ARTICULO ORIGINAL

EVALUACION DE DOS METODOS COLORIMETRICOS EN BASE A AMINOFENAZONA Y AMINOANTIPIRINA PARA LA DETECCION DE MUESTRAS DE SANGRE EN DIFERENTES CONDICIONES CON FINES FORENSES

Nelly Coterhuanco Apaza, Sergio Quispe Mayta, Lily Salcedo ortiz 

¹Catedra de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra, La Paz- Bolivia,

²Instituto de Investigaciones Forenses, La Paz - Bolivia

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Keywords: Hemoglobin, Stains of blood, Aminofenazona, Aminoantipirina, Colorimetric Analysis

ABSTRACT

In this study we evaluate two colorimetric methods based on the aminofenazona and the aminoantipirina, to determine presence of blood in minimum concentrations by means of the hemoglobin, These experiments were carried out on different supports (cloths) exposed to environmental conditions environmental and time in which you/they were exposed. The tests showed high effectiveness in different supports for the sanguine groups O, A, B, AB and OR giving positive for blood until concentrations of 1/10.000. It is find organic interferentes as the juices of citric fruits and green vegetables that you/they can you cause false positive. Also you work with stains washed in which both methods detected blood in invisible stains, and finally the non absorbent supports that were buried by more time you is not able to detect presence of blood. / Se evaluaron dos métodos colorimétricos en base a pruebas de la aminofenazona y la aminoantipirina, para determinar presencia de sangre en concentraciones mínimas. Las pruebas se llevaron a cabo  sobre diferentes soportes (telas) expuestos a diferentes condiciones ambientales y de tiempo, a las cuales fueron expuestas. Las pruebas  mostraron alta sensibilidad  en diferentes soportes  para los grupos sanguíneos A, B, AB y O dando positivo para sangre hasta concentraciones de 1/10.000. En las manchas lavadas, ambas pruebas mostraron sensibilidad hasta el quinto lavado con diferentes detergentes. Se encontraron interferentes  orgánicos como los jugos  de frutas cítricas y vegetales verdes  que pueden ocasionas falsos positivos. Finalmente en los soportes  no absorbentes que fueron enterrados por mayor tiempo las pruebas fueron negativas.

Corresponding author: adri-nelly@hotmail.com

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INTRODUCCIÓN

La  biología forense  involucra la identificación  y comparación  de  seres  vivos   mediante  el análisis   de   fluidos,   tejidos   y   estructuras biológicas  de las muestras forenses en la resolución  de  casos criminales.¹ El reconocimiento, identificación, individualización y evaluación  de  la evidencia empleando     métodos    científicos  para    la resolución de aspectos relacionados con la ley es de vital importancia. Una de las evidencias mas importantes y mas común en una escena de  crimen  son  las manchas de sangre  que se pueden encontrar en diferentes soportes o sometidas a condiciones ambientales lo  cual es importante   para   la resolución   de aspectos relacionados con la ley.² Las muestras sanguíneas tienen un alto contenido de eritrocitos y estos a su vez de hemoglobina, los métodos de detección de muestras sanguíneas se basa en detectar este ultimo elemento. En los países desarrollados se utiliza el luminol que requiere muestras concentradas y cuyo reactivo es de alto costo.³ En el presente estudio de orientación se ha evaluado la sensibilidad y especificidad de  dos métodos  colorimétricos en la detección de muestras sanguíneas sobre diferentes soportes y en diferentes condiciones ambientales, para ello se han utilizado dos sustratos  (aminofenazona y aminoantipirina), para implementarlos en forma rutinaria.

RESULTADOS  Y  DISCUSIÓN

Como se observa en la Tabla 1, el método de la aminofenazona mostró mayor sensibilidad en la detección de sangre  sobre diferentes soportes, dando positivo  hasta  1/10.000  para los grupos sanguíneos A, B y O con factores Rh (+)  e incluso hasta 1/50.000 para el grupo AB sobre el soporte de algodón, en relación al test de la Aminoantipirina que mostró positividad  hasta 1/5000 para grupos sanguíneos A;B;AB y O  con factores  Rh (+)  e incluso menor para el grupo AB  (hasta 1/1000). En el estudio de detección de sangre en muestras lavadas, como se observa en la Tabla Nº2, las pruebas fueron positivas hasta el décimo lavado para agua, agua y aceite, siendo las lavadas con jabón, detergente en polvo y lavandina positivas hasta el  quinto  lavado. Estos resultados son importantes por que las ropas manchadas de sangre  durante un acto violento  son generalmente lavadas para tratar de eliminar los vestigios.⁶

Tabla 1 : Sensibilidad de los test  de  aminofenazona  y aminoantipirina en la detección de sangre diluida sobre diferentes soportes

 (+) = positivo  (-) = negativo

 

 

 

 

 

 

 

Tabla  2. Test  de aminofenazona y  aminoantipirina sobre manchas sanguineas  sometidas a lavados 

 

                                              

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                 *v =visible                             pv = poco  visible                  i = invisible                           

                                (+) = test positivo                 (-) =  test negativo

                                *v =visible                             pv = poco  visible                 i = invisible                           

                                (+) = test positivo                 (-) =  test negativo

 

Tabla 3:  Test de Aminofenazona /Aminoantipirina en manchas de sangre sobre diferentes soportessometidas a diferentes condiciones (temperatura, tiempo, ambiente abierto, cerrado y enterrado)

AF = Aminofenazona             AA = Aminoantipirina            (+) = Positivo         (-) =Negativo

 

Para las manchas de sangre sobre  soportes sometidas a tiempos variables nuestro estudio mostró que ambos métodos detectan presencia de sangre  hasta las 24 horas para  todos los soportes, siendo la prueba de aminoantipira de mayor sensibilidad a mayor temperatura y condiciones mas drásticas (enterrado), a la vez se observa que a mayor tiempo menor capacidad de detección para ambas pruebas en especial  a  37 ^oC, 60 ^oC  y enterrado (Tabla 3). También es evidente que el tipo de soporte influye en la prueba.

 

En una escena de crimen  suele existir  contaminación de las evidencias o manchas de sangre. Por lo que se procedió a realizar un estudio con diferentes contaminantes (restos de frutas, restos de verduras, líquidos biológicos y otros contaminantes), estos resultados se encuentran en  la tabla 4. Estos resultados indican que a mayor tiempo (1mes) de exposición al contaminante menor es la sensibilidad de ambas pruebas (aminofenazona y aminoantipirina), esto posiblemente al deterioro de las muestras en estudio. Con la mayoria de los contaminantes hasta la semana se observa con ambas pruebas resultados positivos a 37ºC y 4ºC, la excepción se da con el alcohol yodado  que casi en todas las condiciones dio negativo esto sin duda se debe a que el hierro (Fe⁺³) del hemo es quelado como yoduro ferrico, evitando la reacción. También se debe tomar en cuenta que en algunos casos el contenido intrínseco de antioxidantes como la presencia de vitamina C (ácido ascórbico)  puede interferir   en la reacción  consumiendo el oxigeno liberado por el peroxido de hidrogeno  e impidiendo que este sea captado por la aminofenazona  o la aminoantipirina y no se observa  el cambio de coloración  dando lugar a falsos negativos.⁷

Tabla  4 :  test  de  aminofenazona y aminoantipirina sobre  muestras  preparadas con sangre y contaminantes expuestas a diferentes tiempos y condiciones

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

(+)  Positivo a las 24 Hrs                     (-)   Negativo a las 24 Hrs                    (m) Positivo tenue

(+*) Positivo a la semana                     (-*)  Negativo a la semana

(+º) Positivo al mes                               (-º)  Negativo al mes             

SECCION EXPERIMENTAL

Materiales y métodos

Fundamento teórico

La hemoglobina  es una metaloproteina cuyo grupo prostético es el grupo Hem actúa como una peroxidasa gracias al Ion ferrico (Fe⁺³) que cataliza reacciones de descomposición del peróxido de hidrógeno  en agua y oxigeno, este oxigeno actúa como oxidante de un sustrato  que es la  aminofenazona o la aminoantipirina  (Figura Nº 1) promoviendo la formación de color.⁴  

 Procesamiento de las muestras

Manchas  de sangre

a) Se recolectó muestra  de sangre  por venopunción  en tubo vacutainer (Linea VACUETTE) con EDTA  al  5% de paciente que refería grupo sanguíneo    “O “  factor  Rh  (+)   

 b)       Se  realizó  manchas con aproximadamente 50 ml  de sangre  sobre los diferentes soportes que son :tela de algodón, lana de algodón, seda, poliéster, lino, Jean delgado y Jean grueso, textil artesanal 

c)       Las manchas de sangre  en los soportes  se sometieron  a condiciones  :

§         Ambientales:   Se expone abierto (al aire libre), cerrado (bajo sombra)  y enterrado.

§         Temperatura   : Se expone  a   -20°, 4°,17º, 37° y 60° C. en diferentes equipos.

d)       Tiempo  fue  de   24 horas, una semana y un mes.

Manchas de sangre con interferentes

a)       Con el fin de evaluar la interferencia de sustancias que puedan generar resultados falsos positivos en la técnica  se hicieron manchas sobre las prendas de  tela de algodón. con:

§         Frutas: Mora , fresa, uva roja, naranja ,plátano  y papaya

§         Vegetales: Rábano, espinaca, acelga, apio, zanahoria, tomate, zapallo, remolacha y pimentón.

§         Otras sustancias: Vino tinto, salsa de tomate, café, gelatina, alcohol yodado, coca cola.

§         Fluidos biológicos: liquido ascítico, liquido biliar, saliva y orina.

b)       Para realizar las manchas  se tomó 1 parte de muestra de sangre con una parte de interferente  y se hicieron manchas  con  50  ml   de la mezcla.

c)       Estas manchas se sometieron a: Calor   (37 ^oC); Frío   ( 4 ^oC ); Ambiente  abierto al aire  y enterrado.

d)       El tiempo al cual fueron  expuestas fue de: 24 horas, 1 semana  y  1  mes respectivamente.

 Manchas   de  sangre   lavadas

a)       Se  realizaron 10 manchas de sangre de aproximadamente 1 cm. sobre tela  sintetica  de 20  cm  de largo por  4 de ancho  .

b)       Estas manchas  fueron lavadas con :

§         Agua únicamente

§         Agua  y  jabón

§         Agua  con detergente en polvo  (ACE)

§         Agua   con aceite

§         Agua con lavandina.

c)       Se  lavaron a mano y en cada lavado se procedió a  cortar  dos pedazos   de tela  de 0.5 por 0.5  cm del sitio donde se observo  la mancha.

Prueba   de  sensibilidad

a)       Se recolecto muestra  de sangre  con EDTA  al  5% por venopunción de 4 pacientes que referían grupo sanguíneo    A, B, AB y O.

b)       Se realizó hemoclasificación  de los grupos sanguíneos   del sistema  ABO ( A , B, AB y O )  por el método de  aglutinación  utilizando sueros anti-A , anti-B   y  anti D. (PLASMATEC LAB).

c)       Se realizaron diluciones seriadas  base 10  con solución fisiológica al 0.85% a partir de  1/10   hasta    1/1.000.000 e cada uno de los grupos.

d)       De estas diluciones  se hicieron manchas por triplicado sobre : Algodón, Gasa  y  Papel  filtro

 Pre-tratamiento de las muestras y detección

En  tubos de ensayo  se colocó un fragmento de la mancha  de 0,5 x 0,5 cm  de cada experimento se agregó 1 ml de solución salina al 0.85%. Después de 30  minutos  a temperatura del  laboratorio o 24 horas en refrigerador hasta que las manchas sean extraídas del soporte. ⁵

a)       La reacción se llevo a cabo en soporte de vidrio de  12 concavidades para muestras pre-tratadas. y directamente sobre  la muestra en el soporte de  tela, algodón, gasa y papel filtro  sobre una base de vidrio. 

b)       Las cantidades  que se utilizaron de muestras y reactivos fueron: Una suspensión de la mancha  a  examinar  ( 50 ul), solución de aminofenazona o aminoantipirina  ( 50 ul), solución acidificante de acido  acético glacial  ( 20 ul) y un volumen de perhidrol  (50 ul ) en el orden respectivo.

c)       En ambos métodos se observo un cambio de coloración: roja  con la aminoantipirina y violeta con la aminofenazona en las muestras positivas. Reportando como positivo (+) o negativo (-) directamente.

CONCLUSIONES

En el presente trabajo se determino que el método presuntivo o de orientación  basado en el sustrato aminofenazona, es mas sensible en  la detección de manchas de sangre  con fines forenses, independientemente de los grupos  sanguíneos A, B, AB y O. Se detectó  presencia  de sangre  en manchas secas sobre soportes absorbentes hasta un mes de exposición en ambientes cerrados a temperaturas inferiores a  4^oC. Si las manchas han sido expuestas a temperaturas altas, ambientes húmedos  o enterrados y abiertos la antigüedad de la mancha  se ve afectada en su detección  por ambos métodos  de orientación. Se demostró  que tanto la aminofenazona como la aminoantipirina tienen una capacidad de detectar   muestras  mínimas  casi invisibles cuando fueron sometidas a lavados. Se observó que  los tests de aminofenazona y aminoantipirina en  presencia de vegetales  verdes y frutas cítricas en las muestras pueden interferir en su detección. Los métodos de orientación en base a aminofenazona y aminoantipirina resultan adecuados y economicos en su implementación con fines forenses.

 RECONOCIMIENTOS

Se agradece la colaboración del Instituto de Investigaciones Forenses por el impulso a la realización de este trabajo, a la Dra. Patricia Mercado  Flores de Inmunoserologia perteneciente al Laboratorio Central del  Hospital de Clínicas Universitario por su apoyo en las pruebas que se realizaron.

REFERENCIAS

1. Gaensslen  R; Lee C. “Forensic Science An Introduccion to Criminalistics  De Forest   P.R”, New York: McGraw –Hill, 1983, 632-643.        [ Links ]

2. Bonnet E. “Medicina Legal” .2 ed Buenos Aires: López Libreros Editores. 1978.        [ Links ]

3. Sheehan F. X.; Kobilinsky, L. “Identificación de Sangre Humana” J. Of Chemical Education, 61, 1994, 1,2.        [ Links ]

Perutz M. F.; Luzzatto, L.; Notaro, R. “Structure and mechanism of haemoglobin” Br Med Bull, 32, 1976, 9195-208.

4. Negre, M. A.; Castelló, P. P.; Gil, F. A.; Verdú P. “Manchas de Sangre-: Seguridad en pruebas de orientación” Cuadernos de Med. (México) 2003, 34, 29-34.

5. Cox, M. “Effect of Fabric Washing on the Presumptive Identification of Bloodstains” J. of For Cs 1990, 35, 81-99. 

6. Patricia, M. C. “Manual de Química Forense”. 1ª Edic. Buenos Aires, Argentina. Ed. La Roca, 2004