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INTRODUCCIÓN
Bolivia es un país con una enorme riqueza en biodiversidad, ecosistemas y variabilidad genética. Esto permite el desarrollo de una agricultura altamente diversificada, como los cultivos de soya, sorgo y castaña entre otros, provenientes de los llanos orientales; o de trigo, maíz y avena entre otros de los valles mesoméricos, además de una variedad de gramíneas, como la cebada y pseudo-cereales como la quinua que se producen particularmente en el Altiplano Boliviano 1.
La quinua, por su composición en aminoácidos esenciales, oligoelementos y vitaminas, es un alimento altamente nutritivo e ideal para el organismo humano 2. Sin embargo, la quinua presenta unos principios amargos: saponinas mono y bidesmosídicas (Fig.1), glicósidos principalmente derivados del ácido oleanólico sustituido en C- 3 y/o C-28 3) que se encuentran mayoritariamente en el episperma del grano (mojuelo o residuos de escarificado) y minoritariamente también en granos, hojas, flores y tallos y que deben ser eliminados antes de su consumo.
Figura 1 Ejemplos de saponinas [A] monodesmosídicas y [B] bidesmosídicas, utilizando como genina el ácido oleanólico e identificando la cadena de azúcares como Az.
Se han desarrollado varios estudios y proyectos científicos sobre las aplicaciones de las saponinas de quinua en áreas de cosmética, salud, agricultura, pesticidas y otros 4),(5. Estos suponen una alternativa viable de valorización de residuos agroindustriales como el mojuelo. Varias empresas bolivianas han desarrollado un proceso industrial de beneficiado 6 previo a la venta de los granos de quinua basado en la fricción entre granos por acción mecánica (escarificado), del cual se obtiene el polvo rico en saponinas denominado “mojuelo”. Este mojuelo tiene un rendimiento de 4.5 % respecto del grano de quinua 7. De acuerdo a datos de Instituto Boliviano de Comercio Exterior (IBCE) se exportan más de 30.000 toneladas por año de grano de quinua 8),(9 por lo que cada año se generan toneladas de estos residuos.
De acuerdo a antecedentes previos de nuestro grupo de investigación 10, para la obtención de un extracto rico en saponinas a partir de “mojuelo” de quinua, se debe realizar una extracción por maceración con EtOH/H2O 50/50, utilizando una relación m/v de extracción de 1/9 y un tiempo de 72 h. El extracto hidro-alcohólico así obtenido es luego sometido a rotaevaporación hasta la eliminación del alcohol. El residuo acuoso es sometido a liofilización para obtener un extracto seco. Sin embargo, el proceso de liofilización suele ser muy largo (más de 72 h). Además, el equipo es caro y el proceso tiene un alto coste energético. Por estas razones, en este trabajo estudiamos la posibilidad de realizar un secado por aspersión, una técnica alternativa que puede requerir menor inversión y tiempo.
La técnica de secado por aspersión se basa en la obtención de productos en polvo a partir de concentrados líquidos, por evaporación rápida del agua en microgotas generadas en el atomizador, mediante contacto con una corriente de aire caliente. Concretamente, en este proceso, el extracto líquido o mezcla que está en el tanque de alimentación fluye a través de la bomba peristáltica hasta la boquilla del atomizador, donde se dispersa en forma de microgotas 11. Paralelamente, un flujo de aire caliente llega hasta la boquilla del atomizador haciendo contacto con la mezcla a secar, evaporando el agua de las microgotas. El agua de la solución o dispersión se evapora en un instante, produciendo un pulverizado fino que es transportado conjuntamente con el vapor de agua a través del flujo de aire caliente. Esta mezcla es transportada hasta un ciclón, donde el polvo es separado del vapor de agua y es descargado en un recipiente de recolección. Por otro lado, el vapor de agua es transportado por un tubo de escape hacia afuera del secador por aspersión 11.
Con estos antecedentes, el presente trabajo describe la técnica de secado por aspersión para la obtención de un polvo rico en saponinas a partir de mojuelo de quinua, como una alternativa al secado por liofilización. Se analizaron algunos parámetros para el secado por aspersión como la concentración del extracto acuoso rico en saponinas, la temperatura de entrada de secado y la velocidad del flujo de aire.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para la obtención de extractos secos ricos en saponinas, se empleó el extracto acuoso residual obtenido a partir de la eliminación del EtOH de extractos hidroalcohólicos (50:50 H2O:EtOH) del mojuelo de quinoa. Estos extractos hidroalcohólicos fueron obtenidos por maceración del mojuelo de quinua durante 72 h a temperatura ambiente, de acuerdo a parámetros de extracción previamente establecidos en el laboratorio 10.
Parámetros de la técnica de secado por aspersión de un extracto rico en saponinas de quinua.
Para la obtención del método para tener extractos secos ricos en saponinas, por la técnica de secado por aspersión, se empleó el equipo BILON-6000Y. Los parámetros del equipo que se mantuvieron constantes fueron: i) El flujo de alimentación de 8.0 mL/min. Éste está definido por la velocidad de la bomba peristáltica (9 rpm), y el tiempo de inyección (4 s). Este es el tiempo en el que el inyector se abre y por presión expulsa el extracto líquido hacia la cámara de secado. Los valores de dichos parámetros se mantuvieron constantes porque su variación ocasionaba la obstrucción del inyector y rebalse del extracto líquido hacia la cámara de secado. ii) El ángulo de pulverización, tampoco varió debido a que el rociado se realiza en dirección del flujo de aire, hacia abajo de manera vertical, de acuerdo al diseño del equipo. iii) La temperatura de salida es un parámetro no regulable en el equipo, por lo que no se puede tomar en cuenta para el diseño factorial, pero sí se tomaron en cuenta los datos que oscilaron entre 40 a 45°C. Este rango de temperatura no es muy amplio, ya que el equipo cuenta con un controlador de temperatura PID (Proporcional, Integral y Derivativo) que elimina la oscilación y le brinda estabilidad al proceso de secado.
Por lo tanto, se empleó un diseño experimental factorial 23 con dos réplicas. Los parámetros evaluados fueron:
i) Concentración del extracto acuoso residual. Se asignó el valor arbitrario de 100 a los extractos sin etanol o extractos acuosos concentrados en saponinas (EACS), y 50 a los extractos acuosos de saponinas diluidos en agua al 50 % (EADS). Nótese que este parámetro afecta la densidad de la muestra; ii) Temperatura de secado (se evaluó a dos temperaturas de ingreso de la muestra, 100 y 150°C) y iii) Velocidad del flujo de aire que transporta el polvo a través del equipo hasta el ciclón de separación (2395 y 4192 rpm). Los resultados contenidos en la Tabla 1 muestran los rendimientos promedio de cada prueba realizada por duplicado más su desviación estándar, observándose que los parámetros de las pruebas N° 5 y N° 6 produjeron los mayores rendimientos de recuperación del polvo de saponinas.
Tabla 1 Porcentaje de extracto seco obtenido por el método de secado por Aspersión, respecto a la masa de mojuelo utilizado
De acuerdo a los resultados de la Tabla 1, los parámetros con los que se obtiene un mayor rendimiento (27,7% respecto al peso del mojuelo) son: extracto acuoso concentrado en saponinas al 100% (EACS), temperatura de secado de la muestra líquida de 100°C, y velocidad del flujo de aire de 4192 rpm (prueba 6).
Las muestras de extractos acuosos de saponinas, diluidas al 50%, que fueron secadas con la misma temperatura inicial y velocidad del flujo de aire de 4192 rpm, también producen un rendimiento considerable (20,3% respecto al peso del mojuelo), aunque menor a la de los extractos acuosos concentrados. Esto podría deberse a que la muestra al 50 % tiene mayor cantidad de agua, y el vapor de agua generado hace que parte de la muestra seca quede adherida a las paredes de la cámara de secado (prueba 5). Por otra parte, en el caso de las muestras que fueron secadas a 150°C, el extracto seco también se adhiere a las paredes de la cámara de secado. Esta alta temperatura parece ocasionar la descomposición térmica de la muestra seca adherida a las paredes.
Realizando un análisis del diseño factorial aplicado, observamos los resultados mostrados en el siguiente diagrama de Pareto (Figura 2), a partir del cual se puede determinar cuáles son los factores o parámetros que son significativos.
Figura 2 (a) Diagrama de Pareto de Efectos estandarizados y (b) Gráfica normal de efectos estandarizados.
Así, en la Figura 2(a) se observa que aquellos parámetros e interacciones de los parámetros que sobrepasan el margen de error (valor=2.306), son significativos en cuanto al aumento o disminución del rendimiento de obtención de polvo de saponinas. Para este caso, se observa que los parámetros significativos son B= temperatura de secado [°C], C= velocidad del flujo de Aire [Hz], y las interacciones, de AC= Concentración del extracto acuoso residual [%] * Velocidad del flujo de Aire [rpm], y BC= Temperatura de secado* Velocidad del flujo de Aire. Estos datos son confirmados en la gráfica de Normalidad, Figura 2(b). En dicha gráfica, se observa que los parámetros A = Concentración del extracto acuoso residual [%], las interacciones AB= Concentración*Temperatura de secado, y la triple interacción ABC= Concentración*Temperatura de Secado*Velocidad del flujo de Aire, se encuentran muy cercanos a la línea de referencia y, por lo tanto, no son significativos.
Finalmente, la Tabla 2, análisis de ANOVA del diseño experimental, confirma que estos parámetros y sus interacciones, con P < 0.05, son significativos. En resumen, los parámetros que tienen mayor significancia en los rendimientos de recuperación de polvo de saponinas después del proceso de secado por aspersión son: la temperatura de secado (B), la Velocidad del Flujo de Aire (C), además de las interacciones entre la Concentración*Velocidad del Flujo de Aire (AC), y Temperatura de secado* Velocidad del Flujo de Aire (BC).
Adicionalmente, se realizó una comparación del rendimiento de extracción total entre la técnica de secado por liofilización 10 y la técnica de secado por aspersión. Mediante la liofilización, los rendimientos obtenidos varían desde 36.0% m/m hasta el 39.4 % m/m de polvo de saponinas, sobre la masa de mojuelo seco. Sin embargo, el tiempo de secado empleado es de 72 horas para 1000 mL de extracto acuoso residual al 50 o 100%. En cambio, usando la técnica de secado por aspersión, se puede obtener el polvo seco total con un rendimiento de aproximadamente 27% en 1 a 2 horas, para la misma cantidad de extracto acuoso residual de EACS, con una tasa de alimentación de aproximadamente 500 mL/h, de acuerdo a los parámetros empleados en el equipo BILON-6000Y. El menor rendimiento en el secado por aspersión puede deberse a que parte de la muestra se queda en la cámara de secado o parte del polvo obtenido es expulsado por el tubo de escape del equipo, por lo que se recomienda revisar estos aspectos para obtener un mejor rendimiento.
Figura 3 A) Disolución acuosa del extracto seco obtenido por la técnica de secado por aspersión, B) Disolución acuosa del residuo de escarificado (mojuelo)
La figura 3 muestra una comparación entre una disolución del residuo de escarificado (mojuelo) en agua y una disolución del extracto seco obtenido por aspersión disuelto en la misma cantidad de agua (2,5 g/50 mL en ambos casos). Se observa que el resultante del secado por aspersión tiene menos color que la disolución de mojuelo. Esto implicaría que los colorantes del mojuelo se perdieron durante el proceso. La coloración rojiza se debe a la presencia de colorantes naturales como las betalaínas y/o antocianidinas 12, las cuales se pierden en el proceso de secado probablemente por el incremento de la temperatura 13),(16 debido a que las betalaínas son termolábiles 13. Por lo tanto, una temperatura aconsejable para mantener los compuestos betalaínicos estables es de 4°C 17. El ácido betalámico, de color amarillo brillante, y el ciclodopa-5-O-glucósido (sin color) son productos resultantes de la descarboxilación de betaína durante tratamientos térmicos 18. Esto explicaría el color del extracto resultante (Fig. 3A), color que también puede deberse a la deshidrogenación de la betaína que genera otro compuesto betalámico, la neobetanina, que causa un cambio de color de rojo a amarillo 13),(19.
Análisis de saponinas por TLC y HPLC del extracto seco obtenido por la técnica de secado por aspersión.
Para determinar el contenido de saponinas totales en el polvo obtenido por secado por aspersión, se realizó un análisis por TLC y HPLC en comparación con una muestra control estándar de saponinas de quinua. Esta muestra control estándar fue obtenida en el laboratorio y analizada previamente frente a un patrón de saponinas de quinua facilitado por Ricardo San Martín de la Universidad Católica de Chile 20. Se determinó una concentración de saponinas en la muestra control estándar del 85% m/m sobre la masa de un extracto patrón de saponinas. El patrón de Chile sirvió de referencia para estudios previos en nuestro laboratorio. A partir de la caracterización de este patrón, se obtuvo la muestra control estándar utilizada en el presente trabajo. La Figura 4 muestra la comparación de los perfiles cromatográficos por TLC, y la Figura 5 muestra la comparación de los perfiles cromatográficos por HPLC
Figura 4 Cromatograma TLC, A) muestra control del 85 % de saponinas totales en el extracto, B) muestra obtenida por secado por aspersión, el solvente de elución es una mezcla de AcOEt :Ac. Acético:Ac. Fórmico:Agua 68:7:7:18
En las Figuras 4 y 5 se observa que el polvo de saponinas obtenido mediante el secado por aspersión (Fig. 4A) tiene un perfil cromatográfico similar al del control de 85% de concentración de saponinas de quinua (Fig 4B). Considerando que los cromatogramas fueron obtenidos utilizando las muestras (A) y (B) a la misma concentración, se puede observar que ambas tienen varios compuestos iguales, pero en diferente concentración. Así, por ejemplo, en el cromatograma mostrado en la Figura 5A (patrón al 85%), se aprecia picos de mayor intensidad a tiempos mayores de 15 min (saponinas) que en el de la Figura 5B (polvo). Por otro lado, en la muestra del extracto secado por aspersión, se observa la presencia de compuestos fenólicos, en las placas cromatográficas, que pueden distinguirse por su color amarillento característico. Para esta muestra (5B) se observa una mayor intensidad en el color que en el control estándar de saponinas. La misma conclusión se observa en los cromatogramas de la figura 5, que muestran que el control estándar posee menor cantidad de compuestos fenólicos (poca población y picos de menor intensidad a tiempos de retención menores a los 10 min) que en el extracto hidroalcohólico secado por aspersión.
En los cromatogramas RP-HPLC de la Figura 6 se hizo un análisis de los espectros UV de cada uno de los picos. Se determinó que las saponinas salen a tiempos de retención mayores a 15 min, ya que no presentan bandas de absorción a longitudes de onda (λ) mayores a 220 nm. Por otro lado, los picos representativos de oligosacáridos y compuestos fenólicos glicosilados normalmente tienen tiempos de retención menores a los 15 min, debido a que son más polares que las saponinas 21. Además, los compuestos fenólicos presentan bandas características a longitudes de onda (λ) mayores a 220 nm en el espectro UV. Particularmente, los flavonoides presentan dos bandas alrededor de 280 y 360 nm, mientras que los derivados de ácido cinámico presentan una banda alrededor de los 300 nm. Debido a estas diferencias, ambos tipos de compuestos son fácilmente distinguibles.
En síntesis, en los cromatogramas del control (Fig. 5A) se observan principalmente señales de saponinas, mientras que el polvo obtenido por secado por aspersión (Fig. 5B) presenta señales de otros compuestos, como por ejemplo compuestos fenólicos. Esto indica que el polvo obtenido por secado por aspersión es una muestra con menor contenido de saponinas.
Determinación de la concentración de saponinas en el extracto seco obtenido por el método de secado por aspersión.
La cuantificación de la muestra control de saponinas en el extracto seco, se realizó mediante una medición de las áreas de las señales correspondientes a saponinas en los cromatogramas obtenidos por la técnica de RP-HPLC 10. Esto quiere decir que, se sumaron las áreas de los picos entre los 15 y 30 minutos asumiendo un mismo valor en el coeficiente de absorción en el cromatograma del patrón (Fig. 5A) y en el del polvo de saponinas obtenido por aspersión (Fig. 5B). Considerando que la muestra control tiene una concentración de saponinas del 85% m/m se tiene los siguientes resultados para la muestra estudiada: 68.73 % de saponinas en el extracto seco en polvo y 18.97% de saponinas en el mojuelo seco.
Figura 6 Cromatogramas RP-HPLC a 370, 310 y 210 nm respectivamente y espectros UV característicos de los picos obtenidos en la región de compuestos fenólicos (tr < 10min) y en la región de saponinas (tr > 15min) del extracto de saponinas obtenido por secado por aspersión.
El proceso de liofilización para el secado del extracto acuoso puede considerarse un método de referencia en cuanto al máximo contenido de saponinas que puede recuperarse del extracto acuoso. Esto debido a que no existen pérdidas de saponinas durante este proceso 21. Comparando el contenido de saponinas en el polvo obtenido por secado por aspersión con el de liofilizado, podemos observar que el porcentaje de saponinas en el extracto después del liofilizado varía desde 47.3 % hasta 56.2 %, y de saponinas en el mojuelo seco desde 17.3 % hasta 22.1% 10),(22. En el caso del extracto seco obtenido por secado por aspersión, existe un mayor porcentaje de saponinas, estos valores están alrededor de 60,0 % para el extracto seco y alrededor de 19,0 % para el mojuelo seco. Sin embargo, estos valores pueden deberse a otros factores como la variedad o ecotipo de quinoa de la cual se obtuvo la cascarilla utilizada en este trabajo con respecto al estudio de liofilización. No obstante, con este análisis se puede comprobar que los procesos de liofilizado y de secado por aspersión permiten obtener polvos con contenidos comparables de saponinas. Entonces, el secado por aspersión resulta una técnica de secado alternativa para la obtención de saponinas del mojuelo de quínoa.
EXPERIMENTAL
Equipo de secado por aspersión
El Equipo Utilizado para la determinación de parámetros de secado de extractos acuosos ricos de saponinas, fue el equipo BILON-6000Y.
Figura 7. Secado por aspersión BILON 6000Y
Extracción de saponinas
Para la obtención del extracto rico en saponinas se pesó la cascarilla de quinua (mojuelo), se añadió una mezcla EtOH/H2O al 50% v/v como solvente de extracción. La relación empleada fue 1:9 m/v peso de mojuelo seco a volumen de solvente de extracción, y se dejó macerar por 72 h a temperatura ambiente. Se separó el extracto hidroalcohólico del material vegetal por filtración al vacío. El filtrado se concentró en un rotaevaporador a presión reducida para la recuperación de etanol, obteniéndose como producto un extracto acuoso concentrado en saponinas (100%, EACS).
Secado por aspersión (spry-drying) del extracto acuoso de saponinas
Todos los extractos acuosos ricos en saponinas se llevaron al secador por aspersión BILON-6000Y. Los parámetros que se modificaron y evaluaron en el equipo fueron: la temperatura de secado de la muestra y velocidad del flujo de aire. Se trabajó con dos concentraciones de la muestra acuosa de saponinas: una sin dilución 100 % (EACS) y la otra diluida al 50 % (EASD) con agua. Se empleó un diseño factorial 23 con dos réplicas haciendo un total de 16 pruebas de secado, para cada prueba de secado se utilizó 200 mL de extracto acuoso residual. Los parámetros que se mantuvieron constantes son. La velocidad de la bomba peristáltica, el tiempo de inyección de la muestra acuosa, y la presión. Los parámetros de secado para cada muestra se detallan en la Tabla 1.
Se tomó como factor de respuesta el rendimiento de extracción para cuyo cálculo se empleó la siguiente ecuación:
* mx: masa de extracto obtenido después del secado.
* mt: masa de mojuelo seco utilizado inicialmente en la extracción.
Los resultados fueron analizados por diferentes métodos estadísticos (ANOVA, Diagrama de Pareto de Efectos Estandarizados y Gráfica Normal de Efectos Estandarizados) para determinar la significancia de los procesos y sus interacciones en el secado por aspersión.
Análisis cualitativo TLC
Las placas de cromatografía de capa fina (TLC) se revelaron con aspersión de ácido sulfúrico al 5%, las saponinas se visualizan como manchas separadas de color violeta donde su intensidad varía en relación a su concentración dentro del extracto 47.
La figura 4 muestra una placa cromatográfica de Sílica gel 60 F254 (fase normal) corrida en un sistema de elución Acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético-agua en proporciones 68:7:7:18 respectivamente. La figura 4A muestra una fracción purificada de saponinas de quinua a partir de un extracto hidroalcohólico de mojuelo que fue liofilizado 10. Esta fracción purificada fue empleada como un control estándar. Por otro lado, la figura 4B, corresponde a un extracto hidroalcohólico de mojuelo de quinua obtenido mediante la técnica de secado por aspersión (Spray Dryer).
Obtención del control estándar de saponinas
5 g de extracto hidroalcohólico seco de mojuelo disueltos en agua destilada en relación 1:10 p/v. Extracciones liq- liq con n-butOH (X4), fase orgánica contiene saponinas y compuestos fenólicos glicosilados 48, Fase orgánica (n- butOH) llevada a sequedad a presión reducida.
0.200 g del extracto seco (n-butOH) fueron eluidos en sistema de exclusión molecular (Sephadex LH-20) con etanol. Se obtuvieron dos fracciones: una fracción rica en saponinas y otra fracción rica en compuestos fenólicos glicosilados (monitoreo por TLC). La fracción rica en saponinas fue separada por HPLC usando estándar provisto por la Universidad de Chile, determinándose 85% de saponinas m/m con respecto a la masa de mojuelo seco.
Determinación de % de Saponinas por Cromatografía Líquida de Alta Resolución HPLC:
El análisis de saponinas por HPLC se realizó en un equipo Agilent 1100 series. Las separaciones se realizaron en una columna Kromasil® (fase reversa) C18 de 4 mm +125 mm d.i., 5 µm a 20 °C y 210 nm. Para la separación, se empleó como fase móvil ácido fórmico en agua al 0.1% v/v (solvente A) y Acetonitrilo al 100% (solvente B). Se trabajó con una elución isocrática de 75% de solvente A con un flujo constante de 0.7 mL/min durante 15 min. Luego, en el minuto 16 se cambia a 65% de A con un incremento en el flujo de 0.7 a 1.0 mL/min, manteniendo este flujo durante 20 min.
Las muestras, previa a la inyección en el equipo, fueron preparadas pesando 15 mg de la muestra seca en tubos Eppendorf, que se disolvieron con 1.5 mL de agua destilada ultrapurificada, agitando en Vortex durante 30 segundos. Se tomó cada muestra disuelta con una jeringa de 5 ml y se filtró la muestra en los viales para HPLC con un filtro de éster de celulosa de 0,45 µm, para luego llevarlas al equipo de Cromatografía Líquida de Alta Presión, HPLC. Finalmente, para la cuantificación de saponinas totales, se utilizaron las siguientes ecuaciones ya utilizadas anteriormente por Lozano et al. 10:
X= porcentaje de saponina en el extracto. A= Área total de la muestra.
B= Área total del estándar.
85= porcentaje de pureza del patrón de saponinas totales.
Y= porcentaje de saponina en el mojuelo.
R= rendimiento de la extracción.
CONCLUSIONES
Los parámetros de secado que tienen significancia en el proceso de secado por aspersión son la temperatura de secado y la velocidad del flujo de aire. En este estudio se determinó, que para obtener un mayor rendimiento de un polvo rico en saponinas se sugiere una temperatura de secado de 100 °C y una velocidad del flujo de aire de 4192 rpm con un flujo de alimentación (500 mL/h) y tiempo de inyección constantes. Bajo estos parámetros, se obtiene un polvo rico en saponinas de quinua con una concentración del 68.73%, respecto al extracto seco, y con un rendimiento de extracción del 27.6 % m/m con respecto a la masa del mojuelo seco, aproximadamente, en el equipo BILON-6000Y. La técnica de secado por aspersión demostró ser rápida, 1 L por cada 2 horas para los extracto acuosos utilizados (EACS y EADS), en comparación a la técnica de secado por liofilización que se realiza en 72 horas, para los mismos extractos acuosos. Este proceso puede hacerse a mayor escala dependiendo del tamaño del equipo. El secado por aspersión demostró ser efectivo, ya que el extracto obtenido (polvo) tiene un alto porcentaje de saponinas, las cuales se mantienen estables en el proceso.
