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Journal of the Selva Andina Research Society

Print version ISSN 2072-9294On-line version ISSN 2072-9308

J. Selva Andina Res. Soc. vol.13 no.1 La Paz  2022

https://doi.org/10.36610/j.jsars.2022.130100003 

Artículo Original

Supervivencia de Azotobacter y otros grupos microbianos en suelo seco almacenado

Survival of Azotobacter and other microbial group in dry soil by storage

Juan Manuel Sánchez-Yáñez1  * 
http://orcid.org/0000-0002-1086-7180

Adilene Velázquez-Medina1 

Ignacio Cabrera-Reinaldo2 

Welker Leonardo Amador-Vargas3 

Gerard Ronald Vela-Muzquiz4 

1Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Av. Fco J Mujica S/N, Col Felicitas del Rio. CP 58000, Morelia, Mich, México.

2Ministerio de Agricultura de la República de Cuba. Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT). Av. 7ma. No 3005 e/30 y 32, Playa. CP 11300. Zona Postal 13, La Habana, Cuba.

3Academia Militar de Medicina (AMMED). Fuerte Tiuna, CP 1090 Caracas, Venezuela

4University of North Texas. Department of Biological Sciences. Denton, Tx. USA.


Resumen

En suelos secos la supervivencia del género y especies de Azotobacter, es paralela a la de otros grupos microbianos nativos como actinomicetos y hongos de ese ambiente, dependiente de la capacidad de adaptación genética de cada uno, en combinación con algunas de las propiedades fisicoquímicas del suelo, y de las condiciones ambientales de almacén. Los objetivos de este trabajo fueron: i) analizar la supervivencia de Azotobacter en suelo recién colectado y almacenado por 11 y 30 años ii) caracterizar bioquímicamente Azotobacter vinelandii aislado estos suelos iii) dinámica de supervivencia de actinomicetos, bacterias y hongos en los suelos. Para cual cada uno de los suelos se conservó por distinto periodo de tiempo en contenedores de vidrio estériles a temperatura ambiente, de ahí diluyeron para cuantificar cada grupo en: agar nutritivo para bacterias, agar de caseína almidón para actinomicetos, agar Rosa de Bengala para hongos y agar Burk para Azotobacter. Los resultados mostraron que el número de Azotobacter supervivientes en el suelo almacenado por 30 años fue de 12 x 106 UFC/g, de 52 x 106 UFC/g en suelo seco por 11 años y de 300 x 106 UFC/g de suelo seco recién colectado. En el suelo de 30, 11 años se detectó una densidad de Azotobacter spp., inferior al suelo seco recién colectado. Se encontró diferencia en los perfiles bioquímicos de A. vinelandii de suelo almacenado por 30 años, en comparación el mismo género y especie en el recién colectado. Lo que anterior indica que las propiedades fisicoquímicas del suelo, el periodo de desecación fue crítico en la supervivencia de Azotobacter y de los otros grupos de microorganismos nativos de ese ambiente.

Palabras clave: almacenaje; quistes; diversidad microbiana

Abstract

In dry soils, the survival of the genus and species of Azotobacter is parallel to that of other native microbial groups such as actinomycetes and fungi of that environment, depending on the genetic adaptation capacity of each one, in combination with some of the physicochemical properties of the soil. soil, and environmental storage conditions. The objectives of this work were: i) to analyze the survival of Azotobacter in soil recently collected and stored for 11 and 30 years ii) to biochemically characterize Azotobacter vinelandii isolated from these soils iii) survival dynamics of actinomycetes, bacteria and fungi in soils. For which each of the soils was kept for a different period of time in sterile glass containers at room temperature, from there they were diluted to quantify each group in: nutrient agar for bacteria, casein starch agar for actinomycetes, Rose Bengal agar for fungi and Burk agar for Azotobacter. The results showed that the number of surviving Azotobacter in soil stored for 30 years was 12 x106 CFU/g, 52 x 106 CFU/g in dry soil for 11 years, and 300 x106 CFU/g in freshly collected dry soil. In the soil of 30, 11 years, a density of Azotobacter was detected, lower than the dry soil recently collected. A difference was found in the biochemical profiles of A. vinelandii from soil stored for 30 years, compared to the same genus and species in the newly collected soil. The above indicates that the physicochemical properties of the soil, the drying period was critical in the survival of Azotobacter and other groups of microorganisms native to that environment.

Keywords: Soil; storage; cysts; microbial diversity

Introducción

En el suelo existe una amplia diversidad de microorganismos nativos, tanto eucariontes como procariotas, como el género y especies de Azotobacter1,2, heterotrófico, aerobio, que responde a condiciones de stress mediante la formación de una estructura de resistencia o quiste2-4 en el suelo o en condición análoga a ese ambiente5-7. Además, Azotobacter fija nitrógeno molecular (FNM), promueve el sano crecimiento de cultivos agrícolas a nivel limitado de nitrógeno (N) mineral8. Mientras, existen otros grupos microbianos con los que Azotobacter participa en la dinámica de los ciclos biogeoquímicos9-11, de los principales elementos que sostienen la vida, como los actinomicetos, otros géneros de bacterias y hongos12-14. En el suelo la supervivencia de Azotobacter9,10 y de cada uno de los grupos señalados, dependen de la capacidad de respuesta fisiológica12,14,15, al ambiente en que viven como las propiedades fisicoquímicas del suelo: el contenido de materia orgánica (MO) de origen vegetal que se acumula de las raíces vegetales de la composición química, de la biomasa microbiana que muere13,14, al igual que de los minerales necesarios para la vida microbiana y vegetal, de la textura, lo que en conjunto afecta el pH del suelo12,16, así como de la capacidad de retención de humedad, en repuesta a los cambios de temperatura13,14,15. En específico, el género Azotobacter y las especies comunes1,4-6, que coexisten cosmopolitas, con los actinomicetos y hongos que influyen en la capacidad productiva del suelo12-14. La información sobre la supervivencia de especies de Azotobacter en cada tipo de suelo1,5, también se atribuye a las formas orgánicas de carbono que existen comúnmente en ese ambiente y que usan para crecimiento, en todos los suelos del mundo, como los ácidos húmicos5,9, compuestos orgánicos derivados de la mineralización de la lignina, compuesto natural en las plantas principalmente concentrado en las leñosas6,8,11, un complejo fundamental en MO de origen vegetal14. Además de otras moléculas orgánicas de carbono como la celulosa, las hemicelulosas, la pectina, etc., cuando se degradan y/o mineralizan por la microbiota heterotrófica del suelo13,14: actinomicetos17, bacterias18, hongos, etc19,20 bajan el pH que afectan negativamente la viabilidad de Azotobacter, al igual que la competencia y predación que existe en el suelo21-23, influyen en la supervivencia de Azotobacter1,5,9 y de otros grupos microbianos nativos18,19. En suelo no estéril, está demostrado que Azotobacter es capaz de supervivir por periodos de tiempo relativamente prolongados con o sin la formación de quistes2,3, lo que implica que posee un mecanismo fisiológico distinto a lo reportado a las esporas1,3,4,7,9 que posee el género Bacillus bacilo Gram-positivo reconocido en el ambiente, porque con esas esporas enfrenta condiciones adversas en el suelo5,14,15,18,19,25. Aparentemente similar a los actinomicetos nativos de este sitio, que superviven en latencia mediante diversas formas especializadas de resistencia17,21-24. En ese sentido en suelo no estéril es limitada la información de la supervivencia del género y especies de Azotobacter y otros grupos microbianos nativos en suelo no estéril, sujetos a una desecación lenta por condiciones de almacenaje durante largos tiempos, por ello los objetivos de esta investigación fueron: i) analizar la supervivencia de Azotobacter en suelo recién colectado y almacenado por 11 y 30 años, ii) caracterizar bioquímicamente Azotobacter vinelandii aislado estos suelos, iii) dinámica de supervivencia de actinomicetos, bacterias y hongos en los suelos.

Materiales y métodos

Origen y tipo de suelos analizados. Un total de 40 muestras de suelos no estériles colectados desde 1990 al 2011 y en el 2019 en las áreas de Austin, Fort Worth y Denton en el Texas, EUA en diferentes años fueron utilizadas en esta investigación, de los 18 suelos, 11 fueron Quernozémico y 7 Arenosos, según la descripción la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura16: estos suelos se almacenaron en condiciones de laboratorio a temperatura ambiente entre 25.5±2.2 °C por 30 años, 3 suelos por 11 años: 2 de la serie Burleson, 1 de Crockett, y 19 suelos recién colectados: 9 de Birome, 6 de Burleson y 4 de Crockett, cada uno se conservó en viales estériles abiertos solo el día del análisis microbiológico.

Cuantificación de microorganismos supervivientes de suelos almacenados por diferentes periodos de tiempo. Con el propósito de establecer el número de microrganismos supervivientes en cada uno: los viales fueron colocados en un sitio esterilizado con radiación ultravioleta de onda corta 235 nm (de máxima actividad microbicida), libres de polvo, con una gasa estéril y etanol al 70 % fueron abiertos y flameados, se tomó 1.0 g de cada uno, se suspendió en tubos de 18 x 150 mm con 9 mL de solución salina (NaCl 0.85 % p/v) a pH 7.0, cada uno se agitó 30 s en un Vortex, luego se tomaron 0.2 mL de cada uno que se sembraron en diferentes medios de cultivo con la siguiente composición química21,24: agar nutritivo (AN) g/L: extracto de carne 8.0, peptona 5.0, agar 15, agua destilada 1000 mL, el pH se ajustó a 6.8. Para enumerar los actinomicetos17,22,23: agar de caseína almidón (ACA) g/L: caseína 10.0, almidón soluble 2.0, KNO3 2.0, NaCl 2.0, KH2PO4 1.0, CaCO3 0.02, agar 18, agua destilada 1000 mL, el pH se ajustó a 7.3. Para enumerar los propágulos de hongos19 agar Rosa de Bengala-estreptomicina (ARBE) g/L: glucosa 10, peptona 5.0, K2PO4 1.0, MgSO4 7H20 0.5, Rosa de Bengala 33 mg, agar 15, (Difco Detroit, Mich), agua destilada 1000 mL, el pH se ajustó a 6.2 con H2SO4 0.1 N, el sulfato de estreptomicina (antibiótico de amplio espectro) se esterilizo por filtración (filtro membrana de 0.2 µm), se agregó al agar base después de ser esterilizado y enfriado a 42 ºC. En tanto que Azotobacter se enumeró y aisló en agar Burk (AB) g/L: glucosa 5.0, KH2PO4 0.16, K2PO4 0.64, NaCl 0.2, MgSO4 7H2O 0.2, CaSO4 2H2O 0.05, NaMoO4 2H2O 0.01, FeSO4 0.003, agua destilada 1000 mL, ajustado se ajustó a pH a 6.81,2,5,7,9. Cuando las poblaciones microbianas de los suelos fueron relativamente elevadas se usaron diluciones con tres repeticiones, en los medios de cultivo previamente señalados AN, ACA, ARBE y AB se incubaron una semana a 30 °C18,20,26, los valores numéricos de la cuenta viable en placa se reportaron como unidades formadoras de colonias (UFC)21,24, o unidades formadoras de propágulos (UFP) para actinomicetos17,25 y hongos18,19 por gramo de suelo seco (SS). Los resultados se analizaron con el programa estadístico ANOVA Tukey p<0.05 %. Para la determinación del porciento de la reacción a la tinción Gram y dividirse entre: Gram-negativas, Gram-positivas: como las formadoras de esporas y no esporuladas, se tomaron 100 colonias cultivadas en AN de cada suelo y se tiñeron por la tinción Gram que posteriormente se observaron al microscopio luz21,22,24. Todos los aislados bacterianos fueron conservados en suelo estéril, en perlas de cerámica estéril utilizados con base a experiencias obtenidas de otros métodos de preservación conocidos2,15.

Perfil bioquímico de Azotobacter vinelandii de los suelos almacenados por 30 años. Para el aislamiento de A. vinelandii supervivientes de cada suelo almacenado por 30 años se tomó 0.1 g que se sembró directamente en AB, cuando las colonias aparecieron mediante un pigmento fluorescente verde característico de A. vinelandii, se codificaron de acuerdo con el siguientes claves: Old-R, Old-8, Old-8A, Old-8b, Old-83, Old-E, Old-8r, Old-8c y Old-8i mientras que de las 19 muestras del suelo recién colectado se recuperaron 8 aislados de A. vinelandii codificadas como: S-6A, Wild, S-9, 16-AB, S-61, B-16A, L-2, D-1, S-6. Como referencia comparativa para identificar los aislados de Azotobacter de los suelos almacenados se usaron las cepas de colección de A. vinelandii WU-1 donada por el Dr. J Sadoff Michigan State University, Michigan, EUA, la UW donada por el Dr. J Page University of Alberta, Canadá, y la 2489 donada por el Dr. J Moreno de la Universidad de Granada, España. Todos los aislados y cepas de referencias se sembraron en AN para observar el pleomorfismo y la pureza de los posibles A vinelandii2,5,8 se utilizó un microscopio de contraste de fases, mientras que para la inducción de los quistes3,9,27, los posibles aislados de Azotobacter se sembraron en n-butanol al 0.3 % (v/v) como sustituto de glucosa en el AB2,3, entonces de cada suelo almacenado por 30 años se sembraron en AN: 10 de cada 100 consideradas similares que microscópicamente se relacionaron con A. vinelandii3,5, o bien con el género Bacillus13,15 se separaron para identificarlos por las siguientes pruebas bioquímica movilidad, crecimiento en anaerobiosis, citocromo oxidasa, formación de ácido y gas de glucosa, lactosa, síntesis de acetil metil carbinol (Vogues-Proskauer), utilización de citratos como única fuente de carbono, hidrolisis de urea, generación de indol y formación de H2S2,27-29. Para la identificación de la cepa de Citrobacter se empelo una cepa de C. freundii perteneciente a la colección de bacterias entéricas del laboratorio de Microbiología Ambiental del IIQB-UMSNH30.

Resultados

Tabla 1 Densidad de microorganismos aerobios heterotróficos nativos supervivientes de suelos secos texanos almacenados por diferentes periodos de tiempo 

UFC x 106/g de suelo
Microorganismos 301 112 Recién recolectado3
Bacterias 12.0b* 52b 300a
Actinomicetos 0.2d 17ª 66.0a
Hongos 0.2d 0.1d 71.0a
Azotobacter spp. 5.2b 15ª 52.0a

1. Promedio de 18 muestras de suelo seco almacenado por 30 años, 2. promedio de 9 muestras de suelo seco almacenado por 11 años, 3. promedio de 19 muestras de suelo.

*valores con letra distintas indican diferencia estadística (P>0.05) según ANOVA/Tukey.

En la Tabla 1, se muestran la densidad de la población de los microrganismos heterotróficos aerobios nativos supervivientes de cada suelo de Texas USA, se registró, que el grupo bacteriano fue el más numeroso independiente del tiempo de almacenamiento. La diferencia entre el promedio de la densidad de la población bacteriana (DPB) del suelo almacenado por 30 años fue de 12.0 x 106 UFC/g de suelo, sin diferencia estadística con la densidad de 11 años, pero estadísticamente distinta e inferior al promedio de la población homóloga en el suelo recién colectado con 300 x 106 UFC/g de suelo, el promedio de la DPB superviviente del suelo almacenado por 11 años fue de 52 x 106 UFC/g de suelo apoya, que la capacidad de resistencia fisiológica de la población bacteriana a la perdida de humedad o desecación del suelo, es genética, dependiente de las propiedades fisicoquímicas de cada suelo qué influyeron para que el tiempo de supervivencia haya sido menor en el suelo almacenado por 30 años y mayor en el suelo almacenado por 11 años, en tanto que el DPB en el suelo recién colectado fue 300 x 106 UFC. El promedio de la densidad de los actinomicetos supervivientes del suelo almacenado por 30 años fue de: 0.2 x 106 UFC/g de SS, estadísticamente diferente al promedio de la densidad de la población homologa del suelo almacenado por 11 años, con 17.0 x 106 UFC/g de SS, sin diferencia estadística con el suelo recién colectado con 66.0 x 106 UFC/g de SS. Mientras que el promedio de los propágulos fúngicos supervivientes fue de 0.2 x 106 UFC/g de SS almacenado por 30 años sin diferencia estadística con los 0.1 x 106 UFC/g de SS del almacenado por 11 años, pero con un valor estadísticamente diferente 71 x 106 UFC/g de SS recién colectado. Lo que apoya que, en parte por las limitaciones de la técnica de cuenta viable en placa, no se detectaron la totalidad de los propágulos de hongos viables en los suelos almacenados por 30 y 11 años en comparación con la densidad numérica registrada en el suelo recién colectado.

En la Tabla 2, se presentan los porcentajes de bacterias en el suelo almacenado por diferentes periodos de tiempo, de acuerdo con la morfología y reacción a la tinción Gram, el mayor porcentaje fueron bacilos Gram-positivo con 58.7 % en el suelo almacenado por 30 años. Con 61.0 % del suelo almacenado por 11 años y 69.8 % del suelo recién colectado. Es evidente el contraste con el porcentaje del grupo no esporulado, de manera esperada fue menor en el suelo de 30 años, que tuvo diferencia estadística comparado, con el mayor por ciento en los no esporulados en el suelo de 11 años de almacenamiento, así como en el suelo recién colectado.

Tabla 2 Porcentaje de los grupos morfológicos, de acuerdo a la tinción de Gram, esporuladas o no, de las bacterias de cada suelo almacenado por diferentes periodos de tiempo 

Categorías morfológicas* 301 % Periodo en años 112% Recién colectados9 %
Bacillos Gram-negativo 41.3a* 39.0a 30.0a
Bacillos Gram-positivo 58.7a 61.0a 69.8ª
No esporulados 7.7b 24.0a 13.7ª
Esporulados 51.0a 37.0a 56.1ª
Relación Gram-negativo/Gram-positivo 0.70c 0.63c 0.43c

1= promedio de 18 muestras 2= promedio de 3 muestras. 9= promedio de 19 muestras

*Valores con letra distintas indican diferencia estadística (P>0.05) según ANOVA/Tukey.

En la Tabla 3, se muestra la amplia densidad numérica de las especies de Azotobacter desde 0. 09 x 106 UFC del suelo clave 12, 2,200 de Austin, Tx hasta el máximo valor numérico 37 x 106 UFC/g de SS codificado como J, almacenados por 30 años de Austin Tx, ambos valores numéricos estadísticamente diferentes con los 7.3 x 106 UFC/g del suelo codificado como Downtown, tipo Arenoso de Manor, Tx.

Tabla 3 Densidad de la población de Azotobacter supervivientes en el suelo almacenado de Texas, EUA por 30 años 

Clave de la muestra del suelo* Lugar de origen Texas EUA Tipo de suelo UFC/g de suelo seco x 106 Azotobacter sp.
East San Antonio Quernozémico 0.30c**
Southside San Antonio Arenoso 0.30c
Mat West San Antonio Quernozémico 0.30c
12, 2,200 Austin Quernozémico 0.09d
A Mission Arenoso 10.0a
61-3 Austin Quernozémico 10.0a
250-control Austin Quernozémico 13.0a
2-8-63 Austin Arenoso 11.0a
J Austin Quernozémico 37.0a
350 KR Austin Quernozémico N. D
3.3 Control Austin Quernozémico 14.5ª
Downtown Manor Arenoso 6.0b
Downtown Brooks Quernozémico 7.3b
C. Austin Arenoso 1.0b
Shadywood Austin Quernozémico 1.0b
Control 5-23-63 Austin Quernozémico 0.72c
Control 9-63 Austin Arenoso 0.10c
Cadillac Austin Arenoso 0.69c

N. D= No se detectó ningún posible Azotobacter spp

**Valores con letra distintas indican diferencia estadística (P>0.05) según ANOVA/Tukey.

En general fue posible detectar una tendencia de Azotobacter para supervivir en mayor densidad en los suelos tipo Quernozémico codificados como los codificados como el 61-3, el 250-control, el J, el 3.3 control, localizados en Austin, Tx, y menor densidad de Azotobacter superviviente en los suelos tipo Arenoso codificado como 2-8-63 de Austin, Tx con 11 x 106 UFC de SS, fue evidente que Azotobacter a pesar de estar en un suelo Quernozémico, supervivió más que los Arenosos como los codificados Southside de San Antonio, A de Mission, Downtown de Menor, Control 9-63 y Cadillac de Austin Independientemente de la ubicación geográfica de acuerdo a las condiciones ambientales se registraron menos Azotobacter en San Antonio, en comparación con los de Austin.

En la Tabla 4, se presenta que la densidad de la población de Azotobacter supervivientes en suelo almacenado por 11 años, se registraron desde 51 x 106 UFC/g de suelo tipo Crockett con clave FW de Forth Worth, Tx cuyo valor numérico tuvo diferencia estadística con los 0.90 x 106 UFC/g del SS codificado como D, tipo Burleson de Denton, Tx, aunque en el otro del mismo tipo codificado como D-1 se detectó mayor densidad 42 x 106 UFC acuerdo este resultado, lo que muestra que suelos similares en la misma área pueden contener diferente densidad de Azotobacter, atribuido a que uno el D fue sometido a cultivo intensivo de Zea mays y el otro es un terreno usado para pastoreo de ganado vacuno12,16,27.

Tabla 4 Densidad de población de Azotobacter supervivientes en el suelo almacenado por 11 años 

Clave del suelo* Localidad en Texas EUA Tipo de suelo UFC x 106/g de suelo seco de Azotobacter sp.
D Denton Burleson 0.90b**
FW Forth Worth Crockett 51a
D-1 Denton Burleson 42a

Burleson = Arenoso, Crockett = Arenoso limoso

**Valores con letra distintas indican diferencia estadística (P>0.05) según ANOVA/Tukey.

En la Tabla 5 se presenta la población nativa de Azotobacter, en el suelo recién colectado del condado de Denton, Texas EUA que registraron un máximo de 4000 UFC x 106/g de los suelos con las claves 15 tipo Birome y el codificado como 16 tipo Burleson ambos valores numéricos fueron estadísticamente similares, pero con diferencia estadística con los 0.13 UFC x 106/g de suelo con la clave 1 Birome. En general el promedio de Azotobacter detectado en los suelos tipo Birome con las claves: 1,4,8,9,10,14,15,18 y 19 fue 574.1 x 107 UFC/g de SS valor numérico sin diferencia estadística, con la población de Azotobacter en los suelos Burleson claves: 2,7,11,13 fue de 188.0 x 107 UFC/g de SS, ambos con diferencia estadística con los suelos tipo Crockett claves: 3,5,6,12 fue de 382.5 x 106 UFC/g de SS, en algunos de los cuales con clave 5,6 no se detectó ninguna población nativa de Azotobacter.

Tabla 5 Densidad de las poblaciones de Azotobacter de suelo recién colectados 

Número de la muestra del suelo* Tipo de suelo UFC x 106/g de suelo
1 Birome 0.13c*
2 Burleson 0.15c
3 Crockett 250.0b
4 Birome 0.3c
5 Crockett N.D.
6 Crockett N.D
7 Burleson 250.0b
8 Birome 110.0b
9 Birome 160.0b
10 Birome 160.0b
11 Burleson 430.0b
12 Crockett 530.0b
13 Burleson 400.0b
14 Birome 300.0b
15 Birome 4000a
16 Burleson 4000a
17 Burleson 800.0b
18 Birome 900.0b
19 Birome 1000a

Birome = Arenoso-limoso., Burleson = Arenoso., Crockett = Arenoso-limoso, Suelos del condado de Denton, Texas., N. D= No se detectó ningún posible Azotobacter spp

*Valores con letra distintas indican diferencia estadística (P>0.05) según ANOVA/Tukey.

En la Tabla 6, se presenta el perfil comparativo fisiológico y bioquímico de A. vinelandii supervivientes del suelo almacenado por 30 años comparado con el mismo género y especie, recuperados de suelos recién colectados. Con base al perfil de las cepas de referencia de A. vinelandii WU-1, UW y 2489 fue similar a los aislados de A. vinelandii recuperados de suelos almacenados por 30 años, lo que confirmo que este grupo de Azotobacter pertenece a la especie vinelandii.

Tabla 6 Comparación del perfil bioquímico de Azotobacter vinelandii recuperados de suelos almacenados por 30 años y de reciente aislamiento 

Propiedades fisiológicas y bioquímicas 30 añosa recién colectadosb
Temperatura e crecimiento (°C)
18 + -
30 + -
37 - +
Crecimiento en presencia del 1 % de NaC1 - +
Utilización de:
Fructosa + -
Glucosa + +
Sacarosa + +
Etanol + -
Etilenglicol + -
Galactosa + -
Ramnosa + +

(+) = reacción positiva de la prueba y/o utilización (-) = reacción negativa de la prueba.

a= promedio de 12 aislados. b= promedio de 12 aislados.

En la Tabla 7, se presenta, además de Azotobacter, se aisló otro género de bacteria Gram-negativa que de acuerdo al perfil bioquímico pertenece a Citrobacter un grupo conocido como Enterobacteria que a pesar de ser descritas en principio como parte del intestino de humanos y animales supervivieron en el suelo a las condiciones de almacenamiento por 30 años, probablemente por mecanismos fisiológicos relacionados con la inducción de la latencia al stress nutricional y ambiental12,14.

Tabla 7 Perfil bioquímico de un aislado bacteriano Gram negativo superviviente de suelo almacenado por 30 años 

Característica bioquímica Citrobacter sp. cepa V-7
Movilidad -
citratos +
Indol -
H2S -
Ureasa -
MR -
VP -
Glucosa -
Lactosa -

(+) = reacción positiva de la prueba. (-) = reacción negativa a la prueba.

Discusión

En la Tabla 1 se explica que las propiedades físicas, químicas, y biológicas del suelo favorecieron una mayor densidad de población nativa bacteriana heterotrófica aerobia21,24. No obstante los resultados numéricos no indican la densidad real de la población microbiana heterotrófica aerobia nativa de cada suelo debido: i) limitaciones de la técnica de cuenta viable en placa, ii) la existencia de células viables no cultivables12,13,24. La supervivencia de Azotobacter1,5,7,9 y otros grupos microbianos14,21,22 fue dependiente de la capacidad genética11,23 de cada uno, para adaptarse al stress en el suelo, derivados de las propiedades fisicoquímicas19,26. Lo que apoya que los actinomicetos por ser autóctonos del suelo tuvieron una adaptación suficiente para tolerar a la desecación lenta y gradual de los suelos durante el almacenamiento12,13,21-23. Mientras que son mínimos los reportes de la capacidad de supervivencia de estos microorganismos en el suelo por periodos semejantes a los analizados en esta investigación9. Por ello los actinomicetos, fue el grupo superviviente en el suelo almacenado de 30 años por la amplia diversidad genética en sus estructuras de latencia y reproducción para la perdida de agua durante la desecación12,14,21,22 que indujeron a la latencia, con la reducción de su velocidad de muerte19,23,25. Mientras de la pobreza nutricional de cada suelo combinada con la baja humedad, fueron causantes del decremento de la población microbiana en específico de una menor densidad de propágulos de hongos14,19,21. En ninguno de los suelos analizados se detectaron levaduras14, lo que se atribuyó a la desecación que provoco la salinidad, con el descenso de humedad, al decremento del pH y la carencia de MO simple o de relativa fácil degradación14,19,20.

En la Tabla 2 se muestra que la población bacteriana esporulada, representa el grupo que forma una estructura especializada o espora que tolera la desecación y otras condiciones adversas al crecimiento, que en consecuencia les permite permanecer en latencia por tiempo indefinido, hasta el momento en que las condiciones nutricionales y ambientales les son favorables para activarse y reproducirse12,14,15,21, como se observó en la población bacteriana esporulada de los suelos almacenados por 30 años, en comparación con la misma población esporulada aisladas de los suelos almacenados por 11 y los suelos recién colectados. El hecho de que en los suelos la población bacteriana no esporulada haya alcanzado porcentajes entre el 7 y el 37 %, demuestra que en este grupo existen géneros y especies bacterianas que tienen genéticamente mecanismos fisiológicos similar a la latencia, para tolerar el stress por falta de agua, que causa un aumento en la salinidad, además de la ausencia de MO de fácil degradación. Sin poseer estructuras especializadas para supervivir a las condiciones adversas de tipo físico, químico y biológicas existentes en esos suelos12,14,19,21,25.

En la Tabla 3 se muestra la evidencia que apoya que el género Azotobacter tiene la capacidad genética de supervivencia, similar a la reportado en los géneros y especies bacterianas que sintetizan esporas9,14,19,25. En general una respuesta específica microbiana a la desecación del suelo, por incremento en la salinidad, es el decremento de la viabilidad de las células vegetativas20,26, pero en el caso de Azotobacter existe la evidencia, de que con o sin quistes pueden supervivir en diversos tipos de suelos relativamente27,28. Se reporta en la literatura la formación de quistes en Azotobacter no es necesariamente el principal mecanismo fisiológico de tolerancia al stress por desecación y salinidad en el suelo1,4,9. Fue evidente que las propiedades fisicoquímicas de los suelos texanos y la ubicación geográfica influyeron en la supervivencia de Azotobacter, lo que apoya, a la distribución de algunos de los principales grupos microbianos tienen un genoma que se adapta a una amplia variedad de hábitats como los encontrados en los suelos de Texas, EUA14,19,22,26,27.

En la Tabla 4 sugiere que debido a las propiedades fisicoquímicas de los suelos texanos como la concentración de MO, salinidad y disminución de humedad de cada suelo, fueron factores limitantes que influyeron en la densidad de las poblaciones de Azotobacter supervivientes, lo que apoya que tienen una capacidad fisiológica de origen genético de adaptación al stress del suelo, por ser un género nativo en la mayoría de los suelos del mundo, lo que hace posible recuperarlo, al igual que otras especies, que viven libremente o en asociación con especies vegetales silvestres y domesticas29,31,32.

En la Tabla 5 se observó una diferencia estadística entre la densidad de la población de Azotobacter presentes en los suelos tipo Crockett, en comparación con la densidad de las poblaciones de Azotobacter de los suelos tipo Birome y Burleson. En principio por las propiedades fisicoquímicas de los suelos analizados, en el caso de Birome de textura arenosa-arcillosa, pobre en MO, pH alcalino. A diferencia del Burleson de textura arcillosa, con bajo nivel de MO y pH ligeramente alcalino. Por lo que en suelos tipo Birome se detectó un intervalo de variación de la población de Azotobacter desde 0.13 x 106 hasta 400.0 x 107 UFC/g de SS, con valores numéricos sin diferencia estadística comparados con la población de Azotobacter de la serie Burleson, lo que apoya que Azotobacter y sus especies son cosmopolitas de estos suelos independientemente de la vocación agrícola y/o ganadera de explotación: para pastoreo o bien vírgenes situación observada en los suelos analizados del centro norte del estado de Texas, EUA29,31-33.

En la Tabla 6 fue evidente que los aislados de A. vinelandii de los suelos almacenados por un largo periodo de tiempo mostraron una mayor flexibilidad y/o diversidad metabólica según el perfil bioquímico de A. vinelandii provenientes de suelos almacenado por 30 años en relación al espectro de crecimiento con diferentes fuentes de carbono y energía que se demostró utiliza, acorde a lo reportado en la literatura2,7,8. Lo anterior fue corroborado por la respuesta de las cepas de A. vinelandii usadas como referencia.

En la Tabla 7Citrobacter es un género de Enterobacterias que supervivieron al stress nutricional, baja humedad y salinidad según se reporta pueden hacerlo otros géneros de bacterias entéricas en el suelo30,34,35. El perfil bioquímico de identificación de este aislado recuperado de suelo almacenado por 30 años, comparado con la cepa de referencia C. freundii corroboro que pertenece a Citrobacter reportado en la literatura que existe en el suelo de libre de raíces, con un potencial genético benéfico para plantas silvestre del desierto30. Por lo que este es uno de los primeros reportes de la supervivencia en el suelo de este género por un periodo de tiempo de 30 años.

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Fuente de financiamiento Proyecto 2.7 (2022) de la CIC-UMSNH, Morelia, Mich, México. BIONUTRA, S. A. de CV, Maravatío, Michoacán, México.

Conflictos de intereses Los participantes en esta investigación aseguramos que no existe ningún problema de intereses relacionados con la planeación, ejecución y reporte de esta investigación que comprometa el valor de los resultados obtenidos o sus consecuencias en términos científicos, técnicos, o de cualquier otro tipo.

Agradecimientos A la Dirección de Investigación Científica de la Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, N.L. México, por la información y apoyo. A la Coordinación de la Investigación Científica (2022) de la UMSNH, Morelia, Michoacán, México, por las facilidades.

Consideraciones éticas La aprobación de la investigación por el Comité de Ética, de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, México, siguió las pautas establecidas para este comité.

Limitaciones en la investigación Los autores declaran que no hubo limitaciones en la investigación.

6Aporte de los autores en el articulo Gerard Roland Vela-Muzquiz, por el apoyo a la investigación en el trabajo experimental y discusión. Adilene Velázquez-Medina, revisión de literatura para material, métodos y resultados. Reinaldo Ismael Cabrera, análisis estadístico de resultados. Amador Vargas Leonardo, revisión de antecedentes y resultados. Juan Manuel Sánchez-Yáñez, realización de la fase experimental, resultados, discusión, análisis estadísticos y articulo final. Se dedica este trabajo a la memoria del Dr. Gerard Roland Vela-Muzquiz por el compromiso, apoyo y guía para la formación de profesionales del mundo de la Microbiología durante 40 años en la University of North Texas, Denton, Tx. EUA, gracias.

7ID del artículo: 154/JSARS/2021 Nota del Editor: Journal of the Selva Andina Research Society (JSARS) se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales publicados en mapas y afiliaciones institucionales.

Recibido: 01 de Agosto de 2021; Revisado: 01 de Noviembre de 2021; Aprobado: 01 de Diciembre de 2021

*Dirección de contacto: Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Laboratorio de Microbiología Ambiental. Av. Francisco J Mujica S/N. Col Felicitas del Rio, CP 58.000 Morelia. Michoacán, México. Tel: +0052, 443322 Ext 4240. Juan Manuel Sánchez-Yáñez E-mail address : syanez@umich.mx

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