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Revista Científica Ciencia Médica

versión impresa ISSN 2077-3323

Rev Cient Cienc Méd v.13 n.2 Cochabamba dic. 2010

 

ARTÍCULO DE REVISIÓN

 

El Método MODS, una Alternativa para el Diagnóstico de la Tuberculosis y la Detección de Cepas Multidrogoresistentes

 

The MODS Method, an Alternative for the Diagnosis of Tuberculosis and the Detection of Multidrug-Resistance Strains

 

 

Rodrigo Arturo Arnez-Durán1, Luis Alberto Ayllón-Anzaldo1, Rosario Castro-Soto2, Daniel Lozano-Beltrán3

 

1Estudiante de medicina, Universidad Mayor de San Simón. Cochabamba, Bolivia

2Servicio de infectología, Hospital Clínico Viedma. Cochabamba, Bolivia.

3CEADES salud y medio ambiente, Universidad Mayor de San Simón. Cochabamba, Bolivia.

Correspondencia a: Rodrigo Arturo Arnez Duran rockarnez@hotmail.com

Procedencia y arbitraje: no comisionado, sometido a arbitraje externo.

Recibido para publicación: 30 de Septiembre de 2010
Aceptado para publicación: 30 de Noviembre de 2010

Citar como: Rev Cient Cienc Med 2010;13(2): 81-5

Abreviaciones y acrónimos utilizados en este artículo:

TB = Tubeculosis
MDR-TB=
Multidrug-Resistant Tuberculosis [Tuberculosis multidrogo-resistente]
MODS
= Microscopic Observation Drug Susceptibility [Susceptibilidad a Fármacos mediante Observación Microscópica]
UFC
= Unidades formadoras de colonias

 

 


RESUMEN

En reiteradas ocasiones se ha establecido la necesidad de contar con un método rápido, sensible, específico y de bajo costo que permita realizar un diagnóstico oportuno de la Tuberculosis y la detección temprana de cepas de Mycobacterium tuberculosis multidrogaresistentes. Respondiendo a esta necesidad se ha diseñado un método capaz de distinguir entre pacientes con Tuberculosis y pacientes control sanos, además de facilitar la detección de cepas resistentes a los fármacos isoniacida y rifampicina de manera más rápida y efectiva en comparación con las pruebas consideradas como Gold Standard.
En esta revisión analizaremos el método de Susceptibilidad a Fármacos mediante Observación Microscópica (MODS).

Palabras claves: tuberculosis, diagnóstico, tuberculosis resistente a múltiples medicamentos


ABSTRACT

Has been repeatedly highlighted the need for a rapid, sensitive, specific and low-cost method that allows early diagnosis of Tuberculosis and multidrug-resistance strains. Responding to this need, a method has been designed, wich is able to distinguish between patients with Tuberculosis and healthy control patients, also facilítate the detection of drug-resistance strains to the drugs isoniazid and rifampin for faster and more effective way compared to the tests considered as Gold Standard.
In this review we discuss the method Microscopic-Observation Drug Susceptibility (MODS).

Keywords: tuberculosis, diagnosis, multidrug-resistant tuberculosis


 

 

INTRODUCCIÓN

La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa que se extiende a través del aire; si no se trata, una persona que presente TB activa infecta alrededor de 10 a 15 individuos cada año. Más de 2 billones de personas, cifra equivalente a un tercio de la población mundial, está infectada con el Mycobacterium tuberculosis; 1 de cada 10 personas infectadas sufrirá la enfermedad activa en su vida1. Actualmente se estima que 1,3 millones de personas mueren a causa de TB cada año y que existen aproximadamente 0,5 millones de casos de MDR-TB en el mundo2.

Esta enfermedad agobia desproporcionalmente a los países de bajos recursos económicos y constituye uno de los problemas de salud pública más serios en Bolivia, donde la falta de un diagnóstico temprano, incapacidad de determinar la susceptibilidad a drogas y el creciente número de casos de personas infectadas con el VIH3,4, crean un efecto sinérgico con la pobreza. Las actuales estrategias de control pierden importantes oportunidades para interrumpir la transmisión5. El cultivo convencional en medio de Lówenstein-Jensen sigue utilizándose para el diagnóstico; sin embargo, éste puede tomar varias semanas antes de tener un resultado concluyente5,6.

Este método fue desarrollado en la Universidad Peruana Cayetano Heredia por Luz Caviedes y Robert Gilman mientras trabajaban en indicadores de reducción colorimétrica. Cuando Caviedes examinaba cultivos en una placa de 24 pozos, empleando un microscopio óptico de luz invertida, pudo claramente identificar colonias de M. tuberculosis en el medio líquido mucho tiempo antes de que el crecimiento afectara las propiedades colorimétricas del mismo, Gilman reconoció de inmediato la potencial utilidad de este hallazgo para el desarrollo de un ensayo diagnóstico7.

Microscopic-Observation Drug Susceptibility Assay o MODS, nombre que deriva de sus siglas en inglés, las cuales significan Ensayo de Susceptibilidad a Fármacos mediante Observación Microscópica. Se basa en un cultivo en medio líquido que detecta M. tuberculosis y evalúa la susceptibilidad frente a los antimicrobacterianos de primera línea isoniacida y rifampicina directamente desde muestras de esputo8. Su empleo se sustenta en tres principios importantes: (1) M. tuberculosis crece más rápido en medio líquido que en medio sólido; (2) la posibilidad de la visualización de los cultivos (microcolonias) en forma de cordón en medio líquido bajo un microscopio invertido en una etapa temprana. Empleando un microscopio óptico de luz invertida y una placa de 24 pozos conteniendo muestras de esputo decontaminadas y resuspendidas en caldo Middlebrook 7H9 suplementado se puede examinar y detectar las microcolonias en un promedio de 7 días, y este es mucho más rápido que la detección del crecimiento macroscópico de las colonias en medio sólido; y (3) que la incorporación de las drogas isoniacida y rifampicina permite una rápida y directa detección de sensibilidad en forma concomitante son la observación del crecimiento bacteriano9.

Esta prueba está dirigida específicamente hacia el mundo en desarrollo, a fin de brindar alta especificidad y sensibilidad a un precio menor de 2 $, con una metodología de relativa simplicidad, recientemente revisada en la cual se han desechado todas las redundancias de la metodología original10.

De modo que, el MODS constituye una técnica simple, que aunada a la alta sensibilidad del medio líquido frente al medio sólido para la detección de TB, la especificad del crecimiento característico del M. tuberculosis, la evaluación de la susceptibilidad frente a drogas en un corto tiempo y el bajo costo de los reactivos, representan las mayores ventajas de este método frente a otras pruebas basadas en el cultivo que se utilizan actualmente para el diagnóstico de la TB.

Son puntos clave los siguientes: la sensibilidad (98%) supera significativamente a la del cultivo en medio Lowenstein-Jensen(84%) y al cultivo automatizado MBBacT (BacTAlert) (89%); resalta la rapidez de la detección (a partir del 7o día) comparada con Lowenstein-Jensen (26 días) y el MBBacT (13 días) (figura 1); a esto se añade que, el estudio de la susceptibilidad a fármacos se prolonga por varias semanas para los métodos mencionados, excepto para el MODS9. Es así como se reporta en un estudio realizado en Lima, Perú, desde Abril de 2003 hasta Julio de 2004, que incluyó 3760 muestras de esputo, de las cuales 401 (10,7%) fueron positivas para M. tuberculosis4,9.

Los cultivos positivos son detectados hasta el día 21 y más del 98% de estos se observan durante las primeras 2 semanas. Se ha revelado una concordancia del 99% en relación a los métodos considerados como el Gold Standard9.

 

SOLUCIONES STOCK

Son soluciones requeridas para el empleo de MODS:

Medio líquido Middlebrook 7H9 con casitona y glicerol

Middlebrook y colegas desarrollaron la fórmula base del caldo 7H9 durante el mismo período en que diseñaron la base agar 7H 10; ambos tipos de medios favorecen el crecimiento de las especies micobacterianas cuando son suplementadas con distintos nutrientes para su utilización en estudios de laboratorio11,12.

El caldo Middlebrook 7H9 (Becton Dickinson®), en fórmula aproximada por litro de agua purificada, contiene: fosfato monopotásico 2 g, fosfato disódico 1,5 g, glutamato monosódico 0,5 g, citrato sódico 0,1 g, sulfato de amonio 0,5 g, piridoxina 0,001 g, citrato férrico de amonio 0,04 g, sulfato magnésico 0,05 g, sulfato de zinc 0,001 g, sulfato de cobre 0,001 g, biotina 0,5 g, cloruro de calcio 0,5 g.

OADC

Suplemento de enriquecimiento del medio compuesto por ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa: la preparación comercial viene lista para su uso4,13.

PANTA

Suplemento antimicrobiano usado para minimizar la contaminación de los cultivos de MODS que puede ser causada por la flora oral de microorganismos no eliminados durante el proceso de decontaminación.

Contiene una mezcla liofilizada de agentes antimicrobianos: Polimixina B, Amfotericina B, Ácido Nalidíxico, Trimetoprim, Azlicilina4,13.

Soluciones Stock de antibióticos

Se emplean isoniacida 20 mg disuelta en 2,5 ml de agua destilada estéril y rifampicina 20 mg disuelta en 1,25 ml de dimetil sulfóxido y 1,25 ml de agua destilada estéril. Ambas soluciones se filtran y almacenan por separado en alícuotas de 20 μl en tubos estériles de microcentrífuga a -20°C hasta por 6 meses. Cada una de las alícuotas de 20 μl es suficiente para el estudio de 100 muestras (incluyendo sobrantes)13.

Soluciones para la recontaminación del esputo

Se emplean: hidróxido de sodio (NaOH), citrato de sodio tribásico dihidratado, fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4), fosfato de potasio monobásico en cristales (KH2PO4), N-acetil-L-cisteína (NALC), así como hipoclorito de sodio 10% para desinfectar el material contaminado13.

Cepas para el control positivo

Deben utilizarse cepas bien caracterizadas de M. tuberculosis (cepa H37Rv de M. tuberculosis ATCC 27294 para el control sensible y una cepa MDR) como controles positivos5,13. Se coloca la solución de la cepa en una placa Petri conteniendo agar Middle-brook 7H11 y se emplean cada vez que las muestras clínicas se procesan para MODS utilizando solución estéril de Tween 80 al 10% y agua destilada estéril. Los controles positivos evalúan la calidad del medio y la efectividad de los antibióticos. Para disminuir el riesgo de contaminación cruzada, estos controles positivos son procesados y colocados en una placa diferente, este proceso se realiza después de que las muestras clínicas hayan sido procesadas y selladas en bolsas plásticas tipo ziplock10,13. Se debe ajustar la turbidez a la escala 1 de McFarland, lo que involucra manipulación de concentradas suspensiones micobacterianas y deben llevarse a cabo solo en cabinas de bioseguridad13-16.

Si las cepas control no están comercialmente disponibles, se pueden emplear cepas locales caracterizadas y con un patrón de susceptibilidad conocido (cepa sensible a todas las drogas, y una cepa MDR o mono-resistente a rifampicina e isoniacida). Si se prefiere, una cepa MDR puede ser reemplazada por dos cepas monoresistentes: una cepa resistente a isoniacida/ sensible a rifampicina y otra cepa resistente a rifampicina/sensible a isoniacida13.

 

MÉTODO MODS

Para realizar MODS de manera segura se requiere como mínimo un Nivel de Bioseguridad 2 a 314. Específicas medidas de bioseguridad son necesarias para trabajar en MODS, estas se dividen en dos categorías: infraestructura adecuada y buenas prácticas de laboratorio. La principal preocupación de la prueba se refiere a la bioseguridad, y destaca que su uso seguro requerirá un "laboratorio básico de tuberculosis"10,14.

Las placas para el estudio MODS están constituidas por 24 pozos distribuidos en 4 filas (ABCD) y 6 columnas (1-6), las filas A y B no contienen antibióticos, la fila C contiene isoniacida y la fila D contiene rifampicina. Los 4 pozos de la columna 3 se reservan para el control negativo, contienen cepas de M. tuberculosis sensible a los antibióticos y la columna 6 contiene cepas MDR15 (figura 2).

Todas las muestras de esputo son digeridas y decontaminadas de otros microorganismos mediante el método Standard N-acetil-L-cisteína-NaOH-citrato de sodio16. Para la preparación final de la placa de MODS se emplea una pipeta multicanal, se llenan cuidadosamente 4 puntas con 100 μl del medio 7H9-OADC más la solución de trabajo de antibióticos, se añaden 100 μl a los pozos de la columna 1 y se repite el mismo procedimiento hasta que todas las columnas contengan 100 μl del medio 7H9-OADC o la solución de trabajo de antibióticos. Se dispensan 900 μl de la suspensión final de la muestra a cada uno de los 4 pozos de las 6 columnas en la placa de 24 pozos, con excepción de la columna 3.

Se dispensan 900 μl el medio 7H9-OADC-PAN-TA sin muestra en los 4 pozos de la columna 3 de cada placa, para realizar el control negativo17. Cerrar la placa, colocarla en una bolsa tipo ziplock e incubar a 37°C.

 

LECTURA DE LAS PLACAS

Los resultados para la mayoría de las muestras procesadas por MODS son claramente positivas (muchas colonias) o claramente negativas (no hay crecimiento). La dificultad se presenta cuando el crecimiento de las colonias es mínimo, o si se presenta contaminación5.

Un resultado positivo es definido como el crecimiento de dos o más unidades formadoras de colonia (>2 UFC) en cada uno de los pozos sin droga (figura 3). Un resultado negativo es definido como la ausencia de crecimiento de unidades formadoras de colonias para el día 21 de lectura13.

Las placas se retiran de la incubadora y se observan en el microscopio de luz invertida con las bolsas selladas, las cuales no son abiertas. Se inicia examinando los pozos sin antibióticos (A y B) con el objetivo 10X en el día 5 de incubación. En sus inicios (días 5-9) el crecimiento de M. tuberculosis parece como pequeñas curvas, comas o espirales (figura 4).

La formación de las colonias por lo general progresa a la formación de cordones y luego a un crecimiento irregular más enmarañado5,18. Para las lecturas subsecuentes se utiliza el objetivo 4X a fin de examinar todo el contenido de cada pozo. Si crecen dos o más unidades formadoras de colonias (> 2 UFC) en cada unos de los pozos sin antibióticos, el resultado es determinado como cultivo positivo. Si los resultados son negativos en el día 5, se debe continuar con la lectura diaria de los pozos sin antibióticos (o interdiario de acuerdo con la carga de trabajo del laboratorio) hasta que 2 UFC sean observados en cada pozo5,13. Cuando se observa un resultado positivo, se procede a realizar la lectura hasta el día 15, se debe continuar la lectura hasta el día 18 y luego el día 21; si para ese día el resultado continúa siendo negativo, el resultado final será determinado como cultivo negativo. Si solo se reporta crecimiento de 1 UFC en algún pozo sin droga, o en ambos, el resultado será "indeterminado"

No se debería leer los pozos con droga si la lectura en los pozos sin droga es negativa o indeterminada. Si los pozos se contaminaran con bacterias u hongos, se debe re-decontaminar y reprocesar las alícuotas que se guardaron o pedir una nueva muestra, si la contaminación está presente los resultados no pueden ser interpretados13.

Los pozos que contengan antibióticos sólo deben examinarse cuando los pozos sin droga son positivos. Se define la resistencia como el crecimiento bacteriano de ≥ 2 UFC en los pozos con drogas el mismo día en que ambos pozos sin drogas son positivos. En los raros casos en que se presente el crecimiento de 1 UFC el resultado es indeterminado. Se define la sensibilidad al antibiótico como la ausencia de UFC. Si el crecimiento ≥ 2 UFC ocurre en uno solo de los pozos con antibióticos, ya sea el que contiene isoniacida o el ocurre en uno solo de los pozos con antibióticos, ya sea el que contiene isoniacida o el que contiene rifampicina, se define la monoresistencia para determinado fármaco. Si el crecimiento ≥ 2 UFC se produce en ambos pozos con drogas, se define como MDR5,10,13.

Controles internos

El uso de controles internos negativos (en cada placa con las muestras) y controles positivos (que se realizan cada día que se procesan las muestras) son esenciales para garantizar los resultados válidos de MODS. Los pozos de los controles internos son leídos e interpretados de la misma manera que los pozos con muestra. Para el control negativo, se espera que no exista crecimiento en los 4 pozos de la columna 3 (3A, 3B, 3C y 3D), si alguna colonia de micobacteria es observada en cualquiera de estos pozos, se ha producido contaminación cruzada y las placas deben ser desechadas. Los controles positivos se realizan en una placa aparte cada día que se procesan las muestras, 4 pozos no contienen drogas (2 corresponden a la cepa sensible y 2 a la cepa MDR), deben tener un crecimiento de micobacterias ≥ 2 UFC; el control sensible no debe crecer en ninguno de los pozos que contengan antibióticos y la cepa control resistente debe crecer en los pozos que contienen antibióticos. Si los controles positivos no funcionan como se espera, los resultados de susceptibilidad para la muestras procesadas el mismo día no son válidos (resultado indeterminado), se deben descartar todas las placas y reprocesar las muestras de las alícuotas guardadas o procesar nuevas muestras de esputo utilizando un nuevo stock de antibióticos y nuevas soluciones de trabajo.

Eliminación de las placas

Se deben mantener todas las placas en sus respectivas bolsas ziplock, colocarlas en bolsas de autoclave y sellar la bolsa; esterilizar en autoclave a 121 - 124°C durante 45-60 minutos y descartar las bolsas de autoclave ya esterilizadas en los lugares designados para este propósito. Como se ha mencionado la mayor preocupación se relaciona con la bioseguridad; los medios líquidos representan un mayor riesgo en relación a la posibilidad de sufrir derrames y suspenderse en forma de aerosoles, de cualquier manera, la inoculación de la muestra se realiza una sola vez y después se sella en una bolsa ziplock, la cual no vuelve a abrirse10.

 

CONCLUSIONES

Cabe destacar que el MODS ha sido reconocido como un método válido para el diagnóstico de TB por la Organización Mundial de la Salud14. De manera que se ha planteado una potencial herramienta en la lucha contra la TB en el mundo y en nuestro medio, donde ya se realizaron algunas pruebas en laboratorios de la Escuela Técnica de Salud Boliviano Japonés de Cooperación Andina de la Ciudad de Cochabamba. El empleo generalizado de este método aún se encuentra en proceso de validación en nuestro medio.

Contribución de autores: todos los autores participaron de igual manera en la elaboración, confección y revisión del manuscrito.

 

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