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Las plantas naturales son fundamentales en la creación de nuevos fármacos y en el hallazgo de terapias medicinales, dado que, poseen propiedades biológicas debido a sus principios activos y compuestos fitoquímicos1.
La Cúrcuma (Curcuma longa) también conocida como tumeric, es una planta herbácea, presenta el rizoma con un cuerpo principal “bulbo o cúrcuma redonda”, de la cual salen varios rizomas secundarios denominados dedos. Se cultiva en la India y en otros países asiáticos, conocida por sus propiedades terapéuticas en la medicina tradicional.2,3 La Cúrcuma presenta en su composición un conjunto de compuestos fenólicos (curcuminoides) contenidos en el rizoma, siendo la curcumina el principal compuesto fenólico más estudiado4. La curcumina junto con los otros dos curcuminoides (demetoxicurcumina, bisdemetoxicurcumina) constituyen el complejo azafrán indio5, el cuál es una sustancia de bajo peso molecular (369,37 g/mol), con punto de fusión 183°C, de color amarillo en medio acido (pH: 2,5-7) y rojo en medio básico (pH: > 7), soluble en solventes orgánicos dimetilsulfóxido, etanol, metanol, hexano y acetona. Los compuestos fenólicos de la Cúrcuma representan un interés científico como potenciales agentes terapéuticos. Se han reportado estudios in vivo e in vitro de la Cúrcuma y de su principal componente, la curcumina, que demuestran efectividad frente a diversas patologias7. Estudios recientes revelan múltiples beneficios para la salud y la capacidad de actuar frente a enfermedades cardiovasculares, neurovegetativas, metabólicas, articulares, también posee efecto contra infecciones bacterianas, infecciones virales, anemia, diabetes, artritis, SIDA, propiedades cicatrizantes, antiulceroso, protector digestivo, antiinflamatorio, inhibe a las células cancerígenas, entre otras8,9.
Presenta efectos antiinflamatorios debido a la inhibición de la fosfolipasa 2, la ciclooxigenasa y la lipoxigenasa10. Investigaciones revelan efecto en el estrés oxidativo similar a la Vitamina E y previene la peroxidación lipídica9, detiene la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL)11. Sus extractos tienen propiedades antibacterianas, antioxidantes, antifúngicas, antiparasitarias y tiene la capacidad de inhibir la integrasa del VIH12, la curcumina inhibe el proteosoma de las células cancerígenas del colon13, afecta la replicación de virus como Coxsackie, Herpes, Epstein-Bar14. En 2020 se estudiaron los efectos contra el Covid 19. Los componentes químicos de la Cúrcuma (ciclocurcumina, curcumina) se unen significativamente al sitio activo de la proteosoma principal de SARS CoV-215. Es evidente que a nivel mundial se necesitan estudios de plantas de culturas indígenas, asumiendo que en Bolivia existe escaso conocimiento acerca de las propiedades de la Cúrcuma y su composición es diferente a la de otros países, dándole valor como objeto de estudio en futuras investigaciones con relación a sus beneficios medicinales para ser utilizado en la Industria Farmacéutica. Con esta información este estudio tiene como objetivo evaluar la actividad antioxidante, antibacteriana, tóxica, citostática y determinar la composición fitoquímica de extractos de Curcuma longa cultivada en el sector de Cristal Mayu del Chapare, a través de pruebas biológicas y análisis fitoquímico.
Material y métodos
El estudio fue analítico experimental, ya que está dirigido al análisis de las cualidades y la determinación de las características mediante la aplicación de diferentes pruebas. Los rizomas de Cúrcuma se recolectaron en el sector de Cristal Mayu, que se encuentra ubicada en la provincia del Chapare al norte del departamento de Cochabamba-Bolivia, el cuál es una zona lluviosa, con un clima tropical. En la recolección de los rizomas de Cúrcuma se consideró que los mismos no sean de otras áreas geográficas, no presenten daño alguno, sean de tamaño considerable y esten frescos. Los rizomas de Cúrcuma se deisnfectaron con DG6, luego fueron cortados en rodajas de 3-4 mm de espesor aproximadamente y se llevó a un secador con flujo forzado a una temperatura de 45°C. Las rodajas de Cúrcuma secas se pulverizaron y se prepararon dos extractos etanólicos 70% y 96%. Se realizó un screening fitoquímico por pruebas químicas para determinar la presencia o ausencia de metabolitos secundarios como taninos, flavonoides, saponinas y alcaloides.
Evaluación in vitro de las Actividades Biológicas
La cuantificación de fenoles totales se realizó por el método de Folin-Ciocalteu, se prepararon soluciones de diferentes concentraciones del patrón (Ácido gálico) de concentración inicial 500 ul/dl y una disolución de carbonato de sodio al 7,5%. Se midió la absorbancia a 765 nm25. Con los datos se realizó una curva que relacione la absorbancia con ug/ml de ácido gálico. El cálculo de los fenoles totales se efectuó mediante la ecuación generada por regresión lineal de la curva de calibración. La Actividad antioxidante por el método de DPPH, la solución madre del reactivo fue de 1mM, se utilizó un patrón de referencia (Vitamina C) 1 000 ug/ml, se midió la absorbancia a 517 nm19.
Cálculo del porcentaje de inhibición del radical del DPPH
Donde:
Ac = la absorbancia del Blanco
Am = la absorbancia de la muestra
Los resultados de la actividad antioxidante por el método del DPPH, pueden expresarse como coeficiente de inhibición IC50 (% de captación y mg Equivalentes a vitamina C).
La evaluación de la actividad antibacteriana fue por el método de difusión en agar 19,20 , empleando tres bacterias: Escherichia coli, CEPA ATCC 25922, Staphylococcus aureus CEPA ATCC 25923 y Klebsiella pneumoniae CEPA ATCC 700603.
A partir de los extractos, se prepararon diluciones de 24 000, 12 000, 6 000 ug/ml. Los inóculos bacterianos se prepararon a una concentración de 1x108 microorganismos por ml (tomando como referencia la escala de Mac Farland).
En la Evaluación de la Toxicidad sobre la Artemia salina se preparó una solución de sal marina al 3,8%. De los extractos se prepararon diluciones de 1 000, 100 y 10ug/ml; como control negativo se utilizó agua de mar más DMSO26. Con el resultado del conteo de Artemias se procedió a determinar la dosis Letal Media (DL50), llevando los datos a un programa estadístico computarizado “Probit” para clasificar la toxicidad de la Cúrcuma.
En la prueba de la Evaluación Citostática, mediante la Inhibición de la elongación de semillas de lechuga, se inició con una pre-germinación de las semillas de lechuga a una temperatura de 20-25°C en presencia de luz natural o artificial. Se preparó diluciones de los extractos 1 000, 100, 10 ug/ml, como control negativo se empleó agua estéril más DMSO. Posteriormente las semillas pre-germinadas, se pusieron en una cantidad de 10 unidades sobre el papel filtro contenidos en cajas Petri, que poseen las diluciones de los extractos, se incubaron a temperatura de 20-25°C en presencia de luz natural por 96 horas. Pasado ese tiempo se midió la longitud de las raíces desarrolladas26. Con los datos obtenidos de la prueba, se determinó la concentración Inhibitoria media (CI50) para clasificar la inhibición de la Cúrcuma.
En la Cuantificación de Curcuminoides del polvo de Cúrcuma, primero se pesó 0,1g de polvo de Cúrcuma patrón y se añadió 30 ml de etanol absoluto, llevando a reflujo. Se prepararon diluciones de los extractos. Luego se midió la absorbancia a 420 nm17. Para la muestra se procedió de la misma manera. Para determinar el porcentaje de curcumina se realizó un gráfico de regresión lineal con los datos de Cúrcuma patrón.
Consideraciones éticas: al no intervenir en las variables de estudio y limitarnos solamente a describir reacciones de las sustancias y material orgánico vegetal in vitro, no se requirió el consentimiento informado. El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Bioquímica y Farmacia de la Universidad Mayor de San Simón.
Resultados
El análisis fitoquímico de los metabolitos secundarios en ambos extractos muestra la presencia de flavonoides, compuestos fenólicos y alcaloides en cantidades diferentes respecto a los parámetros de cuantificación. Sin embargo, la Tabla 1 muestra mayor concentración de metabolitos presentes en el extracto de Curcuma longa al 96%. En la determinación del efecto tóxico, los valores de la DL50fueron determinados a las 24 horas, con base a la mortalidad de los nauplios de Artemia salina. De acuerdo a la Figura 1, se encontró un valor DL50 1,2 para el extracto al 96%, indicandoque que la Cúrcuma es una sustancia tóxica. El ensayo de citoxicidad determinó efecto tóxico para las raíces de lechugas por parte de la Cúrcuma al 96%. Según los datos encontrados en la Figura 2 , se presentó un efecto dosis dependiente de la concentración del extracto evaluado. Los valores de CI50 fueron determinados a las 96 horas, con base en la inhibición de las raíces de lechuga. El resultado indicó un valor de IC50 1,45 para la Cúrcuma al 96 %, indicando que es una sustancia Inhibitoria.
Tabla 1 Determinación de metabolitos secundarios por análisis fitoquímico
Indicadores del nivel de Concentración: (+) = Concentración baja, (++) = Concentración media, (+++) = Concentración elevada, (-) = Negativo
La Tabla 2 indica la relación de la presencia de los compuestos fenólicos en el tamizaje fitoquímico y su relación con la presencia de las actividades biológicas presentadas por los extractos, evidenciando que el extracto al 96%, extrae mayor cantidad de principios activos, presentando mayor actividad en todas las pruebas. La Cúrcuma de Cristal Mayu del Chapare posee un 5% de curcuminoides en su contenido, componentes responsables de las actividades biológicas de la misma, demostrando que la Cúrcuma tiene gran efecto antioxidante por su alto contenido de polifenoles, presentando actividad antibacteriana frente a las tres cepas utilizadas, mostrando además una potente actividad inhibitoria y tóxica.
Discusión
De acuerdo a los resultados de esta investigación los rizomas de Cúrcuma presentan principios activos con significativo potencial terapéutico, no solo poseen actividad antioxidante, también presentan toxicidad sobre Artemia salina y actividad citostática inhibiendo la elongación de la raíz de lechuga, además el extracto al 96% presentó efecto antibacteriano. Estudios semejantes realizados por Cosquillo et al.16 y Freire et al.17, sobre el análisis fitoquímico del rizoma de Cúrcuma muestran resultados similares respecto a la identificación de compuestos fenólicos y flavonoides. El incremento del grado alcohólico mejora la extracción de los compuestos fenólicos según Alvis et al.6. Estos resultados, además, dan cuenta del por qué en la determinación de fenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu mostraron que la Cúrcuma al 96% presenta elevada cantidad de polifenoles 278,4 mg eq AcG/g de extracto, al igual que la investigación realizada por Cosquillo et al.16 que obtuvo un valor de 296 mg eq AcG/g de extracto. La actividad antioxidante de los rizomas de Cúrcuma se debe a la presencia de flavonoides presentes en su composición química según Herrera18. De esta manera, se observa que el extracto al 96% presenta mayor concentración inhibitoria media IC50 concentración necesaria para reducir al 50% la concentración inicial del radical DPPH frente al extracto al 70%, al igual que un estudio realizado por Cosquillo et al.16 que demuestra extracto etanólico de Curcuma longa presenta mayor capacidad antioxidante. Los resultados indican que la Cúrcuma posee propiedades antibacterianas. Solo el extracto al 96% presento actividad frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, ocasionando zonas de inhibición teniendo en cuenta los controles positivos utilizados para cada cepa. Asimismo, reportes de investigaciones han demostrado que los extractos etanólicos obtenidos de la Cúrcuma, tienen actividad antibacteriana frente a S. aureus, en el estudio Muhamed et al.19. De la misma manera que para E. coli según Falco et al.20 demuestra que la Cúrcuma posee efecto antibacteriano para esta bacteria. Otro trabajo realizado por Mendez et al.21 determinó que la Cúrcuma posee propiedades antibacterianas frente a K. pneumoniae. De acuerdo a publicaciones García et al.22, Bustamante et al.23 la Cúrcuma muestra actividad tóxica frente a la Artemia salina donde fue evaluado el extracto etanólico de la Cúrcuma, obteniendo datos que concuerdan con nuestro trabajo LD50: 16,3 ug/ml, dato que nos sugiere que el extracto de Cúrcuma al 96% tiene actividad tóxica. Esta actividad es importante en la búsqueda de nuevos productos con potencial anticancerígeno26. El estudio realizado por Bustamante et al.23 mostró la actividad citostática frente a la Curcuma longa, nuestro estudio muestra una IC50: 28, por lo tanto la Cúrcuma se considera sustancia inhibitoria, con probable actividad antitumoral26. Es de especial interés la caracterización de la Cúrcuma para determinar el total de sus polifenoles presentes en los curcuminoides, ya que según Correa 24 comprenden el 2-9% de la planta. Respecto a la cantidad de curcuminoides totales determinado en el polvo de Cúrcuma fue de 5% en comparación al estudio realizado por Freire et al.17 que fue de 5,9%; haciendo referencia también que estos compuestos se deben encontrar en un porcentaje ≥ 3%. El presente trabajo de investigación se basó en el estudio de dos extractos etanólicos, dando un mejor resultado el extracto al 96% en todas las pruebas realizadas, por lo que se demuestra que la Curcuma longa del sector de Cristal Mayu del Chapare presenta propiedades antioxidantes, antibacterianas y citotóxicas.
En conclusión, los extractos etanólicos elaborados a partir de los rizomas de Cúrcuma poseen flavonoides, taninos y alcaloides en distintas proporciones, siendo los responsables de las actividades biológicas de la Cúrcuma, el extracto al 96% que presenta mayor cantidad de compuestos fenólicos, 278,4 mg/ml y en la actividad antioxidante determinado por el método de DPPH, presenta una IC50 120 ug/ml. Solo el extracto al 96% presenta actividad antibacteriana frente a E. coli, K. pneumoniae y S. aureus. Por tanto el extracto de Cúrcuma al 96% se clasifica como una sustancia tóxica y una sustancia inhibitoria. Se relacionó los resultados obtenidos en el tamizaje fitoquímico, principalmente la determinación de compuestos fenólicos, siendo algunos de los compuestos responsables de las diferentes actividades de la Cúrcuma, argumentado que el extracto al 96% extrae mayor cantidad de metabolitos y principios activos debido a que mostraron un buen resultado en todas las pruebas. Los resultados obtenidos representan un gran hallazgo en nuestro medio, ya que con los datos obtenidos en esta investigación, se demuestra que la Cúrcuma del Chapare de Bolivia, es una planta completa con propiedades y bondades únicas para la prevención y tratamiento de diversas enfermedades complejas y difíciles de tratar, debido a que presentó buena actividad antioxidante, antibacteriana y citotóxica.
Con la base de datos de este estudio se espera que la Cúrcuma se utilice en las Industrias farmacéuticas como materia prima para la formulación de nuevos productos y a partir de los resultados se desarrollen estudios farmacológicos y toxicológicos que validen su uso, su actividad farmacológica y sus propiedades Antitumorales, Neurovegetativas, Cardiovasculares, Antinflamatorias, Cardiotóxicas Antibióticas, entre otras.
