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El cáncer que es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en el mundo, se produce por una multiplicación descontrolada de células anormales que al crecer y expandirse puede interferir con el funcionamiento normal de ciertos organos y asi generar distintas enfermedades. El origen de las células cancerígenas puede darse en células germinales (hereditario) o en células somáticas, lo cual la hace dependiende del genotipo de cada persona y su exposición a diferentes condiciones ambientales1,2. A nivel mundial la tasa de muertes por cáncer comparada con la población en general es de 1 en 906 individuos para mujeres y cerca de 1 en 731 en hombres, alcanzando en 2020 a las 9,7 millones de muertes a nivel mundial3. Países en vías del desarrollo como Bolivia todavía tiene un gran número de casos no reportados y aún menos tratados, en especial por los altos costos de la quimioterapia. En Bolivia el cáncer de cuello uterino es el tipo de cáncer más frecuente (22 %) y con mayor mortalidad de mujeres (1 138 muertes/año), seguido del cáncer de mama (17%). En varones, el cáncer de próstata es el tipo de cáncer más frecuente (25%) y el cáncer de pulmón ocupa el segundo lugar (10%)4.
La gran heterogeneidad de las células cancerígenas, implica una gran diversidad de rutas tanto metabólicas como celulares, razón por la cual un único tratamiento no es posible para tratar los distintos tipos de cáncer. Por ello, la investigación en éste campo sigue proponiendo nuevas moléculas candidatas como potenciales tratamientos anticancerígenos. Debido a esta necesidad, un grupo de expertos en cáncer, realizó una prueba masiva donde se estudió aproximadamente 16 000 compuestos para probar su actividad anticancerígena contra células madre de cáncer5. De todos estos compuestos, el que tuvo mejor actividad anticancerígena fue el anticoccidial patentado para uso en agricultura animal, llamado salinomicina5. Este anticoccidial tuvo mejor rendimiento que quimioterapias tradicionales, demostrando además eliminar selectivamente células cancerígenas y no así células normales. Ésta actividad anticancerígena luego se comprobó en diferentes líneas celulares como leucemia6, osteosarcoma7, colangiocarcinoma, hepatocarcinomas8, cáncer gástrico9, cáncer de mama y cáncer de colon10. También se ha observado efectos positivos in vivo en ratones7 y no se han reportado efectos secundarios graves. Si bien estos estudios demostraron que la salinomicina no afectaba células normales, se debe mencionar que se reportó una ligera neurotoxicidad en células Schwann y ratones11.
El mecanismo de acción de la salinomicina aún no ha sido dilucidado por completo. Algunos mecanismos que se han descrito son que la salinomicina induce muerte celular dependiente de mitocondrias o de caspasa12, aumenta el daño al ADN13, activa vías de muerte celular no convencionales como la ferroptosis14, e inhibe la vía de señalización de Wnt15. Se ha observado que induce a la muerte celular tanto mediante apoptosis como por vías independientes de apoptosis8,16. Se ha observado también que produce autofagia10 y que resulta ser un inhibidor de la glicoproteína P, que es un transportador activo de toxinas17, de todas maneras buenos artículo de revisión han sido recientemente publicados18,19.
El objetivo de este trabajo es analizar la actividad antiproliferativa de salinomicina en su versión pura asi como su versión comercial, en líneas celulares de cáncer cervicouterino (HeLa), cáncer de mama (MCF-7) y cáncer de pulmón (A549), además de una evaluación preliminar de la asimilación del compuesto por las diferentes líneas celulares.
Materiales y Métodos
El tipo de estudio corresponde a un estudio experimental in vitro con enfoque analítico.
Materiales y Reactivos
Salinomicina grado ultrapuro (Sigma-Aldrich, MO, USA) fue disuelta en Metanol grado HPLC (Sigma-Aldrich, MO, USA). SACOX (Huvepharma, Sofia, Bulgaria) (i.a. Salinomicina 12%) grado comercial fue disuelta en Agua Mili-Q. Vainillina grado analítico [40 g/L] fue disuelta en metanol y acidificada con 20 ml/L de H2SO4 [96%]. Medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con L-glutamina (R8758), Penicilina-Streptomicina (P4333), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT), Buffer salino de Fosfato (PBS), DMSO, Tripsina-EDTA y suero bovino fetal (FBS) fueron obtenidos de Sigma-Aldrich.
Condiciones de Cultivo celular y Líneas celulares
Las líneas A549 (células de cáncer de pulmón) y HeLa (células de cáncer cervicouterino) fueron cultivadas en medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con L-glutamina [580 mg/L], Suero Fetal Bovino [10%] y Penicilina-Streptomicina [1%]. La línea MCF-7 (células de cáncer de mama) fue cultivada en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor [10%], aminoácidos esenciales [1 mM], insulina [10 μg/ml] y Penicilina-Streptomicina [1%].
Para el manteniminento del cultivo celular, las células fueron tripsinizadas, contadas en un hemocitómetro, centrifugadas y resuspendidas en medio de cultivo celular fresco. Para la línea MCF-7, alícuotas de 180 μl de suspensión celular conteniendo 3 300 células fueron sembradas en placas de 96 pozos. Para las líneas A549 y HeLa, alícuotas de 100 pl de suspensión celular conteniendo 10 000 células fueron sembradas en placas de 96 pozos. Todas las líneas celulares se incubaron en cajas de cultivo de 50 cm2 a 37°C en incubadora con 95% aire y 5% CO2.
Ensayos de viabilidad celular
Las líneas celulares con medio de cultivo fresco fueron incubadas por 24 horas antes de la adición de los compuestos evaluados (salinomicina ultrapura y comercial). Para medir el efecto antiproliferativo de los extractos se llevó a cabo el ensayo de MTT20, Brevemente, a las 48 y 72 hrs de tratamiento, 20 μl de MTT (solución 5 mg/ml en PBS) se adicionaron a cada pocillo y se incubo nuevamente a 37 °C. El formazan fue disuelto con 100 pl de DMSO [100%]. Las placas fueron agitadas por 10 min a temperatura ambiente para disolver el precipitado. La absorbancia fue medida a 540mn en un espectrofotómetro de placas (Cytation 3, Biotek, VT, USA). A partir de los resultados obtenidos se calculó la viabilidad celular, teniendo en cuenta que se obtiene a partir de la absorbancia media de cada tratamiento entre la absorbancia media del control. Salinomicina en ambas formulaciones fue evaluada en cuatro concentraciones 20 μM, 10 μM, 5 μM y 2,5 μM, usándose como control negativo al diluyente (agua, Metanol o DMSO según corresponda) y como control positivo cisplatino. Cada ensayo fue realizado mínimamente con 6 réplicas.
Morfología celular apoptótica
Luego de la exposición de las células a las distintas concentraciones de cada tipo de salinomicina descrita previamente, se procedió a extraer 50 pl de cultivo celular y se las colocaron en un portaobjetos, se realizó un frotis para obtener una proporción relativamente homogénea de células a lo largo del porta objetos. Todas las líneas fueron teñidas mediante tinción panóptica (May-Grunwald Giemsa) para la posterior observación de las características morfológicas. 100 células fueron analizadas para morfología normal o apoptótica por tratamiento. Para el análisis estadístico se utilizó un ANOVA, en la cual se obtuvieron valores de significancia al comparar 100 células por cada tratamiento con el control negativo.
Detección y cuantificación espectofotométrica de salinomicina y construcción de las curvas estándar
La detección cuantitativa de salinomicina se llevó a cabo en el Instituto de Investigaciones Químicas de la Universidad Mayor de San Andrés (UMSA). La cuantificación fue realizada mediante el método espectrofotometrico de la Vainillina, modificado de Blanchflower, Rice (21). Para esto se produjo una solución de vainillina donde la vainillina [40 g/L] fue disuelta en Metanol y acidificada con 20 ml/L de H2SO4 [96%]. La solución de vainilllina fue preparada fresca cada día y se mezclaba con la salinomicina en una relación 1:1 (usualmente 500 uL), la mezcla se calentó a 70° C en un tubo de microcentrifuga por 5 minutos en un thermoheater y posteriormente se enfrió por 10 min en un baño de hielo. Finalmente, se realizó la lectura a 520 nm en un espectrofotómetro de placas. Todas las lecturas fueron realizadas por triplicado.
Cuantificación espectofotométrica de salinomicina en cultivos celulares
La detección de salinomicina en presencia de líneas celulares se realizó en placas de 96 wells, donde solo se evaluaron las líneas celulares A549 y HeLa expuestas a diferentes concentraciones de salinomicina [2,5, 10 y 20 uM]. Se incubó por 72 horas y se removió el medio de cultivo mediante centrifugación a 13 000 rpm por 4 min y se procedió a trasvasar el sobrenadante en un tubo nuevo.
Para la cuantificación de salinomicina en medio de cultivo, primeramente, se adicionó buffer clorhidrico-clorhidrato en un mismo volumen al medio de cultivo analizado, seguido de la adición de vainillina. Segundo, debido a que la sensibilidad del método se redujo con la presencia del medio de cultivo, se procedió a adicionar un estándar interno de salinomicina [27uM] al medio de cultivo después de su incubación con las líneas celulares. Luego se procedió a realizar las reacciones descritas arriba para la cuantificación de salinomicina mediante la reacción con vainillina. Todas las lecturas fueron realizadas por triplicado.
Determinación de la asimilación de salinomicina por las diferentes líneas celulares estudiadas
La cuantificación de salinomicina fue llevada a cabo con los pasos indicados en la fase anterior, sólo modificando el tiempo de cultivo de salinomicina con las líneas celulares despues de la adición, esta incubación fue por 72 horas a 37°C. Se procedió a determinar la cantidad de salinomicina restante o degradada para poder determinar el porcentaje de asimilación de cada línea celular. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.
Pruebas estadísticas
El efecto de las diferentes concentraciones de salinomicina se evaluó mediante un ANOVA de un factor. La prueba post hoc HSD de Tukey identificó diferencias entre las diferentes concentraciones y los controles. Los análisis se realizaron en R versión 4,4 (R Core Team, 2023) y RStudio 2024 (Posit Software, PBC). Las imágenes se generaron utilizando los paquetes plyr, forcats, multcomp, cowplot y ggplot222.
Resultados
Las células de cáncer cervicouterino HeLa, A549 (cáncer de pulmón de células no pequeñas) y MCF-7 (células de cáncer de mama) han crecido favorablemente durante un monitoreo de 96 horas en las condiciones de nuestro laboratorio a 3600 msnm (Fig. Supl. 1 y 2).
Evaluación de la actividad anticancerígena de salinomicina comercial
Salinomicina, tanto en su versión ultrapura como en su versión comercial tuvieron una actividad antiproliferativa significativa en las todas las líneas celulares probadas despues de 48h (Fig. Supl. 3) y 72h de exposición (Figura 1). Las 4 concentraciones analizadas tuvieron una actividad antiproliferativa estadisticamente significativa a las 72h de exposición, excepto en la concentración 5uM en la línea MCF-7 (Figura 1). La actividad antiproliferativa de la salinomicina a las 48h (Fig. Supl. 3) y a las 72h (Figura 1) tuvo resultados bastante similares. De esta manera, se pudo observar que la actividad antiproliferativa de la salinomicina versión comercial y ultrapura en las líneas celulares A549 y HeLa fue bastante similar (Figura 1). La actividad antiproliferativa de salinomicina comercial en la línea MCF-7 de cáncer de mama (Figura 1F) fue menor a la actividad de la versión ultrapura (Figura 1E).
Figura 1. Actividad antiproliferativa de la salinomicina ultrapura y comercial a las 72 horas de exposición en diferentes líneas celulares: Línea A549 (n=24) (A, B), línea HeLa (n=9-18) (C, D) y línea MCF-7 (n=5-6) (E, F). Los datos indican la media +/- error estándar. Los asteriscos representan p <0,05 en relación al control. Fuente: Propia
Evaluación de la actividad apoptótica de salinomicina comercial
En adición a los ensayos de antiproliferación, se buscó confirmar la muerte celular por apoptosis para lo cual se analizó la morfología de las células tratadas con salinomicina ultrapura y comercial a las 48h (Fig. Supl. 4) y 72h de incubación (Figura 2). Se observó una mayor capacidad apoptótica en la salinomicina ultrapura que la versión comercial en la línea HeLa (Figuras 2A y B). En la línea A549 no se observó diferencia significativa en la mayoria de las concentraciones probadas. Finalmente, en las líneas MCF-7 se observa una mayor actividad apoptótica en la versión ultrapura que la comercial (Figuras 2C y D).
Cuantificación espectofotométrica de salinomicina en cultivos celulares y construcción de las curvas estándar
La cuantificación de salinomicina en medio de cultivo RPMI-1640 suplementado mediante espectrofotometría fue exitosa, obteniéndose una correlación líneal de R=0, 97 y un promedio de desviación estándar de las absorbancias leídas de 6,5% (Fig. Supl. 5). A partir de esta curva estándar se pudo cuantificar salinomicina para determinar la asimilación durante el cultivo.
Determinación de la asimilación de salinomicina por las diferentes líneas celulares estudiadas.
La cuantificación de salinomicina en cultivo celular por 72 horas solo se pudo evaluar en la línea A549 (Tabla 1). La línea HeLa y la línea MCF-7 generaron muchos metabolitos secundarios que interfirieron con la detección espectrofotometrica de la salinomicina por lo que no se pudo obtener una curva estándar confiable. De todas maneras, se puede observar una degradación lenta de la salinomicina para la línea celular evaluada (Tabla 1).
Discusiones
Las células de cáncer cervicouterino HeLa (cáncer de cuello uterino) crecieron sin dificultades a 3 600 msnm como se habia descrito previamente a nivel del mar23. Las líneas MCF-7 y A549 tambien crecieron sin dificultades. La línea A549 creció con un comportamiento similar al antes descrito24.
La actividad antiproliferativa de salinomicina sobre la línea HeLa tuvo un comportamiento similar al observado previamente a nivel del mar15. Concordante con estos resultados la actividad de salinomicina sobre la línea A549 fue bastante similar a la reportada previamente y otras 3 líneas de cáncer de pulmón25. Aunque la actividad de salinomicina ultrapura fue bastante similar a la observada en estudios a nivel del mar en líneas MCF-710. Es probable que la menor actividad de la versión comercial se deba a la estructura de la línea MCF-7, ya que se ha observado que la salinomicina es altamente lipofílica, lo que hace difícil su penetración en ciertos tejidos26.
Tabla 1. Degradación de salinomicina en cultivos celulares. Concentración de salinomicina detectada en el medio de cultivo después de 72 hrs. de incubacion con la línea celular A549. La concentración detectada está expresada en la media + error estándar. Fuente: Propia
Figura Suplementaria 1. Curva de crecimiento de la línea A549, a 24, 48, 72 y 96 horas. Los datos indican la media +/- error estándar. Fuente: Propia
Figura Suplementaria 2. Curva de crecimiento de la línea MCF 7 a 24, 48, 72 y 96 horas. Los datos indican la media +/- error estándar. Fuente: Propia
Figura Suplementaria 3. Actividad antiproliferativa de la salinomicina ultrapura y comercial a las 48 horas de exposición en diferentes líneas celulares: Línea A549 (n= 18-24)(A, B), línea HeLa (n= 11-18) (C, D) y línea MCF-7 (n= 5-6) (E, F). Los datos indican la media +/- error estándar. Los asteriscos representan p <0,05 en relación al control. ND: No hay suficientes datos. Fuente: Propia
Figura Suplementaria 4. Actividad apoptótica de la salinomicina ultrapura y comercial en la línea A549 (A), línea HeLa (B, C) y la línea MCF-7 (D, E) a las 48 horas de exposición. Los datos indican la media S error estándar. Los asteriscos representan p <0,05 en relación al control. Fuente: Propia
Figura Suplementaria 5. Curva estándar de detección de Salinomicina en medio RPMI-1640 por espectrofotometría UV con el método de la Vainillina modificado. Los datos indican la media +/- error estándar. Fuente: Propia
La hipoxia mejora la actividad anticancerígena en general27 y se ha observado que tambien mejor la actividad de salinomicina28. Es muy probable que el efecto antiproliferativo en condiciones hipóxicas in vivo que observamos, sea mayor que en estudios in vitro dadas las condiciones de altitud e hipoxia del lugar donde se hicieron las pruebas (3 600 msnm; 14% O2 vs 21% O2 a nivel del mar). Sin embargo, esto se deberia analizar en pruebas en paralelo con las mismas lineas celulares y mismas concentraciones de salinomicina.
Al evaluar el tipo de muerte celular inducida, se observó una mayor capacidad apoptótica en la salinomicina ultrapura que la versión comercial en la línea HeLa (Figuras 2A y B). En la línea A549 no se observó diferencia significativa en la actividad apoptótica inducida por salinomicina comercial en de la mayoria de las concentraciones probadas (2,5, 5 y 20 uM) lo cual es sorpresivo debido a que la actividad antiproliferativa por la Salinomicina Comercial es marcada y estadísticamente significativa (Figuras 2E y F). De todas maneras, se ha observado que salinomicina induce mecanismos de muerte celular alternativos a la apoptosis, como por ejemplo la ferroptosis14, que es muy probable el tipo de muerte celular que estamos observando. Finalmente, en las líneas MCF-7 se observó una marcada mayor actividad apoptótica en la versión ultrapura que la comercial (Figuras 2C y D), ésta actividad apoptótica (75%) es mayor a la reportada (35%) en otros estudios a nivel del mar29.
La cuantificación de salinomicina en cultivo celular no se pudo realizar en las lineas Hela y MCF-7 probablemente debido a la interferencia de metabolitos generados por las líneas celulares. Esto coincide con trabajos previos donde ya se ha reportado26 una baja asimilación y penetración en células cancerígenas. Actualmente se estan formulando conjugados químicos para mejorar el ingreso de salinomicina a los tumores más complicados de tratar30.
Las pruebas realizadas en este estudio junto a las pruebas in vitro de otros estudios7,14,28, han demostrado una actividad prometedora de la salinomicina para detener el crecimiento de celulas cancerígenas. Debido a que la versión comercial de salinomicina tambien tiene una actividad antiproliferativa comprobada, se recomienda proceder a hacer ensayos in vivo y/o pruebas in vitro específicas para evaluar parámetros de toxicidad. Sugerimos que dichas pruebas se enfoquen en los efectos secundarios de salinomicina, sobretodo en procesos neuronales como el aprendizaje, la memoria y el comportamiento para luego proceder a la fase de pruebas clínicas.
Conclusiones
La salinomicina en su versión comercial, que está disponible en el mercado nacional y actualmente tiene aprobación para uso veterinario, tiene una buena actividad antiproliferativa contra las líneas celulares de cáncer de Mama (MCF-7), cáncer cervicouterino (HeLa) y cáncer de pulmón (A549). Esta actividad es similar a la actividad del compuesto ultrapuro y al reportado por otros artículos previamente publicados. Al mismo tiempo, se ha generado pautas importantes sobre la farmacocinética de la degradación de la salinomicina en nuestras líneas celulares, donde se observa una baja asimilación del compuesto por parte de las células A549. De todas maneras, se sugiere proceder a la evaluación in vivo de la versión comercial probada en este estudio.
