Introducción

Para mejorar la genética y el desempeño bioproductivo y económico de la alpaca (Vicugna pacos), se emplean las biotecnologías reproductivas, que incluyen entre otras, la colección, evaluación, conservación del semen y la inseminación artificial (IA)¹.

Los métodos de colección de semen no deben afectar la libido de los machos, ni desencadenar reflejos inhibitorios que disminuyan su aceptación, además, afecten la colecta y la cantidad de eyaculados por machos. Permitan la obtención del máximo volumen de eyaculado, con absoluta pureza del material seminal².

Los diluyentes influyen en la calidad y fertilidad de los espermatozoides de alpaca durante la congelación y la post-descongelación, debido a que contribuyen en mantener la presión osmótica isotónica, proporcionan nutrientes para la vida de las células espermática y suministran lipoproteínas o lecitinas que protejan los espermatozoides del choque frío³.

En Ecuador son escasos y poco concluyentes los estudios sobre los métodos de colección de semen en alpacas, por lo que se requieren de investigaciones que permitan desarrollar una técnica confiable para colectar semen que beneficien la libido y el rendimiento de los machos durante la colecta.

Además, es escasa la información científica disponible sobre los diluyentes y protocolos de congelación que se utilizan en el procesamiento y conservación del semen de alpacas en Ecuador⁴, por lo que se necesitan estudios científicos sobre estos aspectos, que contribuyan a definir una metodología eficaz, para la optimización del proceso de conservación del semen en esta especie y de esta manera, desarrollar la IA y otras técnicas reproductivas.

El objetivo de este experimento fue evaluar 3 métodos de recolección del semen de V. pacos y los parámetros seminales utilizando diluyente Triladyl^®.

Materiales y métodos

El presente trabajo de investigación se realizó entre el 25 de abril y el 9 de julio de 2023, en las instalaciones del Centro Experimental Académico Salache (CEASA) y el Laboratorio de Biotecnología de la Reproducción (LBR) de la carrera de Medicina Veterinaria de Universidad Técnica de Cotopaxi (UTC), ubicadas en la parroquia Eloy Alfaro, a 7.7 km de la ciudad de Latacunga, provincia de Cotopaxi, Ecuador.

El escenario de investigación geográficamente ese ubica entre los 16º 31’ 28” de latitud sur (LS) y 68º 20’ 39” de longitud oeste (LW), a los 3990 m.s.n.m. con temperatura promedio de 12° C, precipitaciones promedio anuales entre 500 y 1500 mm y un suelo arcilloso⁵.

Se seleccionaron 9 alpacas machos (V. pacos), proporcionados por la UTC y las comunidades de Macas Chico y Apahua, 3 por cada una, pertenecientes a la provincia de Cotopaxi. Todos los animales eran de la raza Huacaya, con una edad comprendida entre los 3 y 7 años, con 65±3.5 kg de peso, clínicamente sanos y sin problemas reproductivos y defectos congénitos.

Su alimentación era a base de pastos naturales y agua ad libitum.

Se evaluó el efecto de los métodos de colección de semen con maniquí completo, vagina artificial (VA) y uso de orina (A), maniquí de grupa, VA y hembra receptiva (B), y desviación de pene con VA y hembra receptiva (C) sobre la libido, la aceptación del método, el número de montas y la cantidad de eyaculados. Se estudió el efecto de la inclusión del diluyente Triladyl® en el protocolo de congelación, en las características del semen fresco y pos descongelación.

La edad de los animales se evaluó mediante la inspección de su dentadura aplicando la técnica de boqueo^6,7. Los órganos reproductivos (Figura 1) se evaluaron por los procedimientos descritos por Incahuanaco et al.⁷.

Figura 1 Evaluación de aparato reproductor del macho 

Entrenamiento de la alpaca macho para la monta. Se seleccionaron los machos y se mantuvieron durante 10 días en un corral dividido en 2 secciones (Figura 2). En una sección se tenía a los machos y en la otra a la hembra receptiva, se facilitó el contacto visual entre los animales de ambos sexos.

Los entrenamientos de las alpacas machos para los 3 métodos se realizaron durante 3 semanas en las instalaciones del CEASA, 3 veces por semana, en días alternos, 2 h por la mañana y 2 por la tarde.

Procedimientos para la monta. El reconocimiento del macho hacia los maniquís o la hembra receptiva, la monta y colección de semen se realizaron cada 48 h, 3 veces en una semana para cada método, la primera sesión de monta diaria se realizó entre las 6:00 y las 8:00 de la mañana y la segunda, 12 h después de la primera.

Figura 2 Separación de las alpacas hembras y machos 

Previo al inicio del método A (Figura 3A), se colocó este fluido corporal para que se impregne el olor (feromonas) por 48 h. Para el método B (Figura 3B) se requirió entrenar a la hembra con el mismo protocolo descrito para los machos, para que su manejo sea lo menos estresante. Ambos métodos se ejecutaron según los procedimientos descritos por Delgado et al.⁸. Para el método C (Figura 3C) se colocó a la hembra en posición esternal y al macho en posición de copula, se verifico que el pene se encuentre dentro de la VA.

Colección de semen. El semen se colectó con la VA, según la metodología descrita por Sumar⁹. Se utilizó una VA que consta de un tubo de caucho de 21 cm de largo por 4 cm de diámetro, al que internamente se le adaptó una camisa de látex. Externamente se cubrió con una frazadilla eléctrica para mantener una temperatura de 40° C durante la colecta.

Los eyaculados se recolectaron en tubos falcón (50 mL), protegidos por una funda externa que mantuvo una temperatura de 37° C y se transportaron hasta al LBR del CEASA en menos de 1 h desde su recogida. No se procesaron las muestras contaminadas con orina.

Figura 3 Métodos utilizados para la colección del semen. A: Maniquí completo más vagina artificial y uso de orina. B: Maniquí de grupa, vagina artificial y hembra receptiva. C: Desviación de pene con vagina artificial y hembra receptiva 

Determinación de los parámetros seminales. El volumen del eyaculado se determinó por observación directa utilizando una probeta graduada. La concentración seminal se determinó mediante la cámara de Neubauer y la motilidad mediante un microscopio DM4B (Leica Microsystems AG, EE. UU), a 10X. Ambos parámetros se determinaron según los procedimientos descritos por Allauca et al.¹⁰.

La vitalidad espermática se determinó por tinción eosina-nigrosina, los espermatozoides muertos no toman colorante y aparecen rosados, en cambio, los vivos aparecen traslúcidos¹¹.

La morfología espermática se evaluó mediante la observación de la tinción semen-eosina en un microscopio electrónico de barrido y el número de espermatozoides morfológicamente normales y anormales de acuerdo a las recomendaciones de Pérez et al.¹².

Diluyente utilizado. El estudio se realizó con el diluyente Triladyl® CSS One-step (Minitube International A.G., Alemania), que está basado en TRIS (Hidroxi-metil aminometano, un amortiguador sintético, además, contiene ácido cítrico, azúcares, sustancias buffer, agua ultrapurificada y antibióticos (Tilosina, Gentamicina, Espectinomicina, Lincomicina). Este diluyente utilizó el glicerol como además el crio protector^13,14.

Preparación del diluyente. Se preparó el diluyente según recomendación del fabricante y se mantuvo en baño de agua a 37° C. Se adiciono 3 partes de agua destilada estéril (60 %), una parte de yema de huevo a baño maría (20 %) y una parte del concentrado comercial Triladyl^® (20 %), seguidamente se centrifugó a 500 rpm.

Dilución de semen. En tubos falcón se midió el eyaculado y se mantuvo temperado en baño maría a 37º C. La dilución se realizó en una relación 1:1 de semen y de diluyente.

Congelación de semen con diluyente. Una vez mezclado el diluyente y el semen se enfrío a 5° C con una velocidad de enfriamiento de 0.4° C/min, y se mantuvo a esa temperatura por 2 h, los espermatozoides estuvieron en contacto con el glicerol. Cumplido este tiempo se envasaron las pajuelas, las que se colocaron horizontalmente en una gradilla a una distancia de 4 cm por encima de la superficie del nitrógeno líquido, dentro de una caja de poliestireno o couler.

Las pajuelas se pusieron a vapores de nitrógeno líquido a -100° C durante 20 min, y posteriormente se depositaron directamente en nitrógeno líquido a -196° C. Seguidamente se depositó en el tanque criogénico.

Post descongelación del semen con diluyente. Una vez congelada la muestra se retiró la pajilla del tanque criogénico y se puso en baño maría a una temperatura de 37° C para su posterior uso en la evaluación espermática.

Procesamiento estadístico. Se obtuvieron los estadígrafos descriptivos de cada variable cuantitativa. Entre los métodos A, B y C se compararon la libido y aceptación del método mediante una comparación múltiple de proporciones, el número de montas por hora con la prueba de Duncan¹⁵ y la cantidad de eyaculados con una prueba de χ² _{C de Yates}. La concentración de espermatozoides en el eyaculado, y la motilidad, mortalidad y morfo-anomalías, entre el semen fresco sin diluyente y el post descongelado, con diluyente, mediante la prueba de t-Student para muestras pareadas. En todos los procesamientos se utilizó el paquete estadístico Statgraphics Centurión Ver. XVII¹⁶.

Resultados

En la Tabla 1 se puede apreciar que el 22.22 % de los machos tuvieron libido alto en cuando fueron expuestos al método A y lo aceptaron, lo que ocurrió en el 33.33 % de ellos frente los procedimientos B y C.

Con el método C los machos realizaron mayor cantidad (P< 0.05) de montas por hora con los procedimientos A y B (Tabla 1). Con el C se obtuvieron 3 eyaculados, lo que difirió (P< 0.05) con el A y el B, con los que no se colectaron eyaculados (Tabla 1). El volumen de los eyaculados obtenidos fue 1.30±0.20 mL, con un coeficiente de variación de 15.38 %.

La concentración y la motilidad disminuyeron (P< 0.05), mientras que la mortalidad y el por ciento de espermatozoides con formas anormales aumentaron (P< 0.05) después de la descongelación del semen (Tabla 2).

Los tipos de anomalías espermáticas no difirieron estadísticamente entre el semen fresco y post descongelación, no obstante, numéricamente, en este último se redujo el porciento de gametos masculinos con colas curvas y cabezas libres, y se aumentó el de nemaspermos con colas dobles, con cabezas dobles y con la presencia de gota citoplasmática (Tabla 3).

Discusión

La mayor aceptación de los métodos B y C, en los que los machos tuvieron una libido sexual superior, sugieren ser más viables y aceptados, que se debe al empleo de la hembra receptiva, que ayudó a incrementar la libido de los machos⁸.

La obtención de semen con VA y desviación del pene tiene la ventaja que se colecta la totalidad del eyaculado, sin que se contamine con orina o agentes etiológicos que estén en la vagina de la hembra, sin la necesidad de equipos costosos y personal altamente especializados⁸. Su principal desventaja, es la necesidad de varios días de entrenamiento de los machos⁶.

El orden de la aceptación de los métodos en esta investigación es similar al obtenido en llamas. Sin embargo, en esta especie los porcentajes de aceptación fueron 80 y 90 % en los procedimientos B y C, respectivamente⁸. La causa de estas diferencias puede estar motivada por las diferencias en el temperamento y fisiología reproductiva de cada especie⁷.

No se obtuvieron eyaculados con los métodos A y B, con los cuales, los machos no se acoplaron correctamente y no se adaptaron al maniquí, debido a que A tiene forma cuadrada y sus esquinas lastimaban el abdomen del macho, y en el B la grupa tuvo mucha movilidad. Además, la alpaca tiene persistencia de las adherencias del glande al prepucio en algunos animales, que imposibilitan la extrusión del pene¹⁷. También contribuyó que solo el 60 % de los machos respondieron bien al entrenamiento con el maniquí, dado la naturaleza nerviosa de la especie¹⁸.

La obtención de eyaculados se asoció con el método de colección de semen utilizado (χ² _{C de Yates} = 4.0548, P=.0440). La mayor cantidad de eyaculados con el método C se debió al empleo de la combinación de la VA con la hembra receptiva¹⁹. Estos autores señalaron que el empleo de VA y una hembra receptiva junto al maniquí, incrementó el tiempo de cópula de 15.9 a 16.8 min y la calidad del eyaculado obtenido con respecto al uso del maniquí solo.

El volumen de los eyaculados en este experimento es inferior al publicado en alpacas de la Raza Huacaya, de 3 a 5 años de edad, que osciló entre 1.48 a 1.91 mL²⁰ y que, en alpacas de esa raza, en las que se realizó la extracción seminal cada 48 h⁴.

La causa de la variabilidad del volumen en este experimento y la falta de correspondencia con los trabajos publicados se debe a que sobre este parámetro influyen la raza, edad, alimentación, separación psicosexual y la frecuencia de colección^21,22. Sin embargo, existe consenso en que este último factor es la causa de variación más importante del volumen del eyaculado en alpacas²³

Además, las alpacas tienen bajo volumen en el eyaculado²⁴, que presenta variabilidad entre individuos y entre colecciones en un mismo macho²⁰. La evaluación de este parámetro se dificulta por la presencia de espuma que se forma durante la colecta del semen²¹.

La disminución de la concentración del semen post descongelado se debe a la adición del diluyente Triladyl^®. Este y el protocolo de congelación utilizado pudieron aumentar el porcentaje de mortalidad de los espermatozoides post descongelación en este experimento y, por tanto, no cumplen eficientemente la función de preservar la supervivencia espermática posterior a la descongelación, lo constituye su criterio de evaluación principal²⁵.

El aumento de la mortalidad en el semen post descongelación puede deberse a los daños celulares que sufren los espermatozoides, provocados por los cambios de temperatura durante el proceso de congelación, principalmente la deshidratación de las células espermáticas y la formación de cristales de hielo intracelulares durante este proceso²⁶.

La disminución de la motilidad después de la descongelación del semen corrobora que aproximadamente el 50 % de espermatozoides pierden su motilidad durante la congelación y descongelación, lo que constituye un reto en el proceso de crio preservación de espermatozoides²⁵.

El porcentaje de morfo-anomalías en el semen fresco son inferiores a los trabajos publicados por otros autores^23,27, pero las del semen post congelación son similares a las que publicaron los investigadores mencionados. Las formas anormales en los gametos masculinos previo a la dilución podrían deberse al método de colección del semen, que causa variación de la morfometría espermática²⁷.

El aumento de las formas anormales en el semen post congelación, respecto a las del semen fresco puede deberse al efecto de los componentes del diluyente Triladyl^® y la congelación. También a la preparación de la muestra, método de fijación, técnica de tinción, sistema microscópico y errores sugestivos en su determinación²⁸. Estos factores pueden afectar la repetitividad del análisis, su reproducibilidad y la comparación de los resultados entre laboratorios²⁹. No obstante, se requieren estudios más precisos y concluyentes sobre el efecto de la congelación en las morfo-anomalías espermáticas de las alpacas.

La concentración espermática, la motilidad y la mortalidad de los espermatozoides, y sus morfo-anomalías son menores que los obtenidos en alpacas de Perú³⁰. Los resultados de este experimento confirman que las características físicas y biológicas del semen de alpacas también varían según las condiciones de colección, entre ellas, el método de colecta^31,32.

Se concluye que el método de desviación de pene con VA y hembra receptiva tuvo más aceptación, con los machos, realizaron mayor cantidad de montas por hora y se obtuvieron más eyaculados, por lo que es el más óptimo para la colección del semen. Con el empleo del diluyente Triladyl®en el protocolo de congelación disminuyeron la concentración y motilidad seminal, mientras que, aumentaron la mortalidad y las morfo anomalías espermáticas posterior a la descongelación.