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Revista Boliviana de Física
On-line version ISSN 1562-3823
Revista Boliviana de Física vol.24 no.24 La Paz June 2014
ARTÍCULOS
APLICACIÓN DE FLUORESCENCIA DE RAYOS-X POR REFLEXIÓN TOTAL EN LA DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ZINC EN CABELLO DE NIÑOS PARA LA ESTIMACIÓN DE NIVELES NUTRICIONALES
DETERMINATION OF ZINC CONCENTRATIONS IN CHILDREN'S HAIR
TO ESTIMATE NUTRITION LEVELS USING TOTAL REFLECTION X-RAY FLUORESCENCE
C. A. Tellería Narváez1", S. Fernández Alcázar, F. G. Barrientos Zamora, & A. O. Muñoz Gosálvez
Centro de Investigaciones y Aplicaciones Nucleares (CIAN-Viacha)
Viacha, Bolivia
L. E. Romero Bolaños
Instituto Boliviano de Ciencia y Tecnología Nuclear
Av. 6 de Agosto 2905. La Paz, Bolivia
G. M. Ramírez Ávila
Instituto de Investigaciones Físicas, Carrera de Física
Universidad Mayor de San Andrés
c. 27 Cota-Cota, Campus Universitario, Casilla de Correos 8635
La Paz - Bolivia
(Recibido 5 de Septiembre de 2013;
aceptado 6 de Marzo de 2014)
Resumen
Se realizaron mediciones de las concentraciones de zinc en el cabello de niños de regiones altiplánicas (en el rango de edades de 8 a 13 años), mediante la técnica de fluorescencia de rayos X por reflexión total. Estas mediciones permiten una primera evaluación de los niveles nutricionales en niños que se combina con la determinación del índice de masa corporal. Esta evaluación se caracteriza por su simplicidad y no-invasividad. Aunque los resultados nos permiten hacer una buena clasificación de individuos nutricionalmente normales de los que no lo son, también se observa la gran sensibilidad de los resultados con la edad. Este trabajo es complementario a otras pruebas biológicas y médicas.
Descriptores: Haces de rayos-x - Fluorescencia de rayos-x
Abstract
Using the X-ray fluorescence by total reflection technique, we carried out measurements of zinc concentrations in the hair of children living in the Bolivian high plateau regions (within the age range from 8 to 13 years old). The results allow us to make a first assessment of nutritional levels in children; the latter combined with the determination of the body mass index, results in a measure characterized by its simplicity and non-invasiveness. This work is complementary to other biological and medical tests.
Subject headings: X-ray beams - X-ray fluorescence.
1 Introducción
La fluorescencia de rayos-X (FRX) se basa en la irradiación de muestras por rayos-X (Rx) primarios. Los átomos individuales al ser excitados por esta radiación emiten Rx secundarios, propios de cada elemento, que pueden ser cualificados y cuantificados en un espectro. Este método es rápido y puede ser aplicado a una gran variedad de matrices; por ejemplo, sólidas, analizadas con poca o ninguna preparación. Excluyendo los elementos livianos, los elementos comprendidos entre los números atómicos 14 y 42 pueden ser detectados en sus emisiones Ka empleando un cátodo de molibdeno y para Z > 42, en sus líneas La, esto depende mucho del blanco del tubo de Rx con el que se esté trabajando. El método es sensible a trabajar en niveles de detección que se encuentran en el orden de magnitud de 
g-l−1.
La FRX se ha convertido en un poderoso método para el análisis espectrométrico; sin embargo, esta técnica tiene limitaciones al momento de realizar el análisis de trazas de elementos en una muestra. Debido a esto, nuevas técnicas de espectrometría atómica óptica se han desarrollado, superando a la técnica convencional de FRX en muchos aspectos. Una de estas técnicas consiste en usar reflexión total para la excitación por FRX. Esta idea ingeniosa fue descubierta por [11923Compton], quien encontró que la reflectividad de un blanco liso se incrementa significativamente para valores por debajo del ángulo crítico ( 
0.1°). Posteriormente, [21971Yoneda & Horiuchi] propusieron el análisis de pequeñas cantidades de muestra sobre portamuestras lisos de reflectancia total. Esta técnica fue después desarro-llada y se la denominó fluorescencia de Rx por reflexión total (FRXT) que es la técnica empleada en el trabajo y que es descrita en detalle por [31996Klockenkamper]. El artículo está estructurado como sigue: en 
2 se da una explicación de la FRXT y se detalla el método experimental empleado, lo que incluye la obtención de cabello, la calibración del equipo y la preparación de las muestras; en 3 se dan los detalles del equipo empleado y se dan a conocer las lecturas de las muestras que se utilizan para evaluar los resultados que se exponen en 4. Finalmente, en 5 se dan las conclusiones y perspectivas de este estudio.
2 Método experimental
La FRXT es una variación de la técnica de dispersión de energía de FRX con una diferencia significativa consistente en el hecho que, en contraste con el método convencional (FRX) donde el haz primario impacta en la muestra con un ángulo de 40° (Figura 1(a)), en la FRXT se utilizan haces rasantes por debajo de 0.1° (Figura 1(b)). Debido a su confi-guración única, la principal ventaja de la FRXT sobre la FRX convencional es la reducción en el ruido de fondo mediante la eliminación de la dispersión en la muestra; lo que resulta en una mayor sensibilidad de la medición elemental.
Figure 1: (Color online) Arreglo experimental para (a) FRX convencional y (b) FRXT.
Para la obtención de reflexión total en el portamuestras (reflector de cuarzo), el haz primario debe incidir en el reflector con ángulos rasantes. Para fotones de Rx de 60 keV, el ángulo de incidencia debe estar alrededor de 0.015°, mientras que la divergencia del haz debe darse incluso en ángulos de menor valor. Este ángulo se denomina crítico 
crit y se lo puede calcular usando la siguiente relación mencionada por [31996Klockenkamper]:
donde E representa la energía en keV de los Rx incidentes, que en nuestro sistema se originan en un tubo con blanco de Mo; mientras que las otras cantidades están referidas al portamuestras: 
la densidad del material expresada en g/cm3, Z el número atómico y A el peso atómico. En nuestro caso, el portamuestras es de cuarzo (SiO2) por lo que se tiene: = 2.65 g/cm3, Z=30 y A=60.09 g/mol tal como se cita en [51999Nascimento Filho et al.]. Esta aproximación es válida para fotones de energía por encima de los límites de absorción del material.
2.1 Obtención de cabello
Se colectaron cabellos de niños de ambos sexos con edades comprendidas entre los 8 y 13 años, en la localidad de Viacha (Aprox. 3876 msnm) ubicada en la región altiplánica del departamento de La Paz. El muestreo de cabello comprendió dos escuelas, una situada en la parte urbana (96 muestras) y la otra en la Comunidad Collagua (12 muestras) correspondiente al área rural de Viacha. De manera paralela al proceso de recolección de cabello se tomaron los datos antropométricos de cada niño: masa corporal y estatura, así como también se registraron la edad y el grado escolar.
2.2 Calibración del equipo
Para la calibración del equipo de FRX se obtuvo inicialmente la curva característica (tasa de contaje en cuentas/seg vs. intensidad de corriente en mA), en la que se efectuó el test de linealidad consistente en la verificación de la relación lineal entre ambas magnitudes. El intervalo de intensidad de corriente seleccionado es el que satisface el criterio de linealidad. Posteriormente y tal como lo muestra la Figura 2, se determinó el límite de detección para diferentes ele-mentos: Fe, Ni, Zn y Co, utilizando la relación pro-puesta en [51999Nascimento Filho et al.]
donde:
- Ii(BG) es la intensidad en cuentas por segundo del elemento i en la muestra.
- CGa es la concentración en ppm (partes por millón) del estándar interno (Ga).
- IGa es la intensidad en cuentas por segundo correspondientes al Ga.
- Si es la sensibilidad relativa del sistema para el elemento i.
Figure 2: (Color online) Curva del límite de detección de muestras líquidas de algunos elementos, usando 10 μl de alícuota en reflectores de cuarzo y analizadas durante 200 s.
Los valores se muestran en la Tabla 1.
Table 1:
Valores de los pesos atómicos y limites de detección (LOD) en partes por billón (ppb) con 1 ppb=10−9.
Para la determinación de la concentración de Zn en cabello, se calibró el equipo utilizando estándares conteniendo 0.5, 1.0, 3.0 y 4.0 ppm de concentración en Zn, a los cuales, se añadieron suficientes cantidades de Ga, con el fin de obtener 10.0 ppm de Ga en todos los casos como estándar interno. Para la determinación de las áreas correspondientes a las líneas Ka del Zn y Ga, se empleó tanto el software AXIL como el QXAS. Con esta información se obtuvo la curva de calibración que se muestra en la Figura 3.
Figure 3: (Color online) Curva de calibración para el Zn. Donde IZn e IGa son los valores máximos de los picos de intensidad de Zn y Ga respectivamente.
2.3 Preparación de muestras
Las muestras se prepararon mediante el proceso de digestión empleando microondas (MWD) sugerido por [42007Memon et al.]. Se emplearon 200 mg de cabello y como oxidantes 3 ml de una mezcla compuesta por HNO3 y H2O2 concentrada (2:1, v/v) dejándolas reposar durante 5 min. Para la digestión se empleó un MWD Anton Paar (Instruments), en el cual se programa una secuencia de digestión de dos etapas: la primera a 100 W de potencia durante 5 min y la segunda a 800 W de potencia durante 15 min; teniendo en cuenta que la potencia máxima del equipo es de 1000 W y las condiciones de digestión son de 300°C como temperatura máxima y 75 bares de presión. Concluida la digestión se completa la preparación de la muestras agregando 0.25 mg de Ga para alcanzar 10 ppm de concentración como estándar interno.
3 Descripción del equipo de FRX y lectura de las muestras
Para el análisis por el método de reflexión total se utilizó un generador de Rayos-X ITAL STRUCTURES modelo COMPACT 3K5, cuyos rangos operativos de voltaje y amperaje son: 10 a 60 kV y 1 a 50 mA respectivamente, con 3 kW de salida y con un blanco de Mo. Para la lectura de muestras se utilizan reflectores de cuarzo, los cuales son previamen-te preparados mediante un procedimiento de lavado especial. Una vez limpios los reflectores se coloca una alícuota de 10 μl de la muestra sobre el reflector la cual es secada empleando una lámpara infrarroja durante 10 min. La muestra seca se la deja enfriar durante 5 min para su posterior lectura obteniéndose de esa manera los espectros correspondientes.
Figure 4: (Color online) Esquema de los procedimientos usados para la obtención de los espectros energéticos.
La Tabla 2 muestra un ejemplo de los valores de concentración de zinc promedio para cada edad y género (M, masculino y F, femenino) que se obtuvieron usando el software QXAS.
Table 2:
Concentraciones de zinc en la muestra líquida de cabello, volumen de aforo y masa promedio de los cabellos para cada edad y género de los individuos. 
4 Resultados
Una vez obtenidas las lecturas en el equipo de FRX, se calculó la concentración de Zn en cabello de cada individuo, resultados que se muestran en forma detallada en la Tabla 3
Table 3:
Concentraciones de zinc promedio en las muestras de cabello según la la edad y el género de cada niño.
Considerando los resultados antropométricos que se muestran en la Tabla 4 y que fueron obtenidos para los individuos utilizando WHO AnthroPlus, software que es descrito en [62007de Onis et al.], se construyen diagramas de "caja y bigote" para la concentración de Zn ([Zn]), el índice de masa corporal (IMC) y la talla en función de la edad, los mismos que se muestran en la Figura 5. Se puede observar que [Zn] para la mayoría de los individuos, tanto varones como mujeres, está comprendida en los límites aceptados desde el punto de vista nutricional que se mencionan en [71996Bertazzo et al.], donde para el rango etario de 6-11 años se tienen [Zn]=188.18 ±9.54 ppm y [Zn]=211.62±9.73 ppm para varones y mujeres respectivamente. También se observa que [Zn] tiende a ser mayor en las mujeres que en los varones, resultado que concuerda con otros trabajos como por ejemplo en [81979Heinersdorff & Taylor,92000Gibson, Skeaff & Williams]. Se nota que la presencia de valores atípicos en el IMC y la talla, ocurre principalmente para varones entre 8 y 9 años; lo anterior puede ser debido a que la edad en estos casos juega un rol mayor en la determinación de los parámetros antropométricos. Finalmente, se ve que la presencia de valores atípicos en [Zn] para varones y mujeres de 12 años es importante, situación que puede estar ligada a los cambios físicos y fisiológicos típicos de esta edad.
Table 4:
Valores del índice de masa corporal promedio (IMC), desviación estándar respecto a la media del IMC (zsIMC), talla de cada niño (H) y desviación estándar respecto a la mediana de las tallas (zsH), para las diferentes Edades (E) y Géneros (G)
Table 5:
Indicadores para las pruebas de diagnóstico.
Figure 5: (Color online) Diagramas de "caja y bigote" de 1.5 veces el rango intercuartil para (a),(d) [Zn], (b), (e) IMC y (c), (f) talla. Para niños (fila superior) y niñas (fila inferior).
Figure 6: (Color online) Análisis discriminante utilizando el IMC y [Zn], para (a) niños y (b) niñas.
Para realizar el análisis discriminante, se consideró que los límites de corte mínimo y máximo para la concentración de Zn eran de 150 ppm y 250 ppm respectivamente. Por otra parte, se tomó para el IMC, una unidad tipificada (z-score) mínima de 1.8 desviaciones estándar; en otras palabras, se considera a un individuo normal (negativo en cuanto a problemas nutricionales) si su [Zn] satisface (150 
[Zn] 250) ppm de acuerdo con [111990Weber], zsIMC 1.80; caso contrario se lo considera anormal (positivo en cuanto a problemas nutricionales). Bajo estas condiciones, se procedió a un análisis discriminante cuadrático tanto para varones como para mujeres, obteniéndose las regiones de discriminación mostradas en la Figura 6, tanto para varones (a) como para mujeres (b). En ambos casos, se observa que la mayoría de los individuos son normales, lo cual no es sorprendente puesto que la mayoría se encuentran en el el rango (150 [Zn] 250) ppm. Cabe aclarar que se realizó este análisis solo para las 96 muestras de la parte urbana de Viacha, ya que las 12 restantes no eran suficientes para observar la discriminación cuadrática. Para la cuantificación de este análisis se utilizan pruebas de diagnóstico mediante el cálculo de la sensibilidad (proporción de verdaderos positivos que han sido correctamente identificados) y de la especificidad (proporción de verdaderos negativos que han sido correctamente identificados); también se pueden calcular valores predictivos como el valor predictivo positivo (VPP) que es la proporción de pacientes positivos que han sido correctamente identificados o el valor predictivo negativo (VPN) que es la proporción de pacientes nega-tivos que han sido correctamente identificados. Los resultados obtenidos para este análisis se muestran en la Tabla 5.
De acuerdo con los valores obtenidos en la Tabla 5, se tiene una buena discriminación entre individuos que presentan características normales de aquellos que tienen potenciales problemas nutricionales. A pesar de estos buenos resultados, no se puede afirmar que exista una correlación entre la [Zn] y el IMC. Este tipo de resultados negativos fueron reportados en otros trabajos tales como [102004Weisstaub et al.,111990Weber]
5 Conclusiones y perspectivas
Entre las principales contribuciones del presente trabajo desde el punto de vista experimental, se puede mencionar que se puso a punto la técnica de FRXT para la determinación de concentración de zinc en cabellos; se estandarizó un protocolo que va desde la recolección de cabello hasta la preparación de la muestra pasando por la calibración del equipo de FRX, lo que en el futuro permitirá realizar mediciones de manera mas rápida y eficiente. En lo re-ferente a los resultados obtenidos, si bien no se halló una correlación directa entre [Zn] y los parámetros antropométricos como se esperaba, no se descarta que esta correlación pueda existir si en los estudios se incluyen un mayor número de variables que incidan en el nivel nutricional de los individuos, tales como edad exacta en meses, composición nutricional, entorno familiar y habitat, etc.; así como variables que representen una respuesta al nivel nutricional, como ser el grado de aprovechamiento académico. Con todo lo anterior, se espera hallar correlaciones que puedan indicar las posibles soluciones a pro-blemas nutricionales. Se espera que con los nuevos datos mencionados anteriormente, se pueda mejorar aún más el análisis discriminante. Se tiene la pers-pectiva de ampliar este estudio a otras regiones de Bolivia. Agradecemos la invaluable y desinteresada colaboración prestada por el personal del Centro de Investigaciones y Aplicaciones Nucleares, en especial a Jorge Chungara, Isaac Luna y Heidi Mamani de la Unidad de Análisis y Calidad Ambiental así como a Eusebio Mita de la Unidad de Investigaciones y Aplicaciones Nucleares. También al Dr. José Luis San Miguel del Instituto de Investigación en Salud y Desarrollo de la UMSA por proporcionarnos el software WHO AntroPlus.
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