de la OTA^10,11 en el ADS. A pesar de no encontrar una relación directa con la densidad de los propágulos de A. fumigatus recuperados en cada sitio de comercialización de la Hv y Hl en la ciudad de Morelia.

Discusión

Las diferencias en la densidad de propágulos de A. fumigatus en los granos de Hv de los distintos sitios de comercialización de la ciudad de Morelia, Mich, sugieren que tales diferencias tuvieron relación con las condiciones ambientales de manejo en los sitios de siembra y cosecha así como: la humedad, la temperatura estación del año de cosecha, del transporte de la Hv desde el sitio de cosecha a la ciudad, del almacenamiento y en especial de la comercialización del grano de Hv en la ciudad de Morelia, Mich^1,7,8,11 Condiciones ambientales que favorecieron la contaminación y existencia de géneros y especies de hongos que sintetizan la OTA, como: Penicillium verrucosum¹². Así como la existencia de especies de Aspergillus diferentes A fumigatus en ADS como: A. ochraceus, A. alliaceus, A. carbonarius, A. niger y A. melleus^10-13. La literatura reporta la contaminación de productos agrícolas en almacén o venta por hongos que tienen la capacidad de sintetizar OTA en una amplia variedad como: café, jugo de uva, especias, vinos, cerveza, así como la leche y derivados origen animal^14-18. En ese sentido la diferencia en la capacidad de síntesis de la OTA en el ADS de cada aislado de A. fumigatus recuperados de los diferentes sitios de comercialización en la ciudad de Morelia, Mich, probablemente se deba al origen geográfico de cada A. fumigatus^12,13,16. En contraste con otras investigaciones que reportan la existencia de otros géneros y especies de hongos que sintetizan OTA en medio de cultivo artificial similar al ADS, con valores relativamente bajos y altos desde 0.01 hasta 234 ppm^14,18-20. Esas diferencias en la concentración de la producción de OTA en ADS por hongos que contaminan granos como los de Hv, o en Hl desde la zona de cultivo agrícola hasta la comercialización en la ciudad^21,23,24. Apoyan que sea posible la variabilidad genética en los aislados de A. fumigatus provenientes de las distintas regiones de producción de Hv dentro y fuera el estado de Michoacán, México, que tienen climas y niveles de humedad suficientes que permiten una alta densidad de propágulos de hongos que sintetizan OTA^21-23 debido al sistema de producción intensivo con elevadas dosis de fertilizantes químicos y de plaguicidas²⁴, los cuales inducen el crecimiento de géneros y especies de hongos que genéticamente tienen capacidad de sintetizar micotoxinas del tipo de la OTA^25,26. Al respecto se reporta que aproximadamente el 25 % de los cereales que se distribuyen y consumen en el mundo están contaminados por propágulos de hongos que sintetizan diversas clases de micotoxinas^21,22. En consecuencia, cuando granos de cereales del tipo de Hv, o en Hl se contaminan por propágulos de hongos con el potencial genético de sintetizar micotoxinas resultado de las condiciones inadecuadas de manejo de esos granos²⁶, que luego se emplean en la elaboración de alimentos y bebidas como la cerveza artesanal que son consumidos por humanos²⁴. El consumo de estos alimentos que contiene micotoxinas dependientes de la dosis de ingerida, provoca diversos daños en la salud humana o animal que ser desde la intoxicación leve hasta la muerte^23-25. En específico la OTA por A. fumigatus puede ser carcinogénica (teratogénica), hepatotóxica, nefrotóxica e inmunosupresora²⁶.Por lo anterior se concluye que los propágulos de A. fumigatus detectados los granos de Hv, y del Hl que se comercializan en la ciudad de Morelia, Mich, requieren la vigilancia de las autoridades correspondientes, para que el sistema de producción agrícola de este cereal, del tiempo de cosecha, del transporte y de la comercialización eviten riesgos para la salud humana y animal causados por el consumo de OTA generados por los hongos que contaminan este grano²⁵.