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Journal of the Selva Andina Research Society

versão On-line ISSN 2072-9294

J. Selva Andina Res. Soc. vol.8 no.2 La Paz  2017

 

Artículo Original

 

Bioestimulación integral de un suelo contaminado por 60000 ppm de aceite residual automotriz

 

Integral biostimulation of soil polluted by 60000 ppm of motor waste oil

 

 

Saucedo-Martínez Blanca Celeste1, Farías-Rodríguez Rodolfo2, Santoyo-Pizano Gustavo2, Juan Manuel Sánchez-Yáñez1*

1Laboratorio de Microbiología Ambiental. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich, México.
2Ecologia Microbiana. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás.

celsm@live.com.mx
gsantoyo@umich.mx
rrfarias@umich.mx

*Dirección de contacto: 1* Laboratorio de Microbiología Ambiental. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Ciudad Universitaria, Col FJ Mujica S/N, Felicitas del Rio, 58000, Morelia, Mich., México

Juan Manuel Sánchez–Yáñez

E-mail address : syanez@umich.mx

Historial del artículo. 

Recibido Diciembre, 2016.
Devuelto mayo 2017
Aceptado junio, 2017.
Disponible en línea, agosto, 2017.

 

 


Resumen

El aceite residual automotriz (ARA) es una mezcla de hidrocarburos (HICO) contaminantes del suelo. Dado que el problema es complejo así debe ser la solución una bioestimulación (BIS) secuencial, complementaria y acumulativa , o integral; una primer BIS con detergente que emulsifique el ARA, una segunda con solución de nutrientes inorgánicos que restituya la relación C (carbono): N (nitrógeno); una tercera con H2O2 como proveedor de O2 (oxigeno) para favorecer la oxidación del ARA, y el control de la humedad del suelo al 80% de la capacidad de campo pare el intercambio de gases en la mineralización de ARA. El objetivo de este trabajo fue: i) bioestimulación integral del suelo contaminado por 60000 ppm de ARA. El suelo se bioestimuló integralmente con detergentes, una solución mineral (SOMI), H2O2, y la humedad del suelo se ajustó al 80% de la capacidad de campo. Además, se cuantificó la población bacteriana oxidante de ARA, que sintetizo detergentes asociados con la emulsificación del ARA y realizo su identificación molecular. Los resultados probaron que la BIS secuencial complementaria y acumulativa o integral con un detergente aniónico/no iónico, la SOMI, el H2O2 al 0.5% redujeron el ARA de 60000 ppm a 27200 ppm en 23 días. Mientras que la densidad de la población oxidante de ARA fue de 268 X 106 UFC/g de suelo seco, de ahí se seleccionaron las dominantes que sintetizaron detergentes relacionados con el ARA e identificaron 47 géneros bacterianos divididos en: Actinomicetos, Firmicutes y Proteobacterias. Lo anterior apoya que la alternativa para remediar un suelo impactado con ARA demanda una solución compleja o integral; y que existen en ese ambiente bacterias que sintetizan detergente, con un empleo potencial en suelo contaminado con ARA.

Palabras clave: Suelo, ARA, detergente, H2O2, solución mineral, mineralización.


Abstract

Waste motor oil (WMO) is a mixture of hydrocarbons (HICO) soil pollutants. An alternative solution for its elimination is the biostimulation (BIS), secuancial, complementary and accumulative or integral which requires at first BIS by detergents to emulsify WMO, the second one following by enrichment by mineral solution, H2O2  as a O2 source for oxidation of WMO and controlling moisture soil content at 80% field capacity for exchange gases in soil to stimulate WMO mineralization  The aim of the work was: i) analyze in the integral BIS of contaminated soil by 60000 ppm of WMO. The first BIS was applying detergents to emulsify the WMO, the second BIS by mineral solution, then by H2O2, under humidity control at 80% of field capacity, for the best oxidation of WMO. Additionally bacterial population oxidant WMO was measured, to select those which synthetized detergent related to WMO degradation, finally the type of bacteria were molecular identify. Results showed than integral BIS by an anionic / nonionic detergent, then enrichment with mineral solution, and 0.5% H2O2, reduced WMO from 60000 ppm to 27200 ppm in 23 days. Density of bacterial WMO oxidant population was 268 X 106 CFU/g dry soil, from which the dominant ones were selected and identified 47 bacterial genera divided into: Actinomycetes, Firmicutes and Proteobacteria. These results showed that soil pollution by high concentration level of WMO demanded at integrated BIS, also was found some bacterial genus which synthetized detergent with potential used in soil polluted by WMO.

Key words: Soil, WMO, detergent, mineral solution, H2O2, Mineralization.


 

 

Introducción

El aceite residual automotriz (ARA) es una mezcla de moléculas insolubles de hidrocarburos (HICO) alifáticos de cadenas de entre C11-C20 y de C20-C35, al igual que aromáticos, policíclicos, halogenados (García-Hernández et al. 2007), mostrados en la  Tabla 1, en consecuencia esta mezcla en México se clasifica como un residuo peligroso, de acuerdo con la regulación conocida como: “Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección al Ambiente” (LGEEPA 2008); el ARA es generado en talleres mecánicos por uso en la maquinaria agrícola, su inadecuada disposición final es un grave problema ambiental, cuando contamina el agua o suelo (Rosales-Morales 2008), porque en lo general también es de riesgo para la salud humana y la vida. En suelo ARA, forma una película en la superficie que impide el intercambio de O2 (oxigeno), la difusión de agua (Larenas-Parada & De Viana 2005), inhibe los ciclos biogeoquímicos que sustentan la vida, tales efectos negativos limitan la producción agrícola (Pardo-Castro et al. 2004), además de que contaminan el agua superficial y subterránea (Rosales-Morales 2008, Cando-Rodríguez 2011). Algunas alternativas para remediar el suelo impactado con una relativa elevada concentración de ARA superiores a 4440 ppm; recomiendan agentes químicos (Delgadillo-López et al. 2011) como el KMnO4 (permanganato de potasio) y (NH4)2S2O8 (persulfato de amonio) que son oxidantes fuertes (Villalba 2013), con la desventaja de su alto costo y daño colateral al ambiente. Mientras que la opción biológica es la BIO (biorremediación) del suelo por BIS (bioestimulación) para la eliminación de 60000 ppm de ARA, que induce a la microbiota nativa heterotrófica aerobia a oxidarlo, primero con un detergente para su emulsificación, seguida de una segunda BIS por enriquecimiento con minerales de N (nitrógeno), PO-34 (fosfatos) K (potasio) y el H2O2 una fuente de O2 elemento fundamental en la oxidación del ARA, mientras que un aspecto obligado de la BIS, es asegurar una humedad del suelo al 80% de su capacidad de campo, lo que facilita el intercambio de gases pues la mineralización del ARA es aeróbica (Pardo-Castro et al. 2004). La integración de estos factores físico-químicos es decir secuencial, complementaria y acumulativa en la BIS son clave en la eficaz recuperación de suelo, la que en realidad ha sido poco investigada, siendo fundamental para entender y manejar un problema de contaminación por ARA, con una solución ecológica y eficaz, por lo que el objetivo de este trabajo fue la bioestimulación integral de un suelo contaminado por 60000 ppm de ARA.

 

Materiales y métodos

Figura 1. Matraz Bartha

Bioestimulación con detergente para emulsificar y H2O2 para inducir la máxima mineralización del ARA. En la BIS del suelo, se seleccionó el detergente y la concentración de H2O2 para la máxima mineralización del ARA. Para ello se realizaron pruebas en 36 microcosmos, matraces tipo Bartha (Figura 1) (Leal-Castillo 2003), la mineralización del ARA se determinó por la generación de CO2 derivado de su oxidación. Para ello 100 g de suelo contaminado con 60000 ppm de ARA se colocaron en cada matraz Bartha, que se bioestimuló de 2 veces a la semana con los detergentes: alcohol etoxilado/anió nico dodecil sulfato de sodio (ALEDOS) y alcohol etoxilado (ALETO), mientras que BIS con 1.0 mL/100 g de suelo con el H2O2 al 0.5% y 0.1% por 30 días (Ruiz-Nájera 2001). En el suelo como variable respuesta de la desaparición del ARA, se empleó el método de Soxhlet recomendado ampliamente para la detección de grasas y aceites en ambientes naturales antes y después de la BIS secuencial, complementaría y acumulativa (Infante et al. 2010).

En suelo cuantificación de la población bacteriana heterotrófica oxidante de aceite residual automotriz. Para ello 1 g de suelo contaminado con ARA bioestimulado con detergente, solución mineral, H2O2, ajustado al 80% de la capacidad de campo, se diluyó en solución salina detergente con NaCl al 0.85% (detergente Corona al 0.1%) mediante diluciones seriadas10-1 a 10-10 (Mercadé et al. 1996, Walter et al. 2010), de las que se tomaron 0.2 mL para sembrar en agar ARA (Willumsen & Karlson 1997, Walter et al. 2010) con la siguiente composición (g L-1): peptona de caseína 5 g, extracto de levadura 1 g, KH2PO4 2.5 g, K2HPO4 2.5 g, MgSO4 2.5 g, NaCl 1.0 g, solución de oligoelementos 1 mL, azul de bromotimol al 0.01% 5mL, aceite residual automotriz 10 mL, detergente al 0.5% 4 mL /100 mL ARA, el pH se ajustado a 7.0, luego las cajas de agar ARA se incubaron a 30 oC/48 h, pare el conteo bacteriano expresado UFC (unidades formadoras de colonias)/g suelo seco: las UFC dominantes y diferentes se seleccionaron y purificaron, en agar nutritivo como agar ARA para obtener cultivos axénicos y realizar la prueba de detección de la síntesis de detergentes bacterianos asociada con la mineralización del ARA.

Detección de la síntesis de detergentes “in vitro” por la técnica “Drop-collapse” en las bacterias oxidantes de aceite residual automotriz. Para la detección de la síntesis de detergente en las bacterias del suelo contaminado con ARA, se usaron microplacas de poliestireno de 96-micropozos de 12.7 x 8.5 cm, con un diámetro cada uno de 8 mm (Bodour & Miller-Maier 1998), previamente cada micropozo se lavó 3 veces con agua caliente, etanol, agua destilada en proporciones 1:1:1, para la prueba cualitativa en cada pozo se agregó 1.8 µL aceite de motor 10W-40 Pennzoil®, en tanto que para la cuantitativa 0.2 µL de aceite mineral. En ambas pruebas en ambas se agregó una alícuota de 5.0 µL de caldo ARA, en el centro de cada micropozo, entonces la microplaca se inclinó en un ángulo de 45°. En la prueba cualitativa los resultados fueron evaluaron visualmente después de 1 min, si la gota de aceite perdía su forma, se consideró positivo derivado de su emulsificación; mientras que en la cuantitativa luego de 1 min se midió el diámetro de las gotas con un micrómetro calibrado (Bodour et al. 2003).

Identificación molecular de las bacterias productoras de detergentes oxidantes aislados durante la bioestimulación de suelo contaminado con aceite residual automotriz. En esta etapa de cada cultivo axénico de las bacterias oxidantes de ARA, que sintetizaron detergente, se realizó la extracción y purificación del ADN genómico. El ADN fue analizado por electroforesis con gel de agarosa al 1%, se amplificó la región hipervariable V3 del gen 16S rRNA. Las condiciones de reacción para la PCR del termociclador fueron desnaturalización inicial de ADN a 95 ºC/1 min, seguido de 10 ciclos de desnaturalización a 95 ºC/30 s, hibridación 65-60 ºC/30 s, con una reducción de la temperatura de 0.5 ºC en cada ciclo, un paso de extensión a 72 °C/1min. Para separar y visualizar los amplicones de rRNA 16S se realizó de nuevo la electroforesis con gel de agarosa al 1%, que se corrió a 80 V/30 min. Al finalizar el gel se observó en un transiluminador UV (Cisneros de la Cueva et al. 2016) finalmente se realizó la identificación molecular (Laboratorio de Bacteriología Molecular, CINVESTAV Unidad Irapuato, Gto, México). Las secuencias obtenidas fueron analizadas, taxonómicamente clasificadas con un algoritmo BLASTn.NET distribuido (Dowd et al. 2005) contra una base de datos de secuencias 16S rRNA de alta calidad obtenidas de NCBI (Cisneros de la Cueva et al. 2016)

 

Resultados 

En la Figura 2 se indica la BIS integral del suelo contaminado por 60000 ppm de ARA, primero  mediante los detergentes: ALEDOS, ALETO, luego por la solución mineral, seguida por H2O2 al 0.5% y 0.1%, y asegurada por la humedad del suelo ajustada al 80% de la capacidad de campo: en donde se observó la generación de CO2 producto de la mineralización del ARA. La BIS integral iniciada por la solución mineral; seguida del H2O2 al 0.1% y 0.5% en el día, contribuyó al aumento de la oxidación del ARA, en consecuencia hubo la máxima generación de CO2 hasta el día 12. Mientras en la segunda BIS por la solución mineral, el H2O2 al 0.5% y 0.1% en los días 13, 14 y 15 no aumento la cantidad de CO2, los valores numéricos derivados de la mineralización del ARA, no tuvieron diferencia estadística en comparación con los mismos valores numéricos del CO2 liberado en el suelo empleado como control negativo o CN, producto de la atenuación natural.

Figura 2. En suelo producción de CO2 derivado de la mineralización del aceite residual automotriz por Bioestimulación integral con detergentes dodecil sulfato de sodio/alcohol etoxilado, alcohol etoxilado, H2O2, solución mineral y control de la humedad del suelo al 80% de capacidad de campo.

La Tabla 1 se muestra la BIS integrada de suelo, la primera al emulsificar el ARA por el detergente ALEDOS, a continuación por la segunda con la solución mineral, y la tercer BIS H2O2 al 0.5% lo decrecieron desde 60000 ppm a 27200 ppm, en tanto que la BIS con el detergente ALETO al 0.5%, seguida de la solución mineral, y la última con el H2O2 lo disminuyeron hasta 28100 ppm; en comparación con la BIS integral del suelo con ALEDOS, luego con la solución mineral y H2O2 al 0.1%, provoco una disminución del ARA desde 60000 ppm, hasta 30200 ppm; comparado con los valores numéricos de la mineralización del ARA en el suelo CN, donde la atenuación natural, lo redujo de 60000 ppm a 51200 ppm.

Tabla 1. En suelo concentración de aceite residual automotriz por la bioestimulación integral con detergentes: alcohol etoxilado/dodecil sulfato de sodio, alcohol etoxilado H2O2, solución mineral a capacidad de campo del 80%


ALETO: alcohol etoxilado, ALEDOS: alcohol etoxilado/dodecil sulfato de sodio *Tukey (0.025):
Letras iguales= sin diferencia estadística

En la Tabla 2 se muestra en el suelo BIS integral impactada con 45000 ppm, la densidad de la población bacteriana oxidante de ARA, con un valor de 268 UFC x 106/g suelo seco; comparado con el valor numérico de la población bacteriana del suelo usado como CA, donde había 40 UFC x 106/g suelo, ambos valores numéricos fueron estadísticamente diferentes, en comparación con lo registrado en el suelo bioestimulado  integralmente.

Tabla 2. En suelo densidad de la población bacteriana oxidante de aceite residual automotriz derivada de la bioestimulación integral


*Tukey (0.025) Letras distintas= con diferencia estadística.    UFC = unidades formadoras de colonias.

En la Tabla 3 se presenta los aislados bacterianos del suelo contaminado con 27200 ppm de ARA derivados de la BIS secuencial, complementaria y acumulativa o integral, que crecieron en agar ARA: mediante la prueba in vitro para la síntesis de detergentes de la que se obtuvieron: 12 actinomicetos, 10 firmicutes y 25 proteobacterias de los 47 aislados, se demostró que 44 fueron positivos, mientras que la identificación molecular, dividió al grupo en una amplia diversidad de géneros y especies representados por los siguientes géneros y especies: Achromobacter sp., Gordonia amicalis y Bacillus subtilis.

Tabla 3. Determinación de la síntesis de detergentes “in vitro” de actinomicetos, firmicutes y proteobacterias que mineralizan el aceite residual automotriz (derivada de la bioestimulación integral) por la técnica cualitativa “Drop-collapse”


Producción detergente +: positivo -: negativo

En la Tabla 4 se muestra el diámetro de gota de aceite mineral medido por síntesis de detergentes en los: actinomicetos, firmicutes y proteobacteria de suelo impactado por 27200 ppm de ARA por el método Drop-collapse. Ahí se registró que Streptomyces sp., SCARA1h y Gordonia amicalis SCARA8i tuvieron el mayor diámetro de gota con 5.16 mm, estos valores numéricos fueron estadísticamente diferentes a los de B. subtilis SCARA3h1 y S. hominis SCARA6i con 4.33, y 4 mm de diámetro de gota mientras que Acinetobacter ursingii SCARA3f2 registró un diámetro de gota de 4 mm. En este ensayo de la prueba Drop-collapse todos los valores anteriores fueron estadísticamente diferentes al blanco o control absoluto sin aceite que solo contenía agua, ahí el diámetro de gota fue solo de 2 mm.

Tabla 4. Determinación de la síntesis de detergentes “in vitro” de actinomicetos, firmicutes y proteobacterias que mineralizan el aceite residual automotriz, por la técnica cuantitativa “Drop-collapse”


*Tukey (0.025) Letras diferentes = con diferencia estadística

En la Figura 3 se muestra la identificación de géneros y especies bacterianos de un suelo con 27200 ppm de ARA, basado en las secuencias parciales de los genes 16S rRNA, con lo que de los 47 se detectaron 3 grupos: 12 actinomicetos, 10 firmicutes y 25 protobacterias.  

Figura 3. Árbol filogenético basado en las secuencias parciales de los genes 16S rRNA de los géneros y especies de bacterias aisladas de un suelo contaminado con 45000 ppm de aceite residual automotriz

 

Discusión  

La Figura 2 sugiere que la BIS integral del suelo mediante, primero los detergentes ALEDOS, ALETO; luego la segunda por la solución mineral, que reestableció la relación C (carbono): N (nitrógeno) para facilitar la oxidación de las formas sencillas y parcialmente complejas, luego la tercer BIS se realizó con el H2O2, mientras como parte de la integral BIS se mantuvo la humedad al 80% de la capacidad de campo que favoreció el intercambio de gases, lo que indujo a la microbiota nativa heterotrófica aerobia al consumo inicial de la fracción alifática del ARA, lo que sugiere la ruta oxidativa que involucra  los ácidos grasos, luego al decrecer los alifáticos, hubo una ataque microbiano sobre los aromáticos, como consecuencia la disminución de la concentración de la generación del CO2, debido a que los aromáticos del ARA son resistentes a la degradación biológica (Pinto et al, 2007).

En la Tabla 1 se muestra la BIS  integral del suelo con los detergentes que emulsificarón del ARA, ello sugiere que sucedió por sorción de los HICO en la superficie del suelo, luego por la formación de micelas (Zhon-Yi et al. 2014) para que con la segunda BIS mediante la solución mineral, seguida por la tercera con el H2O2 al 0.5 y 0.1 %; indujeron a que los microorganismos autóctonos heterótrofos aerobios tuviesen a disposición el ARA para su mineralización (Riojas-González et al. 2010). En suelo la BIS con los detergentes mixtos de mezclas aniónicas y no iónicos del ALEDOS fueron eficaces en la desorción de los HICO del ARA, en comparación con los detergentes anionicos y catiónicos, o los catiónicos y no iónicos comunes recomendados para emulsificar HICO (Fujii et al. 1986, Altmajer 2004). La BIS con el detergente no iónico ALETO (alcohol etoxilado) solubilizó el ARA, mejor que los anionicos acorde como lo reportaron Pinto et al. (2007) para que tanto la segunda BIS con solución mineral y la tercer con el H2O2 integralmente facilitaron la mineralización del ARA En suelo impactado con ARA las concentraciones del detergente al 0.5% y 0.1%  sugieren que emulsificarón los HICO  por la mayor formación de micelas disponibles para solubilización (Shi et al. 2013), además la BIS con el H2O2 al 0.1% y 0.5% indujo la mineralización del ARA (Asquith et al. 2012, Sáenz-Marta et al. 2015).

En la Tabla 2 se muestra los datos experimentales que fueron similares a lo reportado por Zamora et al. 2012, que registraron en suelo impactado HICO de crudo mediano un aumento en la densidad de bacterias oxidantes de esa clase de HICO en comparación con la misma densidad registrada en el suelo sin contaminar con el crudo mediano u CA; al respecto García et al, 2011 reportaron que en un suelo impactado por HICO totales del petróleo, por BIS con fertilizantes minerales hubo un incremento en la densidad microbiana, en comparación con el mismo suelo usado como CA. Mientras que Venosa & Zhu 2003 en un suelo bioestimulado con minerales se detectó la degradación de HICO, que generó compuestos intermediarios simples durante su mineralización, debida a que la BIS indujo una amplia diversidad microbiana heterotrófica aerobia oxidante de HICO. El valor numérico de la densidad bacteriana de 268 UFC x 106/g suelo fue estadísticamente diferente, comparado con los con 40 UFC x 106/g suelo de la misma población del suelo CA sin ARA

Los resultados de la Tabla 3 sugieren que ciertos géneros y especies de bacterias asociadas la BIS del suelo contaminado con ARA, tienen capacidad potencial de síntesis de detergentes, demostrado por una prueba cualitativa; esa capacidad rompe las fuerzas de tensión superficial entre la gota y la hidrófoba del aceite, lo que permite que se use como la fuente de C (carbono) y energía o el HICO, a la vez que facilita su parcial o total solubilización en el  en agua, similares a las que existen en el ARA, por lo que este tipo de bacterias están obligadas a sintetizar detergente para consumir los HICO (Supaphol et al. 2011, Yáñez-Ocampo & Wong-Villareal 2013).

En la Tabla 4 muestra los resultados de la identificación molecular de Streptomyces sp., SCARA1h que esta reportado como capaz de sintetizar del tipo fosfolipopeptidos, con un alto grado de emulsificación de HICO (Rajeswari et al. 2016). Así como los géneros y especies: Gordonia amicalis SCARA8i. Mientras que B. subtilis SCARA3h1 es un género bacteriano que sintetiza un detergente de naturaleza lipopeptido C (Tugrul & Cansunar 2005, Sousa et al. 2014), así como Acinetobacter ursingii SCARA3f2 que Cisneros de la Cueva et al. 2016 que reportan como sintetizador de detergente; al igual que S. hominis SCARA6i (Yáñez-Ocampo & Wong-Villareal 2013).

En la Figura 3 la mayoría de las bacterias identificadas están reconocidas como emulsificadoras de HICO y sintetizadores de detergentes, al igual que los actinomicetos, del tipo Streptomyces sp., SCARA1h (Cheng et al. 2015) y Gordonia amicalis SCARA8i (Hao et al. 2008) reportada y recuperada de suelo contaminado por una elevada concentración de HICO, por lo que se sabe que ambos, sintetiza al menos dos tipos de detergentes (Franzetti et al. 2008). En las Proteobacterias se registraron nuevas especies bacterianas por primera vez reportadas como es el caso de Achromobacter, mientras el género Acinetobacter pertenece a las Proteobacterias que sintetizan complejos de lípidos-polisacáridos (Youssef et al. 2004). Los resultados de este ensayo indican que los géneros y especies identificadas tienen valor potencial en la bioaumentación de suelo impactados por ARA. Mientras que la BIS integral  de un suelo contaminado con una alta concentración de ARA de 60000 ppm, permito con la primer BIS con el detergente emulsificar la mayor parte de la mezcla de HICO; seguida de la segunda BIS con el enriquecimiento de la solución mineral; mientras que con la tercer acción mediante el H2O2 y el control de la humedad en el suelo se lograron las condiciones ambientales adecuadas para rápida reducción de la concentración del ARA en vía a la recuperación del suelo impactado por esta mezcla de HICO.

 

Conflictos de intereses 

Los autores declaran que no existe ningún tipo de conflicto de interés en su planificación, realización y redacción con las instituciones involucradas y así como las que apoyaron económicamente esta investigación.

 

Agradecimientos 

Al apoyo de la Coordinación de Investigación Científica-UMSNH proyecto 2.7 (2017), a BIONUTRA S.A. de C.V. Maravatío, Mich, México y a CONACYT por la beca para la primera autora.

 

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