https://doi.org/10.36610/j.jsars.2020.110200103

Nota de Investigación

 

Extracto hidroalcohólico de cáscara de Citrus sinensis y aceite de Pinus patula, una alternativa de biorremediación

 

Hydroalcoholic extract of Citrus sinensis peel and Pinus patula oil, a bioremediation alternative

 

 

Marín-Velásquez Tomás* , Barrutia-Barreto Israel

Innova Scientific SAC
Gerencia de Producción Científica.
Departamento de Investigación.
Av. la Marina 1453.
San Miguel 15086
Lima, Perú
Tel: (01)6768070/948631287.
Informes@innovascientific.com
ibarrutia@innovascientific.com

*Dirección de contacto: Innova Scientific SAc. Gerencia de Producción Científica. Departamento de Investigación. Av. la Marina 1453. San Miguel 15086 Lima, Perú Tel: (01)6768070/948631287.

Tomás Marín-Velásquez
E-mail address: tmarin@innovascientific.com

J. Selva Andina Res. Soc. 2020; 11(2):103-113.

ID del artículo: 137/JSARS/2020

Historial del artículo.
Recibido marzo 2020.
Devuelto mayo 2020.
Aceptado junio 2020.
Disponible en línea, agosto 2020.

 

 

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Resumen

El objetivo de la investigación fue la evaluación del extracto hidroalcohólico de cáscaras de Citrus sinensis (ECN) y aceite de Pinus patula (ADP) como una alternativa de biorremediación, en una arena contaminada con combustible Diésel. Se contaminó una arena con combustible diésel en proporción 100 mL/kg y se trató con los productos en dosis de 50 y 100 mL/kg de arena contaminada, para luego monitorear la cantidad de extraíbles con hexano (HEM) cada 15 a 60 días. El diseño fue factorial de bloques al azar, con una muestra, una variable respuesta (HEM), tres factores (remediador, dosis y tiempo) y tres réplicas por bloque. Se utilizó ANOVA y test de Tukey para establecer la influencia de los factores experimentales sobre la variable respuesta. Se obtuvo que el tratamiento ECN logró una eficiencia de remediación máxima de 92.07% y para el ADP la eficiencia fue de 87.88%, ambas superando a la eficiencia por atenuación natural que fue de 64.72%. Se destaca que al tratar la arena contaminada con hidrocarburos con ECN y ADP se produce una mayor eficiencia de remediación respecto a la atenuación natural y la diferencia entre ambos tratamientos no fue estadísticamente significativa con un nivel de confianza de 95%.

Palabras clave: Contaminación, hidrocarburos, impacto ambiental, petróleo, Pinus patula, Citrus sinensis, atenuación natural, remediación, suelo.

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Abstract

The objective of the research was the evaluation of the hydroalcoholic extract of Citrus sinensis (ECN) peels and Pinus patula oil (ADP) as a bioremediation alternative, in a sand contaminated with diesel fuel. A sand was contaminated with diesel fuel in a proportion of 100 mL/kg and the products were treated in doses of 50 and 100 mL/kg of contaminated sand, to then monitor the amount of hexane extractables (HEM) every 15 to 60 days. The design was a random block factorial, with a sample, a response variable (HEM), three factors (remediator, dose and time) and three replicates per block. ANOVA and Tukey's test were used to establish the influence of experimental factors on the response variable. It was obtained that the ECN treatment achieved a maximum remediation efficiency of 92.07% and for ADP the efficiency was 87.88%, both surpassing the natural attenuation efficiency that was 64.72%. It is highlighted that treating hydrocarbon-contaminated sand with ECN and ADP produces a greater remediation efficiency compared to natural attenuation and the difference between both treatments was not statistically significant with a confidence level of 95%.

Keywords: Citrus sinensis, hydrocarbons, environmental impact, oil, Pinus patula, pollution, natural attenuation, remediation, soil.

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Introducción

La contaminación del suelo con hidrocarburos en un problema común, no solo en países productores de petróleo, también ocurre en todo el mundo, debido a los derivados del petróleo (DP) que se utilizan como combustible y lubricantes a nivel global¹. La contaminación por hidrocarburos puede ocurrir por descargas de efluentes contaminados, fugas en tanques de almacenamiento o pérdidas accidentales en puntos de distribución². La introducción de los hidrocarburos en el suelo genera la modificación sus condiciones de equilibrio natural, modificando sus propiedades físicas, químicas y biológicas³. El suelo está constituido por cinco componentes principales, la matriz mineral, aire, agua, materia orgánica y biota⁴. Los hidrocarburos impiden el desarrollo normal de la vida en el suelo, al modificar el equilibrio vital entre estos elementos, generando un impacto de importancia al impedir el intercambio gaseoso con la atmósfera, lo que genera una serie de procesos físico-químicos como la volatilización y la penetración que en conjunto con las características del suelo generan un mayor o menor impacto^{5, 6}.

Existen diferentes tecnologías para la remediación de suelos contaminados, sin embargo el uso de microrganismos (biorremediación) es la más utilizada en caso de contaminación por hidrocarburos, debido a que ésta tiene como bondad el uso de los procesos microbiológicos naturales en el suelo, a través de ellos logra la degradación del contaminante⁷. La biorremediación de los hidrocarburos en el suelo se fundamenta en la premisa de que la presencia de hidrocarburos incrementa la actividad microbiana, ya que los microorganismos los utilizan como fuente de carbono y energía para el desarrollo de sus procesos metabólicos, lo que induce a su degradación⁸. Entre las técnicas biológicas, la bioestimulación, que consiste en adicionar al suelo contaminado nutrientes que aumenten la actividad microbiana, siendo la más utilizada debido a que los microorganismos autóctonos producen mejores y más rápidos resultados⁹.

Las bondades de la bioestimulación como técnica para la remediación de suelos contaminados con hidrocarburos ha sido estudiada en diversas investigaciones, que han justificado su eficiencia^10-13. Se ha comprobado que el uso de nutrientes de origen natural es efectiva para la bioestimulación de los microorganismos, por lo que en la presente investigación tuvo como objetivo evaluar el extracto de cáscara de naranja (Citrus sinensis) y el aceite de pino (Pinus patula) como bioestimulantes, midiendo su efecto sobre la degradación de los hidrocarburos constituyentes del diésel de petróleo.

 

Materiales y métodos

En la investigación se trabajó con una arena obtenida de una cantera de extracción de materiales para construcción, la cual fue caracterizada a través del método de tamizado para obtener su perfil granulométrico, según el protocolo de ensayo descrito en el método de prueba estándar para el análisis del tamaño de las partículas de los suelos¹⁴. También se determinó el porcentaje de extraíbles con hexano (HEM) ¹⁵ y el pH mediante el método de prueba estándar para el pH de los suelos¹⁶.

Los productos remediadores utilizados fueron el extracto de cáscaras de naranja (C. sinensis), se obtuvo a partir de material fresco que se fraccionó en pedazos pequeños (1 cm) se lavó y secó al sol por cinco días, luego se colocó en extractores Soxhlet con una mezcla de alcohol isopropílico y agua (70:30). El extracto fue concentrado en un rotaevaporador, se preparó una solución al 5% en agua¹⁷. El aceite de pino se obtuvo de proveedores comerciales (Macroquímicos S.A.C).

La arena fue caracterizada mediante análisis granulométrico¹⁴, posteriormente fue contaminada con combustible diésel comercial (DB2), utilizando 100 mL/kg de arena (79000 mg/kg), se dejó en reposo por siete días a temperatura promedio de 25 °C. Se aplicó cada remediador: extracto de cáscaras de naranja (ECN) y aceite de pino (ADP) en dos dosis (50 y 100 mL/kg de arena contaminada) y se realizó un monitoreo de la variable HEM a los 7, 15, 30, 45 y 60 días. Cada tratamiento se realizó por triplicado, lo que generó un diseño factorial con una variable respuesta (HEM) y 3 factores experimentales (Tipo de remediador (TR), Dosis aplicada (DA) y Tiempo (T)). El diseño seleccionado fue de una muestra con tres factores experimentales, una unidad control y tres réplicas, para un total de 96 ejecuciones, con una muestra tomada en cada ejecución. Las unidades experimentales (UE) se distribuyeron de forma aleatoria y se mantuvieron a condiciones controladas de laboratorio (temperatura promedio de 25 °C, con 6 h de luz diarias y humedad promedio de 80%).

Se calculó la eficiencia de degradación de cada uno de los tratamientos aplicados, así como de la atenuación natural (SR) (unidad control) mediante la ecuación 1¹¹

Los resultados fueron tratados estadísticamente mediante análisis factorial, se realizó previamente una prueba de normalidad mediante los test de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilks¹⁸ para corroborar que si los datos se ajustan a una distribución normal, para luego aplicar una prueba ANOVA factorial con contraste de rangos de Tukey¹⁹, para establecer si los factores experimentales muestran influencia significativa sobre la variable dependiente. El nivel de confianza utilizado fue de 95% (α=0.05). Se utilizó para los cálculos el software estadístico InfoStat versión 2018²⁰.

 

Resultados

Figura 1. Curva granulométrica de la muestra de Arena

Se observa una predominancia de granos de mayor tamaño, es decir el material que logró pasar a través de las aperturas mayores, por lo que se obtuvo que los granos de arena entre 0.063 a 2 mm representaron el 94.35% y 5.65% corresponde a partículas de limo, no se observó partículas de arcilla (< 0.04 mm). De acuerdo a los resultados, se trabajó con una muestra de arena fina, en función a su ubicación en el triángulo textural, basado en la hoja de cálculo USDA²¹. El pH se obtuvo un valor 6.0 medido en una proporción 1:2.5 clasificando a la arena como moderadamente ácida.

La arena se contaminó con una proporción de 100 mL de diésel/kg, que representa un porcentaje inicial de HEM adicionado de 7.88%, valor obtenido luego de determinar la densidad del diésel, de 0.855 g/mL. Luego de siete días en reposo, se determinó el HEM de la arena obteniéndose un valor de 6.52%, que representa una disminución de 17.3%, se debe a la SR y la volatilización de los hidrocarburos más ligeros del derivado de petróleo, que tiene un rango de componentes alifáticos entre C₁₅ y C₁₈²². Si se aplica el tratamiento desde el primer día se incurre en el error de contabilizar esta pérdida de hidrocarburos como parte del proceso de biorremediación, ya que el proceso de vaporización de los hidrocarburos es parte de la degradación por procesos naturales²³.

Tabla 1. Resultados promedio de porcentaje de aceite y grasas en relación al tiempo

SR: Arena contaminada sin remediación, ECN: Extracto de cáscaras de naranja, ADP: Aceite de pino.

 

Figura 2. Comportamiento de los valores de HEM en función al tiempo

Se observa como las muestras tratadas con los remediadores presentan una disminución de HEM mayor a los valores por SR. Se destaca el comportamiento del tratamiento ECN con 100 mL, a pesar que al inicio (15 días) presentó un HEM cercano al arrojado por SR, reportando una disminución marcada hasta llegar a valores cercanos a los de los otros tratamientos al cabo de los 60 días de prueba. El cálculo de la eficiencia de degradación (ecuación 1) dio como resultado que el remediador con la mayor eficiencia fue el ECN con resultados similares para las dos dosis aplicadas de 92.07% en promedio respecto al valor inicial. Igualmente se obtuvo para el ADP una eficiencia de 87.88%, resultó menor a la obtenida para ECN. A pesar de observarse una tendencia a la SR, la eficiencia en este caso fue de 64.72%, valor menor a los obtenidos con los tratamientos. Además se observó que según la tendencia de los resultados para que la unidad control alcance el valor final menor de HEM obtenido con los tratamientos (0.95%), se debe esperar aproximadamente 60 días más, es decir el doble de los días requeridos para remediar la arena tratada al aplicar los productos evaluados.

El tratamiento estadístico de los datos inició con los test de normalidad de los valores obtenidos de HEM mediante Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilks, con la finalidad de determinar si los datos obtenidos presentan una distribución normal, lo que condiciona el tipo de estadística a aplicar (paramétrica o no paramétrica)¹⁸. En el primer test se obtuvo que el p-valor mayor al nivel de significancia establecido de α = 0.05 (p-valor = 0.2644), lo que indicó que los datos se ajustan a una distribución normal, el segundo test arrojó un p-valor=0.067, mayor a 0.05.

Los resultados anteriores indican que los datos de HEM se ajustan a una distribución normal, por lo tanto, se pueden aplicar pruebas estadísticas paramétricas, en este caso el ANOVA factorial y el contraste de rangos de Tukey.

Los resultados en la Tabla 2 indican que los factores Tiempo y Dosis ejercieron un efecto estadísticamente significativo sobre la variable HEM (p-valor < 0.05) y el factor TR no fue significativo sobre los resultados por presentar un p-valor > 0.05.

Tabla 2. Resultado de análisis de varianza multifactorial para HEM

La Tabla 3, los resultados de HEM son estadísticamente diferentes en cada intervalo de tiempo en el que fueron medidos, lo que indica que, en el lapso de tiempo de la investigación, no se estabilizó el valor de la cantidad de hidrocarburos en la arena, sino que aun a los 60 días seguía disminuyendo de forma significativa.

Tabla 3. Contraste de rangos de Tukey para HEM por Tiempo (Días)

La Tabla 4 se observan diferencias significativas con un nivel de significancia de 0.05 entre las dos dosis aplicadas, así como entre éstas y los resultados obtenidos en la unidad control a la que no se le aplicó ningún tratamiento.

Tabla 4. Contraste de rangos de Tukey para HEM por Dosis (mL)

La Tabla 5 se observa que, al aplicar los dos agentes remediadores estudiados, a pesar de existir una diferencia en la media de los resultados que favorece al ADP, esta diferencia no es estadísticamente significativa.

Tabla 5. Contraste de rangos de Tukey para HEM por Tipo de Remediador

 

Discusión

Al analizar la muestra de arena, no se obtuvo HEM en la muestra, lo que indica que, al ser una arena limpia, no presentó material con aceites solubles en n-hexano, por lo que se puede decir que cualquier presencia de aceites (hidrocarburos) posteriores se debe exclusivamente a una adición externa (producto de la contaminación).

El análisis factorial realizado mostró que los factores DR y TR son determinantes en los resultados (tabla 2). Se observó que a mayor dosis aplicada, mayor es la eficiencia de degradación de los hidrocarburos, este es un resultado que se ha observado en otra investigación¹¹, que utilizó como remediador el extracto de fibra de coco, la concentración utilizada influyó directamente en el resultado al igual que en la presente investigación, observándose porcentajes de eficiencia similares de 90.14%. La influencia del tiempo de remediación, es una tendencia esperada, debido a que mientras más tiempo están los hidrocarburos en el suelo, su cantidad va disminuyendo por la acción de los procesos fisicoquímicos y biológicos que los degradan^1,24,25.

Se observó, que la incorporación de extractos y aceites vegetales influyen significativamente en la velocidad de degradación de los hidrocarburos en una muestra de arena y se logra una disminución entre 87.88 y 92.97%. Los sólidos residuales del procesamiento de la caña de azúcar, también se han utilizado como remediadores, los que influyen de forma significativa en la degradación de los hidrocarburos²⁶. Así, al aplicar sustratos orgánicos a un suelo contaminado con petróleo, también se obtuvieron resultados satisfactorios, con degradación de hidrocarburos entre 55 y 60.1%, valores que fueron superados en la presente investigación²⁷. Igualmente, el ECN fue utilizado para remediar un suelo contaminado con petróleo, y manifestar su influencia en la velocidad de degradación de los hidrocarburos, lo que concuerda con los resultados de la presente investigación resultados^12,17.

El AP, puede ser utilizado como remediador con resultados que son estadísticamente similares a los obtenidos con ECN, sin embargo no se observaron investigaciones similares, para que nuestros resultados puedan sir motivo de contrastación, aunque el uso de biomasa de pino se ha utilizado en la preparación de compost y aplicado como enmienda en el proceso de biorremediación²⁸. La acción del AP como remediador se explica por su composición, una mezcla de hidrocarburos terpénicos y alcoholes terpénicos cíclicos, solventes de los hidrocarburos, además de ser utilizados para la extracción de aceites^29,30. Este efecto de disolución de los hidrocarburos hace que estén biodisponibles para ser utilizados por microorganismos del suelo, lo que permite que acelere su degradación. El aceite de agujas de pino (Cedrus deodara) presento propiedades antimicrobianas, se puede pensar en una contradicción respecto a los resultados obtenidos, sin embargo, se usó el aceite sobre cepas de bacterias degradadoras de alimentos y bajo condiciones de laboratorio, sin la presencia de hidrocarburos³¹, por lo tanto, no se pueden comparar los resultados. También, se ha estudiado la actividad antimicrobiana del aceite de Pinus halepensis sobre cepas de Escherichia coli, en cultivos in vitro³² y se señaló su efectividad, sin embargo, la aplicación fue directa, bajo condiciones muy diferentes a las establecidas en la presente investigación, por lo que se debe seguir investigando sobre el efecto del AP como remediador.

La composición del ECN es mayoritariamente hidrocarburos terpénicos principalmente el limoneno^33,34, por lo que el extracto hidroalcohólico obtenido posee estos componentes, además de otros, solubles en agua como los flavonoides, principalmente la naringina,³⁵ lo que hace que sus componentes principales sean similares a los del AP, esto influyó en que en el análisis factorial y el test de Tukey se determinara que ambos remediadores actúan de manera igual desde el punto de vista de la estadística (p-valor > 0.05). Se puede afirmar entonces que bajo las condiciones de esta investigación, el proceso de remediación de la arena estuvo influenciado por la dosis de agente remediador utilizado y el tiempo que se dejó actuar y no por el tipo de remediador aplicado.

Al comparar los resultados con los de la SR, se observó que aunque es evidente que la arena puede remediarse sin el uso de la remediación, la aplicación de esta técnica puede reducir el tiempo del proceso, ya que en el lapso estudiado se alcanzó un máximo de eficiencia de 64.72% y para lograr llegar a la máxima eficiencia obtenida con los tratamientos se necesitarían 60 días más, lo que representa el doble de los utilizados en la investigación. La eficiencia de la remediación de suelos contaminados con hidrocarburos comparada con la SR también fue estudiada en una investigación previa¹³, sin embargo en la misma, la diferencia entre la el tratamiento y la SR fue menor en comparación a los resultados obtenidos en la presente investigación, esto se debe principalmente a que se utilizaron suelos diferentes y se sabe que el tipo de suelo y sus características son determinantes en la remediación^36-38. La degradación de diésel en el suelo por SR y remediación con productos comerciales, también fue estudiada previamente³⁹, con resultados que coinciden con los obtenidos en la presente investigación, con lo que se concluye, que la incorporación de los productos remediadores aumenta el porcentaje de degradación de forma significativa y se demuestra su potencial aplicabilidad.

Los resultados obtenidos en esta investigación manifestaron que la remediación mediante la aplicación del ECN (C. sinensis) y AP (P. patula) es satisfactoria para disminuir los HEM presentes en una arena contaminada con diésel, observándose que ambos agentes remediadores actúan de forma similar, según el análisis ANOVA (α = 0.05). Se observaron diferencias significativas respecto a las dosis de bioestimulante aplicadas, así como también respecto a la cantidad de aceites y grasas en función al tiempo.

Lo anterior indica que la cantidad de remediador aplicado a la muestra de arena contaminada influye de manera significativa en el proceso de remediación y que su aplicación mejora el proceso de SR.

El uso de remediadores de origen vegetal como los utilizados, son una alternativa viable para la biorremediación de arenas contaminadas con diésel, según los resultados obtenidos, por lo que se debe seguir investigando la aplicación de los mismos en arenas contaminadas con otros tipos de derivados del petróleo como la gasolina, queroseno o aceites lubricantes, así como estudiar la eficiencia de los bioestimulantes utilizados aplicados a suelos de diferentes texturas.

 

Fuente de financiamiento

La investigación fue financiada por Innova Scientific SAC Perú.

 

Conflictos de intereses

Los autores declaran que no existe ningún tipo de conflictos de interés derivados de la realización de la presente investigación.

 

Agradecimientos

Los autores agradecen a la empresa Innova Scientific SAC Perú por todo el apoyo dado para la realización de la investigación.

 

Aspectos éticos

La aprobación de la investigación por el Comité de Ética, Centro de Investigación Científica Innova Scientific Perú y siguió las pautas establecidas para este comité.

 

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Nota del Editor:

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