Alternativamente, después de su separación mediante la técnica 2D PAGE, la proteína de interés es aislada y físicamente extraida para luego determinar algunos de sus atributos experimentalmente utilizando el análisis llamado peptide mass fingerprint (PMF). Este método consiste en la fragmentación de la proteína en pedazos componentes o péptidos y la determinación de sus correspondientes masas moleculares. La fragmentación de la proteína se logra generalmente por digestión de la proteína con una enzima, por ejemplo la tripsina, o por algún otro medio químico. La obtención de las masas de los péptidos se basa en el resultado de un proceso de espectrometría de masas sobre la muestra fragmentada de la proteína [3].

La espectrometría de masas es una técnica analítica que determina de forma precisa el peso de una molécula particular o el peso de las moléculas que componen una mezcla. En unos cuantos segundos, un espectrómetro de masas es capaz de ionizar una mezcla de péptidos y medir las relaciones masa/carga de cada uno de ellos. Los espectrómetros de masas que se utilizan para el análisis de péptidos tienen dos componentes principales: una fuente de iones que introduce la muestra al espectrómetro y un aparato que mide la masa de los iones introducidos. Existen dos métodos de ionización que se utilizan particularmente para la identificación. El primero es el Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Espectrometry (MALDI-TOF MS) [10]. Éste genera iones a partir de una muestra sólida y mide su masa en un "tubo de vuelo". El segundo es Electrospray Ionisation Mass Espectrometry (ESI MS) [10], el cual genera iones a partir de una muestra líquida y mide su masa en un aparato que puede también ser un detector de tiempo de vuelo. Si bien ambos métodos producen resultados similares, aparentemente MALDI-TOF MS está emergiendo como la mejor alternativa para el análisis de proteínas [3]. En el MALDI-TOF MS la muestra es depositada sobre una sonda por co-cristalización con una matriz (ácido aromático que es fácilmente soluble y absorbe la luz del láser utilizado para la ionización) y luego es introducida a la cámara de ionización que se encuentra al vacío. La ionización es inducida por pulsos cortos de un láser enfocado en la muestra. En las configuraciones más típicas, las fuentes de iones de MALDI están acopladas a un analizador de masas que mide el tiempo de vuelo. La relación masa a carga (m/z) de iones formados por este método de ionización son luego medidos en el analizador de masas. Conociendo la carga de los iones medidos, es fácil deducir su masa. Con este método, es posible lograr exactitudes de 0.01% al analizar polipéptidos con masas de hasta 30-40 kDa [10]. La espectrometría de masas da como resultado un espectro donde el eje horizontal corresponde a la relación masa/carga de la partícula

²Instituto de Investigación en Informática Aplicada, Universidad Católica Boliviana. medida y el eje vertical corresponde al número de partículas medidas que tengan esa relación particular.

A pesar que la interpretación de los espectros generados por esta técnica puede ser complicada, estos datos proveen información importante para: primero, determinar si éstos corresponden a una proteína conocida y/o modificada; y segundo, para determinar si más de una proteína es co-migradora en una banda de un spot en un gel. Esta información junto con el uso de recursos como las bases de datos de secuencias de proteínas forman parte del corazón de la identificación de proteínas basadas en MS y es lograda mediante el uso de la informática.

El procedimiento de identificación consiste en comparar el espectro experimental con espectros teóricos. Esto se logra calculando todas las posibles masas que pueden ser generadas fragmentando todas las secuencias en una cierta proteína contenida en una Base de Datos. Los resultados son desplegados como una lista de proteínas candidatas ordenada de acuerdo a un criterio de bondad (Figura 5). Esta técnica, sin embargo, presenta algunas falencias: el programa no puede determinar a ciencia cierta si una identificación es correcta; además, para lograr una identificación, es necesario que la proteína buscada se encuentre en la base de datos y es deseable, por lo tanto, contar con la mayor cantidad de registros en la base. Además, existe también la posibilidad que se encuentren masas de péptidos similares en diferentes elementos de una base de datos y a medida que se incrementan los registros de esta base, también se incrementan las posibilidades de tener un falso positivo.

El I.I.I.A., en colaboración con el S.I.B.³ de Ginebra y el H.U.G.⁴, está desarrollando el proyecto Biograph. Este consiste en el desarrollo de una herramienta de software de apoyo a la técnica PMF para el análisis gráfico de datos de espectrometría de masas. Esta herramienta posibilita al investigador comparar y anotar datos experimentales con datos teóricos almacenados en bases de datos mundiales y a las cuales se accede mediante la red Interne.

3.3.Idenficación de proteínas utilizando el Método de Novo

Un segundo método que utiliza a la espectrometría de masas para la identificación de proteínas es el método de Novo. Este método, a diferencia del anterior, no necesita una base de datos para determinar la secuencia de aminoácidos que conforman a un péptido y se realiza en dos etapas bien definidas. En una primera etapa (primer MS) se obtienen las masas de los pétidos ya fragmentados previamente; en una seguna etapa (segundo MS) se fragmenta por segunda vez un péptido seleccionado y se obtiene su espectro pemitiendo un análisis a nivel de aminoácidos. Algunos espectrómetros de masa pueden seleccionar y fragmentar de forma automática algunos péptidos y medir las relaciones masa/carga de cada uno de los fragmentos. Esta segunda fragmentación puede lograrse mediante dos técnicas: por Descomposición Post-Fuente (PSD Post Source Decay) ó, por Disociación Inducida por Colisión (CID Collision Induced Dissociation).

En la primera técnica, la muestra es bombardeada con un haz de luz láser de más alto poder que lo normal para dar mayor energía e ionizar a la muestra, la cuál se fragmenta al momento de ingresar al

³Swiss Institute of Bioinformatics, Ginebra -Suiza.

tubo del espectrómetro. En la segunda técnica, la muestra también es bombardeada con un haz de luz láser, pero la fragmentación se la realiza en el interior del tubo de vuelo mediante la colisión de la muestra con un gas inerte. Este método es llamado MS/MS porque consiste en la aplicación doble del proceso de espectrometría de masas sobre una muestra y consiste en elegir electrónicamente en el espectrómetro uno de los péptidos que sea de interés. Este péptido lleva el nombre de ión padre. Posteriormente el ión padre es reabsorbido en el espectrómetro donde se realiza un CID o PSD para fragmentarlo nuevamente y obtener pedazos que, a su vez, son medidos por el espectrómetro de masas. El resultado del proceso de doble de fragmentación (MS/MS) es también un espectro donde el eje de absisas corresponde a las masas de los fragmentos medidos y el eje de ordenadas corresponde al número de iones medidos para la masa correspondiente. El problema de secuenciamiento consiste en derivar la secuencia de aminoácidos que conforman al péptido analizado dado sus espectros MS/MS. De esta manera, es posible deducir la cadena de aminoácidos que componen al ión padre. Para un proceso de fragmentación ideal y para un espectrómetro de masas ideal, la secuencia de un péptido puede ser determinada simplemente comparando la diferencia de masas de iones consecutivos de un espectro con las masas teóricas de los aminoácidos (Figura 6). Esta situación ideal ocurriría si el proceso de fragmentación pudiese ser controlado de tal modo que cada péptido estuviese cortado entre dos aminoácidos consecutivos y una única carga fuese retenida solamente en el pedazo con terminal-N. Sin embargo, en la práctica, el proceso de fragmentación en los espectrómetros de masas está lejos de ser ideal. Como resultado, el secuenciamiento de péptidos continua siendo un problema abierto [11].

La ventaja de este método, a diferencia de los mencionados previamente, radica en que su forma operativa no depende de una base de datos y la determinación de secuencias de aminoácidos de las muestras analizadas puede lograrse sin tener datos históricos del péptido o proteína en cuestión.

El I.I.I.A., en colaboración con la Universidad de Ginebra, el H.U.G. y la empresa Geneva Bioinformatics, está investigando nuevos algoritmos para el secuenciamiento automático de los espectros generados por MS/MS. Resultados preliminares muestran que, pese a la complejidad del problema, es posible automatizar este proceso [7].

La investigación en genética molecular está revolucionando a pasos gigantescos la práctica médica y la investigación biológica. La práctica médica se verá radicalmente alterada cuando se combine la información genética con las nuevas tecnologías clínicas basadas en el diagnóstico del ADN. Se vislumbra el nacimiento de la "Medicina Molecular" que se caracterizará, no sólo por el tratamiento de los síntomas de las enfermedades, sino por la búsqueda de las causas últimas de éstas. Se desarrollarán nuevas técnicas de diagnóstico, más rápidas y más fiables que facilitarán la prevención de las enfermedades. Se desarrollarán fármacos más específicos y efectivos e incluso se practicará la terapia génetica.

Las herramientas informáticas son cruciales para almacenar e interpretar datos de un modo eficiente y

⁴ Hospital Universitario de Ginebra -Suiza.

robusto. Grandes bases de datos de información biológica son ya accesibles a través de redes de comunicación, en especial, a través de Internet. La Bioinformática está brindando herramientas imprescindibles para llegar a entender el flujo de información de los genes y sus estructuras moleculares, su función bioquímica, su conducta biológica y, finalmente, su influencia en las enfermedades y en la salud. La Biología Molecular está experimentando un gran desarrollo que queda reflejado tanto en el enorme volumen de datos generado, como en la complejidad de las relaciones entre éstos. Los investigadores ya han identificado algunos genes individuales asociados a varias enfermedades; por ejemplo, la fibrosis cística, la distrofia muscular, la neurofibromatosis y el retinoblastoma [5]. A medida que progresen la genómica y la proteómica, se descubrirán los mecanismos que causan enfermedades afectadas por varios genes, por factores ambientales asociados y la forma en que varían sus expresiones (las proteínas).

La predisposición genética está implicada en el desarrollo de enfermedades cardíacas, diabetes y varios tipos de cáncer. La identificación de estos genes y las proteínas que estos expresan darán lugar a terapias más eficientes y medidas de prevención.

El Proyecto Genoma Humano tiene como objetivo descubrir y localizar más de 80.000 genes del genoma y poner toda esta información a disposición de la comunidad de investigadores en Biomedicina. El estudio del genoma también contribuye al entendimiento del desarrollo embrionario y el envejecimiento humano. La investigación genética encontrará múltiples aplicaciones en las industrias farmaceúticas y alimenticias. También, en Salud Pública se observan esfuerzos encaminados a la diseminación de información genética, la formación de los profesionales de la Salud y el desarrollo de políticas que incorporen el conocimiento genético en la práctica epidemiológica.

Entre los impactos potenciales de las tecnologías de adquisición y gestión de la información genética, aplicadas en la investigación biomédica, se pueden citar: medicina preventiva, medicamentos personalizados por genotipo, procesamiento paralelo masivo de información genética, diagnóstico en las postas médicas, sistemas de estudio epidemiológico-genéticos, etc.

El I.I.I.A., a través de los convenios de colaboración con el S.I.B. y el H.U.G., está investigando tecnologías de punta y desarrollando algoritmos que apoyan directamente al progreso de la bioinformática, la biología molecular y la medicina.

[1] H. Curtis "Biología" 4ta. Edición Editorial Medica Panamericana Buenos Aires 1983.

[2] J. Darnell, H. Lodish, D. Baltimore "Mollecular Cell Biology" 2^nd. Edition Scientific American Books -Freeman & Co. New York 1990.

[3] Wilkins, Williams, Appel. "Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics". Springer -Verlag. Berlin 1997.

[4] K. Howard. "The Bioinformatics Gold Rush", Scientific American, Vol 283, No 1. Julio 2000.

[5] C. Ezzell. "Beyond the Human Genome", Scientific American, Vol 283, No 1 Julio 2000.

[6] Expasy (http://www.expasy.ch)

[7] Identificación de Proteínas a Partir de Geles de Electroforesis Bidimensional. Technical Report: Instituto de Investigación en Informática Aplicada. Universidad Católica Boliviana. 2000.

[8] Vargas J. R. Two-Dimensional Gel Electrophoresis Computer Analysis System: From Image Acquisition to Protein Identification. Ph.D. Thesis, Geneva University, 1996.

[9] Melanie-II software package reference.

[10] S.Patterson, R. Aebersold. Mass Spectrometric Approaches for the Identification of Gel-Separated Proteins. Electrophoresis 16, 1995.

[11] V. Dancik, T. Addona, K. Clauser, J. Vath, Pavel Pevzner. De Novo Peptide Sequencing via Tandem Mass Epectrometry -Journal of Computational Biology, Vol 6, No. 3/4, 1999.

[12] The Human Genome Project "To Know Ourselfs" U.S. Department of Energy and The Human Genome Project. 1996.

[13] Appel R.D., Sanchez J-C., Bairoch A., Golaz O., Miu M., Vargas R., Hochstrasser D. SWISS2DPAGE: A Database of Two-dimensional Gel Electrophoresis Images. Electrophoresis 14, 1232-1238, 1993.

[14] Appel R.D., Bairoch A., Hochstrasser D.F. A New Generation of Information Retrieval Tools for Biologists: The Example of the ExPASy WWW Server. Trends Biochem. Sci. 19:258-260(1994).

[15] Hofmann K., Bucher P., Falquet L., Bairoch A. The PROSITE database, its status in 1999, Nucleic Acids Res. 27:215-219(1999).

Figura 1. (A) Las cuatro bases nitrogenadas de ADN. La adenina (A) se asocia con la timina (T) mientras que la citosina (C) se asocia con la guanina (G). Las cadenas se mantienen unidas por puentes de hidrógeno. La secuencia de bases en un gen contiene la información necesaria para la síntesis de proteínas. (B) Replicación: cada hilo simple se convierte en una plantilla para la síntesis de un nuevo hilo complementario y cada molécula hija forma una copia exacta de la molécula padre.

Figura 2. Cuando los genes son expresados, la información genética (secuencia base) del ADN es copiada a una molécula mensajera mARN. Luego, las moléculas de mARN abandonan el núcleo de la célula y entran al citoplasma donde tripletas de bases (codones) especifican qué aminoácidos particulares se deben enlazar para fabricar una proteína indiviudal. Este proceso se lleva a cabo en los ribosomas que leen el código genético del mARN y, tomando los aminoácidos de los tARNs, los adjuntan a la proteína que se está formando.

Figura 3. Proceso 2D-PAGE. En esta figura se observa un gel con el mapa proteico obtenido mediante esta técnica. Las proteínas en el gel han sido separadas en dos dimensiones: punto isoeléctrico y peso molecular. Luego se realizó un proceso de coloración para poder resaltar el mapa proteico resultante.

Figura 4. Esta base de datos contiene mapas proteicos que muestran las posiciones de las proteínas, así como también sus posiciones teóricas. Además, puede ser accedida remotamente mediante Internet a través del servidor ExPASy. Luego de realizar la consulta, dado un número de acceso a la base de datos, SWISS-2DPAGE muestra el nombre de la proteína, la posición de la proteína en un mapa 2D PAGE, su descripción, una lista de mapas en los que se ha identificado la proteína y otra información específica.

Figura 5. Peptide Mass Fingerprint, proceso de identificación de proteínas mediante la comparación de datos de espectrometría de masas experimentales con datos teóricos contenidos en bases de datos.

Figura 6. Determinación de la secuencia de aminoácidos via el proceso MS-MS.

Figura 1 Figura 2

Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6.