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1 Introducción
La familia de las orquídeas es el grupo más diverso y extenso de plantas con flor que existe sobre el planeta. La diversidad en tamaño, forma y colores, especialmente de sus flores, las convierte en un atractivo como plantas ornamentales, aunque también se han utilizado como comestibles, aromatizantes y medicinales. El gran valor comercial que poseen ciertas especies de orquídeas ha provocado el saqueo indiscriminado de individuos silvestres, y la falta de conocimientos en el cultivo de estas plantas provoca grandes pérdidas de material valioso, con la consecuente erosión genética (Alvarado, 2000).
La familia Orchidaceae con 1.500 especies registradas hasta el año 2003, es el grupo de plantas más diverso del país y representa el 10% de la flora boliviana. Los bosques montanos húmedos de la región de Los Yungas albergan 66% de todas las especies conocidas y por tanto se convierte en la zona más rica en orquídeas (Vásquez, Ibisch, & Gerkmann, 2003).
Entre las orquídeas, Epidendrum secundum Jacp, es de amplia distribución y nativa de América. Se caracteriza por ser de habito geófita como litófita. Hierba terrestre, cespitosa, con tallos 40 - 90 cm y con hojas rígidas coriáceas. Inflorescencia en racimos terminales. Flores de diversos colores, sépalos laterales similares en largo que el sépalo dorsal, pero ligeramente más anchos; pétalos más angostos que los sépalos, labelo profundamente 3-lobulado, lóbulos laterales fimbriados, lóbulo medio 2- lobado, fimbriado (Santa Cruz et al, 2020).
Las semillas de las orquídeas son tan pequeñas que contienen poca o ninguna reserva para llevar a cabo la germinación, es decir, no presentan endospermo, por lo que en condiciones naturales se asocian con hongos que digieren la materia orgánica y transfieren los carbohidratos al embrión de la orquídea, permitiendo que se desarrolle la planta. Además, requieren polinizadores específicos para que se efectúe la fecundación. La sumatoria de estos factores hace que el número de semillas que germinan en condiciones naturales sea muy bajo en comparación con el número de semillas producido (Abdelnour & Muñoz, 1997).
En orquídeas se tienen dos vías de geminación en medios asimbiótico y simbióticos, ambas contribuyen en programas de reintroducción. En medios asimbióticos, se da a través de cultivo de tejidos, en medios específicos, las cuales proporcionan nutrientes para promover la germinación. Es así, que Lewis Knudson desarrollo el método para la germinación asimbiótica, que fue el primer procedimiento práctico para la propagación in vitro de cualquier planta en condiciones axénicas, demostrando así que es posible la germinación en un medio que tiene sales y azúcar (Knudson, 1991) citado en (Salazar-Mercado, 2012). Entretanto, la germinación simbiótica requiere de hongos micorrizicos principalmente con hongos basidiomicetos del grupo de Rhizoctonia (Rasmussen, 1995).
Los medios basales en orquídeas generalmente están constituidos por las sales de (Murashige y Skoog, 1962), Knudson C (1922), Vacin y Went (1949) entre otros, un agente gelificante y suplementos naturales como el agua de coco, pulpa de plátano y jugo de tomate.
Por las características de hábito de crecimiento de las orquídeas epifitas, terrestres y rupícolas sus requerimientos nutricionales son mínimos, y contrastando esto en medios de cultivo son necesarios que tengan los macroelementos (N, P, K), pudiendo contener además otros elementos como Mg, B, Zn, Fe (García y Cuevas, 2000) citado en (Rodríguez, 2013). En trabajos en cultivo in vitro, emplean fertilizantes comerciales como alternativa de minimizar costos. De los cuales, el kit de fertilizante, que es ampliamente usado en medios de cultivo son de hidroponía de la FAO, mismo que contiene macro y micronutrientes. De la misma forma, el uso de agentes alternativos al phytagel, agar como la carragenina, ya que el agar según (Mejia & Vitorelli, 1988) el costo representa el 80% del costo total en la preparación de medios de cultivo.
En ese sentido el presente trabajo tiene como objetivo describir el proceso ontogénico de Epidendrum secundum en condiciones in vitro y determinar el porcentaje de germinación de Epidendrum secundum en el medio de cultivo con sales de hidroponía con diferentes agentes gelificantes y concentraciones de agua de coco.
2 Materiales y métodos
Localización de la investigación. El presente trabajo de investigación se realizó en el laboratorio de Biotecnología en las instalaciones de la Unidad Académica Campesina Carmen Pampa (UAC-CP) de Coroico, de la provincia Nor Yungas el Departamento de La Paz, Bolivia. Geográficamente se sitúa a 16° 20’ 30” de latitud Sur y 67° 50’ 00” de longitud Oeste a una altura de 1850 m.s.n.m. y una distancia de 90 km de La Paz a la comunidad de Carmen Pampa (Alarcón, 2008).
2.1 Colecta de cápsula de Epidendrum secundum
Las cápsulas de las E. secundum fueron colectada de la zona Puerta del Viento cercanías a la Cerro Uchumachi a 16° 20’ 30” de latitud Sur y 67° 50’ 00” de longitud Oeste. Esta especie se caracteriza por ser abundante con bastantes frutos por planta.
2.2 Preparación de medios con sales de cultivo hidropónico
En base a las sales comerciales que se emplean soluciones nutritivas en cultivo hidropónico se procedió a preparar dos soluciones A (macronutrientes) y B (micronutrientes), ver tabla 1.
Tabla 1. Composición del medio basal
| Solución | Nombre | Fórmula | Solubilidad g/l |
|---|---|---|---|
| A | Nitrato de Calcio | Ca(NO3)2 | 1.220 |
| Nitrato de Potasio | KNO3 | 130 | |
| Nitrato de Magnesio | Mg(NO3)2.6H2O | 279 | |
| Fosfato monopotásico | KH2 PO4 | 230 | |
| B | Sulfato de Magnesio | MgSO4.6H2O | 710 |
| Sulfato de Potasio | K2 SO4 | 111 | |
| Sulfato de Manganeso | MnSO4 | 980 | |
| Ácido Bórico | H3 BO3 | 60 | |
| Sulfato de Cobre | CuSO4.5H2O | 310 | |
| Sulfato de Zinc | ZnSO4.7H2O | 960 | |
| Molibdato de Amonio | (NH4)6M07 O24.4H2O | 430 |
Fuente: Carrasco e Izquierdo (1996)
Para el preparado de 1 litro de medio de cultivo se añadió 5 ml de la solución A y 2 ml de la solución B. Al mismo, se adicionó agua de coco (10% y 20% dependiendo del tratamiento empleado), 20 gr de azúcar de mesa, el pH fue ajustado a 5.6 y se adicionó el agente gelificante (gelrite, agar y carragenina). Seguidamente los medios fueron autoclavados a 15 PSI a 121°C durante 15 minutos. La batería de tratamientos de los medios a emplear estaba en función a la siguiente combinación descrita en la siguiente tabla:
2.3 Siembra en medios de cultivo
Las semillas fueron desinfectadas con 0,5% de hipoclorito de sodio durante 15 min, posteriormente se enjuago 3 veces dentro de la cámara de flujo laminar. Para la siembra las semillas, estas fueron colocadas en cajas Petri con agua destilada estéril, para formar una solución y proseguir a la siembra con una jeringa en tubos de ensayo. Seguidamente, las semillas sembradas en los medios de cultivo fueron trasladas a la cámara de crecimiento a 25°C fotoperiodo de 16/8 horas luz y oscuridad.
3 Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño aplicado en la presente investigación fue diseño completamente al azar. El factor de estudio corresponde, el tipo de agente gelificante (carragenina, agar y gelrite) y la adición de agua de coco (10 y 20%) en los medios de cultivo. Resultado de la combinación de ambos factores de estudio resulta 6 tratamientos cada uno de ellos con 15 repeticiones (Calzada-Benza, 1970).
Para el análisis estadístico se realizó el análisis de varianza para determinar si existe o no una diferencia significativa entre los tratamientos en relación a las variables de respuesta (porcentaje de fases de desarrollo del proceso de germinación y porcentaje de germinación) a un nivel de 5% de error experimental. De encontrarse diferencias significativas se aplicó la prueba Duncan a un nivel de 5% de error experimental. El procedimiento estadístico se realizó en el programa estadístico INFOESTAT-L v.2008.
3.1 Variables de respuesta
Se evaluó porcentaje de individuos en 4 fases de desarrollo para la germinación en orquídeas corresponden a: Fase 0: Son semillas que no son viables, Fase I: Son semillas con embrión viables. Fase II: Son semillas que empiezan a aumentar su tamaño en forma de redondo que está apunto de germinar. Fase III: Semillas germinadas con la aparición de brote apical y protocormos. Fase IV: plántula con brote apical y protocormos desarrollados.
Porcentaje de germinación para este cálculo en base a la siguiente formula, donde se consideró como semillas germinadas desde la fase II, III y IV.
Porcentaje de mortalidad se consideró en base a la siguiente formula el número de semillas muertas sobre el total de semillas sembradas:
Porcentaje de semillas viables Las semillas fueron sumergidas en tetrazolium al 0.5% por 24 horas y posteriormente se evaluó las semillas que tiñeron de color rosado el embrión a las cuales se les considero semillas viables y las que no tiñeron como semillas inviables y se calculó del porcentaje de viabilidad con la siguiente fórmula.
Las evaluaciones se realizaron con la ayuda de un estereoscopio cada 3 semanas durante 105 días.
4 Resultados y discusión
4.1 Viabilidad
La viabilidad de las semillas de E. secundum fue de 93,03±4,97%, el cual se expresó debido a que estos mostraron una tinción rojo intensa (ver figura 5). Las semillas viables se tiñen, debido a la reducción del tetrazolium por la actividad respiratoria de las células y en una especie del género Epidendrum se presentó 85,4% (Salazar & Gélvez, 2015). En cambio, en otra especie Epidendrum dalstromii con la prueba de tinción de tetrazoliium registró un 50,80% de viabilidad de las semillas (Quishpe, 2018). No obstante, en Epidendrum dalstrom presentaron un 93% de viabilidad (Salazar & Gélvez, 2015). La diferencia de resultados probablemente se deba a la expresión de cada especie, esta afirmación es respaldada por los anteriores autores que señalan, que en 10 especies de orquídeas la viabilidad es diferente, viaria desde 69,2% en Elleanthus sp a 93,8% en Maxillaria sp.
4.2 Descripción de fases de la germinación
A continuación, se detalla las fases por la cual se pasaron las semillas de E. secundum durante la germinación en condiciones in vitro:
4.3 Porcentaje de germinación
En la tabla 3 se denota que, al cabo de 21, 42, 63, 84 días de evaluación no presentaron diferencias significativas como efecto del agente gelificaste en el medio de cultivo, sin embargo, hay diferencias significativas al cabo de 105 días. Entre tipo de agentes gelificantes, la cartagenina y el gelrite fueron estadísticamente similares en la germinación, de 82,4% y 85,8% respectivamente. Con relación a la aplicación de agua de coco presentaron diferencias significativas entre las concentraciones a lo largo de la evaluación. La adición de 20% de agua de coco favorece en el porcentaje de germinación de un 86.4%. Finalmente, no se presentaron diferencias entre la interacción de factores, que indica son independientes.
Tabla 3 Efecto de diferentes tipos de agentes gelificantes y dos niveles de concentración de agua de coco en el porcentaje de germinación Epidendrum secundum cada 21 días de evaluación.
| Fuente de variación | Tiempo de evaluación | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 21 días | 42 días | 63 días | 84 días | 105 días | |
| Agente gelificante (FA) | |||||
| Agar | 38,1 a | 55,3 a | 67,3 a | 75,0 a | 82,4 ab |
| Gelrite | 31,9 a | 57,5 a | 69,7 a | 78,7 a | 85,8 a |
| Carragenina | 29,3 a | 50,8 a | 61,4 a | 70,3 a | 78,6 b |
| F cal. | 2,83 NS | 1,73 NS | 2,65 NS | 3,60 NS | 4,33* |
| Pr > F | 0,0645 | 0,1833 | 0,0763 | 0,0317 | 0,0162 |
| Concentración de agua de coco (FB) | |||||
| AC2 (20%) | 36,6 a | 59,6 a | 71,2 a | 79,5 a | 86,4 a |
| AC1 (10%) | 29,6 b | 49,4 b | 61,1 b | 69,8 b | 78,1 b |
| F cal. | 4,51* | 8,02** | 11,44** | 14,40** | 17,45** |
| Pr > F | 0,0366 | 0,0058 | 0,0011 | 0,0003 | <0,0001 |
| FA*FB | |||||
| F cal. | 1,53 NS | 0,45 NS | 0,31 NS | 0,23 NS | 0,27 NS |
| Pr > F | 0,2222 | 0,6385 | 0,7322 | 0,7948 | 0,7607 |
| (41,1%) | (29,8%) | ||||
| Coef. Var. | 8,8% | 8,0% | 21,5% | 16,1% | 11,4% |
Dónde: a,b Prueba Duncan al 5%. ** Altamente significativo (<1%). * Significativo (1%). NS no significativo.
Los agentes gelificantes son empleados como medio de soporte, y tienen algunos componentes orgánicos que pueden estimular o inhibir el crecimiento de los brotes en cultivo in vitro, y se parte de los componentes del medio de cultivo y proporciona sostén al explante McLachan (1985) citado por (Babbar & Jain, 1998). De los resultados encontrados en la germinación de E. secundum, la carragenina no favoreció en la germinación, esto probablemente se deba, a que es un producto empleado en la industria alimentaria, es un gel de color opaco, con mucha celulosa y fibra, bajo grado de pureza (semi refinada), que tiene alto grado de impureza en relación a gelrite y el agar (Porto, 2003), En un estudio realizado en una especie cactácea con agar, gelrite reporta 98% y 97,7% de germinación (Lopez & Lopez, 2016). Con ello se constata que estos dos agentes gelificantes no influyen de forma negativa en la germinación en condiciones in vitro.
Con relación a los costos, de cada agente gelificante para 1 L de medio de cultivo con agar se invierte Bs. 9,6; gelrite Bs. 7 y garragenina Bs. 1,6, de las cuales, la carragenina es la más económica. Al respecto, (Mamani, 2009) menciona, que el agar o phytagel puede representar hasta 70% del costo de las plantas y desde un punto de vista de ganancias la carragenina podría ser interesante para reducir los costos producción.
Por otra parte, en cuanto al porcentaje de germinación en E. secundun fue de 85,8%, y es similar al trabajo realizado por (Sarbi & Guzman, 2007) con 10% de agua de coco fue al 100% y con la adición de pulpa de plátano fue 86,37% ambos en el medio MS. En otra especie de Epidendrum barbaricum indican que el porcentaje de geminación es de 93% en el medio MS (Salazar et al, 2019).
El líquido de la semilla de coco se ha usado en varios especies establecidas in vitro, incluyendo las orquídeas, ya que contiene vitaminas, enzimas, azúcares, fuentes nitrogenadas, reguladores de crecimiento y una fracción de sales inorgánicas (Hicks, 2007) citado en (Bertolini et al, 2015). Al respecto se tienen reportados en germinación de orquídeas con el endospermo líquido de coco.
Según Bertolini et al, (2013) menciona, que con la aplicación de 260 ml/1000 ml de agua de coco en Rhynchostele bictoniensis mejora la germinación en un 97% que sin este aditamento la germinación reporto 83%. En el presente estudio con E. secundun, el mayor porcentaje de germinación fue con 20% agua de coco que con 10%, esto probablemente se deba a una duplicidad de este aditamento sea más favorable, ya demás puede deberse a que las sales medio de hidroponía, su calidad es baja en relación a los medios comerciales que emplean en cultivo de tejidos vegetales, como Murashige y Skoog, Knudson C entre otros.
En cuanto a la mortalidad de los protocormos en el medio con carragenina, agar y carragenina fue de 1,8%; 0,8% y 0% respectivamente.
5 Conclusiones
Epidendrum secundum presentó un 85,8% de geminación en el medio gelrite al cabo de 105 días de evaluación en el medio de cultivo con sales de hidroponía con la adición de 20% de agua de coco. No obstante, con la adición de carragenina los protocormos germinados tienden a morirse en un 1,8%.
