Introducción

El control biológico (CB) de los insectos-plaga en la agricultura convencional, orgánica y protegida que pertenecen a los órdenes, Coleóptera, Díptera y Lepidóptera, es posible con la aplicación de Bacillus thuringiensis (Bt)^1-4, una opción para reducir o eliminar el uso de plaguicidas químicos^5-7. Bt es un género y especie de bacteria formadora esporas, Grampositiva que sintetiza un cuerpo paraesporal ó cristal de proteína (δ-endotoxina) durante la fase de esporulación^8-12. La mezcla cristal-espora es tóxica para insectos-plaga de los órdenes: Coleoptera, Diptera y Lepidoptera^2,13-16, e inocua para humanos, animales o plantas, degradable y manejada con inteligencia (rotación de variedades de Bt aisladas de insectos) es mínimo el desarrollo de resistencia en esos insectos-plaga^17-19.

El empleo del complejo cristal-espora consiste en asperjarlo sobre hojas de plantas o en la superficie del agua, lo que no tiene ningún efecto residual, por ello debe reaplicarse en cada ciclo agrícola en el CB de los insectos-plaga involucrados²⁰, debido a la incapa-cidad de las esporas de Bt para germinar con los nutrientes del ambiente (suelo), incluso como célula vegetativa antes o después de esporular²¹ y el posible éxito en la efectividad del complejo crista-espora en el CB de insectos-plaga agrícolas.

Por lo anterior el objetivo de esta investigación fue analizar el efecto del enriquecimiento de un suelo agrícola estéril con glucosa, nitrato de amonio y extracto de levadura y en la germinación de esporas de B. thuringiensis de diverso origen de aislamiento.

Materiales y métodos

Origen, de las cepas de Bacillus thuringiensis. Se utilizaron tres cepas de Bt denominados Bt-1 y Bt-2, recuperadas de un suelo agrícola del estado de Nuevo León, México y la HD-1, proveniente de un Lepidóptero insecto-plaga de almacén de granos aislado y donado para este trabajo por el Dr. Howard T. Dulmage del USDA, Waco, Texas, EUA. Las cepas de Bt se conservaron en refrigeración a 10 (C en agar nutritivo.

Suelo agrícola. Se colectó un suelo agrícola a una profundidad de 15-30 cm, del municipio de Guada-lupe, N.L. México, el suelo era mediano en materia orgánica (MO), de pH ligeramente alcalino, textura migajón limosa y no salino^22,23. Entonces porciones de 50 g del suelo, que se colocaron en recipientes de cartón se esterilizaron a 121 (C/2h, ahí el pH del suelo se ajustó a 7.0 con HCI 0.1 N, se enriqueció con glucosa (Baker) como fuente de carbono (C) al 1, 3 y 4 % (p/p), como fuente de nitrógeno: NH₄NO₃ (Baker) al 3.0 % (p/p) y como factor de crecimiento se agregó extracto de levadura (Difco) al 0.01 % (p/p), la humedad del suelo, se ajustó al 80 % de la capacidad de campo con agua destilada, en tanto que como control absoluto (CA) se empleó el mismo suelo sin enriquecer con los compuestos indicados, ni inocular con las cepas de Bt a pH 7, ajustado a una humedad del 80 % de la capacidad campo.

Preparación del inóculo de esporas de Bt para el suelo agrícola estéril. Las esporas de Bt se cosecharon de un cultivo de 72 h de caldo nutritivo (Bioxon), se suspendieron en NaCl 0.85 % (solución salina), se pasteurizaron a 80 (C/10 min, luego las esporas de Bt se lavaron por centrifugación tres veces a 3000 rpm/15 min, posteriormente la suspensión de esporas de Bt se ajustó a la turbidez del tubo No. 1 de Mac Farland y diluyó hasta 15.0x10³ esporas/mL/50 g del suelo agrícola estéril^24,23.

Recuperación de las esporas de Bt del suelo estéril. Diariamente hasta por 5 días seguidos, se tomaron 5.0 g del suelo agrícola inoculado con las esporas de Bt y 5 g del suelo sin Bt o CA. Para determinar la densidad de la germinación de las esporas de Bt, los 5.0 g de cada suelo se suspendieron en 45 mL de solución salina esterilizada ajustada a pH 7.0, que se pasteurizo a 80 (C/10 min, luego se realizaron diluciones en solución salina para determinar la can-tidad de esporas germinadas por cuenta viable en placa en agar nutritivo, todos los datos experimen-tales se analizaron por ANOVA Tukey (p<0.05)²⁵.

Resultados

Análisis fisicoquímico del suelo. El suelo de acuerdo con el análisis, fisicoquímico se clasificó como franco arenoso con un 93.16 % de arena, pH 7.2 ligeramente alcalino, rico en MO con un valor de 5.2 %²².

Enriquecimiento del suelo agrícola estéril con glucosa nitrato de amonio y extracto de levadura en la germinación de las esporas de Bt. La Tabla 1, presenta el efecto del enriquecimiento del suelo agrícola estéril con diferentes concentraciones de glucosa sobre la germinación de las esporas de Bt-1 ajustado a una humedad relativa del 80 %, ahí se registraron 2.1 Log UFC x 10⁶ esporas germinadas/g suelo seco de Bt-1 en suelo estéril con glucosa al 2.5% en los días 4 y 5, los valores numéricos que tuvieron diferencia estadística comparados con los 1.60 y 1.40 Log UFC x 10⁶ esporas germinadas/g suelo seco de Bt-1 en el suelo sin inocular irrigado con agua o control absoluto.

En la Tabla 2, se muestra el efecto del enriquecimiento del suelo agrícola estéril con diferentes concentraciones de glucosa sobre la germinación de las esporas de Bt-2 ajustado a una humedad relativa del 80 %, donde se registró 1.9 y 2.0 Log UFC x 10⁶ esporas germinadas/g suelo seco de Bt-2 en suelo estéril con glucosa al 1, 3 y 4 % en el día 5, valor numérico que tuvo diferencia estadística comparado con los 1.90 Log UFC x 10⁶ esporas germinadas/g suelo sin inocular irrigado con agua o CA.

En la Tabla 3, se muestra el efecto del enriquecimiento de suelo agrícola estéril con glucosa al 4 %, con nitrato de amonio al 3 % y extracto de levadura al 0.1 % sobre la germinación de esporas de B. thuringiensis HD-1, ahí se registró 4.0 Log UFC x 10⁶ esporas germinadas de Bt HD-1/g suelo seco en el día 5, valor numérico con diferencia estadística comparado con los 1.7 UFC x 10⁶ esporas germinadas de Bt HD-1/g suelo del suelo sin enriquecer con glucosa, nitrato de amonio y extracto de levadura o CA.

Discusión

En la Tabla 1, se muestra el pobre efecto del enriquecimiento de suelo estéril agrícola con diferentes concentraciones de glucosa sobre la cantidad de esporas que germinaron de Bt-1, dado que además de una fuente de carbono Bt-1 requiere de una fuente de nitrógeno inorgánico y un factor de crecimiento para activar enzimas necesarias para la reproducción de Bt-1, los que están ausentes en el suelo e impidieron una germinación de las esporas de Bt-1, similar a los reportes de Petras & Casida²⁶, West et al.²⁷ que indicaron que sin estas sustancias las esporas Bt no tienen capacidad de germinar, y además pierden rápidamente la viabilidad en las condiciones nutricionales de un suelo agrícola común.

En la Tabla 2, cuando el suelo se enriqueció con dextrosa en concentraciones de 1, 3 y 4 % ahí se observó una pobre germinación de las esporas similar a la detectada en el suelo sin enriquecer, que se utilizó como CA, lo que indica que la MO del suelo no contiene compuestos de sencillos de carbono orgánico, como la glucosa, como lo que reportan, Sekijima et al.²⁸ y Medrano-González et al.²¹. Según se observa en la Tabla 1, las esporas de Bt-1 en el suelo CA, alcanzaron la máxima germinación con los nutrientes disponibles a pesar de no enriquecerlo, similar a la germinación de esporas de Bacillus subtilis en suelo agrícola sin enriquecer usado como CA. Estos resultados son inusuales para Bt cuyo origen son insectos-plaga, que en lo general no germina en suelo no enriquecido con alguna fuente de carbono orgánica sencilla, con una de nitrógeno, en contraste la cepa de Bt-2, que respondió a la concentración de glucosa al 3 % y 4 % que estimularon la germinación de las de Bt esporas semejante a lo que señalan Pruett et al.²⁴, Aranson et al.²⁹ y Lambert & Perferoen¹⁷ al especificar que entre aislados de Bt existen diferencias en las exigencias nutricionales necesarias para que las esporas supervivan y germinen en ambientes naturales como el suelo, en específico basado en el patrón de utilización de azucares sencillos utilizados como fuente de carbono y energía, la fuente de N inorgánica complementada por el factor de crecimiento; en las cepas de Bt la dependencia o independencia nutricional para que supervivan y germinen en el suelo, se reporta que es función del origen de aislamiento: ya sea de suelo Assaeedi et al.³⁰ granos o insectos Chiang et al.³¹, Bhalla et al.³² como ha sido señalado por Li et al.³³, donde Bt pueden ser endófitos de plantas medicinales Minu & Dipak³⁴.

En la Tabla 3, se presenta que las esporas de Bt-HD-1 germinaron solo cuando se enriqueció el suelo con glucosa, y un factor de crecimiento como el extracto de levadura al 0.01 %, ello supone que la supervivencia de las esporas de Bt-HD-1, así como la rápida germinación en suelo sin enriquecer o CA, indican que la germinación de esas esporas no depende de carbono orgánico del enriquecimiento, excepto en el caso de Bt-HD-1, él que por el origen del aislamiento a partir de insectos-plaga no comparte con Bt-2 por razones genéricas la misma exigencia nutricional, como la necesidad obligatoria de la glucosa como fuente de carbono y energía, contrario con las esporas de Bt-1 que germinaron solo al enriquecer el suelo con glucosa al 4 %, una relativa elevada concentración de azúcar, probablemente porque este compuesto orgánico es adsorbido por arcillas del suelo, ya que concentraciones de 1 y 3 % retardaron o inhibieron la germinación de las esporas de Bt-2. Esta heterogeneidad en la respuesta de las esporas de Bt sugiere que las diferencias en la exigencia de carbono orgánico sencillo, de la fuente inorgánica de N, así como el del factor de crecimiento, apoya una estrecha relación entre el hábitat original de aislamiento de cada cepa de Bt³³, puesto que Bt-1 y Bt-2 recuperadas de suelo, utilizaron nutrientes orgánicos e inorgánicos de esos hábitats, como se demostró en este trabajo, en especial en el suelo agrícola sin enriquecer usado como como CA. Mientras Bt-HD-1 aislado de insectos-plaga mostro la mayor demanda nutricional, este hecho también fue reportado Aronson et al.²⁹, Brar et al.³⁵. Lo que apoya que entre los aislados de Bt podría establecerse una división con base en la demanda nutricional específica, de acuerdo con en el hábitat de origen: suelo, agua, planta o insectos según Carrière et al.³⁶ estas diferencias son genéticas lo determina que las esporas de cada aislado de Bt tiene necesidades nutricionales indispensable para las esporas germinen y generen el cristal toxico o delta endotoxina, en especial si tienen o no una relación con los insectos-plaga o bien cuando las esporas provienen de Bt que existe de manera saprobia en el agua, en el suelo y/o eventualmente como endófito de plantas³³, lo que influye en la efectividad del complejo crista-espora en el CB de insectos plaga agrícolas.

Con base en la literatura y los resultados de este trabajo, se sugiere que Bt mediante proceso evolutivo a partir de una estrecha relación con los insectos, ha tenidos cambios genéticos que repercutieron en las necesidades nutricionales de las esporas, para ser independiente de los insectos y/o saprobios en ambientes naturales.