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Las caries dentales se convirtieron en un problema muy común1, pudiendo éstas llegar a severas complicaciones en caso de no ser tratadas a tiempo; debido a, la propia microbiota bucodental que desmineraliza la superficie dental originando grietas y desgaste de corona formando así las caries dentales, cuyos responsables principales para las mismas son: Streptococcus mutans (S. mutans), Staphylococcus aureus (S. aureus) entre otras que se encargan de causar el daño a la dentadura2. Según la OMS, la mayoría de la población a nivel mundial sufre de caries dentales3, por lo que se formuló el enjuague bucal como refuerzo de la higiene bucodental para reducir la cantidad de las bacterias responsables de las enfermedades orales4.
Con el presente trabajo de investigación se pretende beneficiar a las personas que padecen de caries dentales y placa bacteriana excesiva, dándoles a conocer una alternativa de tratamiento de bajo precio, fácil aplicación y de forma natural, ya que las hojas de té verde (Camellia sinensis) con galato de epigalato catequina y catequina epigalato, pétalos de rosa (Rosa sp.) con ácido gálico y pulpa de fruta camu-camu (Myrciaria dubia) con ácido elágico que son taninos y flavonoides que contribuyen significativamente en la eliminación de la placa bacteriana sobre los dientes provocadas por la bacteria Streptococcus mutans principalmente, que pueden dañar a los mismos, reduciendo el riesgo de caries dentales6,7,8. La hipótesis de este estudio indica: “El enjuague bucal terapéutico tiene actividad antibacteriana similar a los extractos de los cuales se formuló”.
Por todo lo mencionado el objetivo de este estudio fue: “Evaluar la actividad antibacteriana in vitro de un enjuague bucal terapéutico elaborado con extractos de hojas de té de verde, pétalos de rosas y pulpa de camu-camu” y los objetivos específicos son:
Identificar mediante pre-tamizaje fitoquímico los metabolitos secundarios existentes en los extractos de hojas de té verde, pétalos de rosas y pulpa de camu-camu.
Realizar el control de calidad a los extractos y al enjuague bucal terapéutico.
Determinar la sensibilidad y la concentración mínima inhibitoria (CIM) de extractos, enjuague bucal y una muestra comercial.
Comparar y validar los resultados obtenidos mediante técnicas estadísticas.
Material y métodos
Estudio observacional, tipo experimental, prospectivo, transversal con enfoque cuali-cuantitativo.
Las muestras fueron evaluadas en el laboratorio “CEFAC” dependiente del Inst. de Investigación de la Facultad de Cs. Farmacéuticas y Bioquímicas de la UMSS.
Las variables estudiadas fueron: Extractos de té verde, pétalos de rosa, pulpa de camu-camu; enjuague bucal natural, enjuague bucal Foramen (Clorhexidina al 0,12 %), características organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas; sensibilidad bacteriana, CMI.
Recolección del material vegetal: la materia vegetal (1 kg hojas de té verde, 1 kg flores de rosa roja y 1 kg fruto camu-camu) fue recolectada en fecha abril 2022 en la provincia José Carrasco del departamento de Cochabamba, Bolivia.
Preparación de los extractos: todos los extractos fueron preparados a una concentración del 10 % mediante la siguiente metodología9:
a) Lavado y desinfección de materia vegetal: Se realizó con abundante agua para eliminar la suciedad incorporada en la materia prima, seguido de desinfección con solución de hipoclorito de sodio a 80 ppm.
b) Secado: se desecaron las hojas de té verde y pétalos de rosa en la máquina de secado de circulación forzada de aire de marca “MMM Medcenter” serie venticell a la temperatura de 40°C por 24 horas, el camu-camu no fue desecado.
c) Molienda y almacenamiento: las hojas de té verde, pétalos secos de rosa y pulpa de camu-camu fueron triturados en mortero de porcelana, el almacenamiento de las hojas y pétalos secos se realizó en frascos de vidrio.
d) Obtención del extracto: Se preparó el extracto acuoso de té verde por decocción, el extracto acuoso de camu-camu por maceración acuosa y el extracto hidroalcohólico de rosas fue preparado mediante maceración; fueron rotaevaporados en rotavapor de marca Heidolphsu a 45°C a 200 rpm y 40 mbar eliminando las % partes del disolvente, seguido de la filtrar los 3 extractos en papel filtro y embudo para ser conservados en frascos ambarados a una temperatura que osciló entre 2°C a 8°C.
Marcha fitoquímica: Se identificaron los metabolitos secundarios presentes en la materia vegetal siguiendo la metodología propuesta por Olga Lock10.
Elaboración del enjuague bucal: para la elaboración del mismo se basó en la fórmula elaborada en la “UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESIANA SEDE QUITO” por la autora Ing. Teresa Veloz Vera11.
Control de calidad de los extractos y del enjuague:
a) Control organoléptico de extractos y enjuague: color, olor, sabor y aspecto, según la Norma Ecuatoriana y la Norma Cubana NRSP 30912.
b) Control fisicoquímico de extractos y enjuague: Evaluando el pH y la densidad según la Norma Ecuatoriana y la Norma Internacional ISO 1640812,13.
c) Control microbiológico de los extractos: Evaluando presencia de: Mesófilos aerobios totales, E. coli NMP/g, Recuento de mohos UFC/g y Salmonella en 25 g según la NB-315018:201514.
d) Control microbiológico del enjuague: Mesófilos aerobios totales, P. aeruginosa en 1g o 1ml, S. aureus en 1g o 1ml y E. coli según el Reglamento Andino, para Preparaciones para higiene bucal15.
Determinación de la actividad antibacteriana: Se aplicó el método “Kirby-Bauer modificado difusión en pozo” para implantar las bacterias y medir así los halos de inhibición formados, posteriormente se realizó la interpretación de estos determinando la sensibilidad de S. aureus y S. mutans frente a extractos y al enjuague bucal mediante la “Escala de sensibilidad de Duraffourd”16.
Concentración Mínima Inhibitoria (CIM): Se realizó diluciones de los extractos y del enjuague bucal al 15% para obtener concentraciones al 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml, 3,125 mg/ml, 1,56 mg/ml y 0,78 mg/ml, tomando de los mismos 1 ml para diluir en agar Mueller Hinton hasta un volumen final de 20 ml, seguido de realizar la siembra de 1 ml de los inóculos de S. aureus y S. mutans por extensión en superficie incubando las placas de forma invertida a 35±2°C por 24 h17.
Análisis estadístico: se realizó análisis siguiendo la técnica de Shapiro-Wilk y Kruskal Wallis.
Resultados
Respecto a los objetivos planteados los resultados obtenidos son:
En la marcha fitoquímica preliminar se identificaron taninos y flavonoides indispensables para el estudio (Tabla 1).
Tabla 1. Metabolitos secundarios presentes en los extractos en estudio
Nota: (-) negativo, Baja concentración (+), moderada concentración (++), alta concentración (+++)
Fuente: Elaboración propia, según base de datos (2022).
Fórmula del enjuague bucal natural ( Tabla 2).
Tabla 2. Fórmula cuali-cuantitativa del enjuague bucal
Nota: Se sustituyó el extracto de la fórmula en la que se basó este estudio por tres extractos (2022).
Fuente: Universidad Politécnica Salesiana Sede Quito (12) (2021).
Las características organolépticas del enjuague bucal natural obtenidas son: color rojo, sabor dulce, olor mentolado, aspecto opalescente; respecto al control fisicoquímico la densidad es 0,8867 g/ml y pH 7,13. Al realizar el control de calidad se hallaron resultados satisfactorios cumpliendo con todos los requerimientos exigidos por las diferentes normas en las cuales se basó este estudio (Tabla 3).
Tabla 3. Parámetros fisicoquímicos evaluados
Fuente: Elaboración propia, según base de datos (2022).
Tabla 4. Concentración inhibitoria mínima (CIM)
Nota: (mg/ml) concentración de extractos, enjuague bucal con extractos y foramen (control positivo) que se le agrego al agar Mueller Hinton, para inhibir el crecimiento bacteriano, (-) sin crecimiento bacteriano y (+) con crecimiento bacteriano.
Fuente: Elaboración propia, según base de datos (2022).
El control microbiológico tanto de extractos vegetales como del enjuague bucal natural reportó “ausencia” de bacterias patógenas.
Según la escala de Duraffourd S. mutans resultó “sumamente sensible” frente al extracto de camu-camu (20,8 mm) y té verde (20,4 mm); “muy sensible” al extracto de rosa (19,2 mm), enjuague bucal (19,4 mm) y control + (19,9 mm) (ver Figura 1).
De acuerdo a la escala de Duraffourd S. aureus resultó “muy sensible” frente a todas las muestras en estudio, cuyos halos de inhibición fueron: té verde (16,8 mm), rosa roja (18,9 mm), camu-camu (19,8 mm), enjuague bucal natural (18, 5 mm) y control (+) (18,8 mm). (Figura 1).
La CMI del enjuague bucal natural fue 1,56 mg/ml frente a S. aureus y S. mutans (Tabla 3).
Los resultados de la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk en los grupos analizados reportaron un p< 0,05 (p valor halos de inhibición frente al S. aureus 0,000015, frente al S. mutans 0,000004: una CIM frente al S. aureus 0,000002 y frente al S. mutans una CIM de 8,28 E-7) presentando una distribución No normal. La comparación de medias entre los grupos analizados de la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis reportó p< 0,05 entre las medias en los halos de inhibición entre el enjuague bucal y el foramen y sin diferencia significativa entre las medias de los halos de inhibición y las CIM entre los grupos con valores de p>0,005.
Discusión
Los autores Camere et al.6, Saldarriaga E.7 y Barreiro8 argumentan en sus estudios que, en los extractos de té verde, rosas rojas y camu-camu se identificaron taninos y flavonoides en alta concentración, siendo resultados similares a los obtenidos.
Discusión cc de fisc
Ruiz et al.18, menciona que los halos de inhibición del extracto de pulpa de camu-camu frente a S. mutans fueron entre 14-15 mm contrarios a las mediciones obtenidas en esta investigación, notándose una diferencia entre ambos estudios.
Bareiro et al.8, obtuvo en su estudio halos de inhibición frente a S. aureus formados por el extracto de té y pétalos de rosas de 15-16 mm, observándose una DIFERENCIA con los resultados plasmados en este estudio
Respecto a la CMI del extracto de camu-camu se obtuvieron resultados SIMILARES con el estudio de Pardo et al.19, frente a S. mutans y S. aureus.
Según Acosta et al.20, los halos de inhibición de Camellia sinensis frente a S. mutans fueron de 10-11 mm, lo que indica que hay una DIFERENCIA con los resultados obtenidos en esta investigación.
En cuanto a la formulación del enjuague bucal natural hubo DIFERENCIA con el estudio de Padilla21, porque en este estudio (se empleó menor porcentaje de conservantes y mayor cantidad de extractos vegetales.
Existe una DIFERENCIA con el estudio de Bermudez22 ya que en este estudio se empleó la mitad de concentración de extracto vegetal y no se obvió el añadido de conservante).
Conclusiones
Se identificó la presencia de taninos y flavonoides principalmente, siendo óptimos para este estudio. Asimismo, se realizaron los controles de calidad requeridos tanto de extractos como de la forma farmacéutica elaborada, obteniendo parámetros óptimos garantizando la calidad sanitaria de la forma farmacéutica. Se determinó la sensibilidad de las bacterias comparando con la escala de sensibilidad de Duraffourd y la CMI frente a S. mutans y S. aureus concluyendo que tanto los extractos naturales en estudio, como el enjuague natural tienen una actividad antibacteriana comparable a la del enjuague bucal comercial “foramen” y se analizaron los resultados mediante la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y fueron validados mediante la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis, concluyendo que existe una diferencia significativa de las medias de las CIM entre los extractos, el enjuague bucal terapéutico y control positivo “foramen” con respecto al control negativo frente S. aureus y a S. mutans.
